在冷冻和融化流程后于约_150°C或更低的温度保存。
[0039] 所述肿瘤裂解物可从任何实体肿瘤制备，包括但不限于癌和肉瘤。在一些实施方 案中，所述实体肿瘤来自与乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、 神经母细胞瘤、肾母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、前列腺癌和眼黑 色素瘤相关的肿瘤。
[0040] 多个免疫应答增强剂可作为佐剂添加至肿瘤裂解缓冲液来加强免疫应答，从而使 得当肿瘤裂解物与树突状细胞共同孵育时，所述佐剂展示对树突状细胞作用增强同时显著 降低任何来自这种佐剂的全身作用。
[0041] 选择一种或多种用于本发明的合适的佐剂在本领域的技术人员的已知范围内。举 例来说，单磷酰脂质A、GpC寡核苷酸、Poly I :C、Poly ICLC、有效的MHC II表位肽，以及树 突状细胞刺激细胞因子如IL-12、IL-2和GM-CSF都是用于本发明的良好的佐剂候选。
[0042]
[0043] 本文描述的"微粒"指任何在其中能包含肿瘤裂解物且也使得裂解物能够离开该 结构的中空和多孔结构。在一些实施方案中，微粒的大小约0.5至约5 μπι，其大致为细菌的 大小以使得微粒可被单核细胞如树突状细胞摄取。在特定的实施方案中，所述微粒的大小 为约0. 5至约1 μ m。在特定的实施方案中，所述微粒的大小为约0. 5至约2. 5 μ m。在一些 实施方案中，所述微粒可以是具有葡聚糖网络的任何微粒，只要所述微粒在大小上为约〇. 5 至约5 μ m。
[0044] 在一些实施方案中，所述微粒是珠载体。所述珠载体不受形状或材料的限制，而可 以是任何使得珠载体被单核细胞包括树突状细胞吞噬的形状、大小或材料。
[0045] 在另一实施方案中，所述微粒是酵母细胞壁微粒（"YCWP"）。所述YCWP由酵母 细胞壁制备从而使得所述微粒是多孔的并能在其中包含裂解物。在一个实施方案中，所述 YCWP由酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)制备。在另一实施方案中，所述YCWP是酵 母聚糖微粒。在另一实施方案中，所述YCWP大约是单核吞噬细胞系统的细胞和其他吞噬细 胞通常摄取的微生物结构的大小。在特定的实施方案中，所述YCWP为约1-5 μπι。
[0046] 在一个实施方案中，所述YCWP通过下列步骤进行制备：(a)悬浮酵母来产生悬浮 液，（b)孵育所述悬浮液，（c)离心所述悬浮液并去除上清以及⑷回收获得的YCWP。在另 一实施方案中，步骤（a)-(d)重复至少1、2、3或4次。
[0047] 在另一实施方案中，所述YCWP通过下列步骤进行制备：(a)在溶液中悬浮酵母来 产生第一悬浮液，（b)孵育所述第一悬浮液，（c)离心所述第一悬浮液并去除上清，（d)悬浮 所得沉淀来产生第二悬浮液，（e)孵育所述第二悬浮液，（f)离心所述第二悬浮液并去除上 清以及（g)洗涤所得沉淀来回收所述YCWP。在另一实施方案中，对所述YCWP进行灭菌。
[0048] 在特定的实施方案中，所述酵母在NaOH包括IM NaOH中悬浮。在特定的实施方案 中，所述第一悬浮液在约80°C孵育约1小时或1小时。在特定的实施方案中，所述离心在约 2000倍重力实施约10分钟，或在2000倍重力实施10分钟。在特定的实施方案中，所述沉 淀在水包括pH为约4. 5或pH为4. 5的水中悬浮。在特定的实施方案中，所述第二悬浮液 在约55°C孵育约1小时或在55°C孵育1小时。在特定的实施方案中，将所述沉淀在水中洗 涤至少1、2、3或4次。在特定的实施方案中，将所述沉淀洗涤一次。
[0049] 在另一实施方案中，所述YCWP使用异丙醇和/或丙酮进行灭菌随后洗涤沉淀。在 特定的实施方案中，其他已知的醇类是合适的。在特定的实施方案中，所述YCWP在灭菌后 可完全干燥。在另一实施方案中，所述YCWP在干燥后进行重悬。在特定的实施方案中，所 述YCWP在PBS如IXPBS中重悬。在另一实施方案中，使所述YCWP干燥且随后在肿瘤裂解 物装载入YCWP中之前冷冻，从而在使用前将其放置保存。在特定的实施方案中，冻干所述 YCWP并在约4°C或更低保存。在特定的实施方案中，冻干所述YCWP并在4°C保存。
[0050] 装裁了肿瘤裂解物的微粒
[0051] 用肿瘤裂解物装载微粒。在一个实施方案中，通过将所述裂解物与微粒悬浮液共 同孵育并使得所述裂解物穿入所述微粒的空心内部来将所述肿瘤裂解物装载入所述微粒。
[0052] 在另一实施方案中，用肿瘤裂解物装载所述微粒后，冻干该组合来在所述微粒内 产生无水肿瘤裂解物。通过冻干所述用肿瘤裂解物装载的微粒，所述裂解物被捕获在所述 微粒内并准备就绪以被单核细胞如树突状细胞吞噬。在特定的实施方案中，所述冻干是仅 有的用于将所述裂解物捕获在所述微粒内的机制。在特定的实施方案中，所述捕获并非是 由分离的组分阻断所述裂解物离开所述微粒引起的，举例来说，是通过物理捕获、疏水结 合、任何其他结合引起的。在特定的实施方案中，所述捕获并非是由交联或以其它的方式将 裂解物附着于冻干时可能发生的任何附着物外的微粒上引起的。
[0053] 在另一实施方案中，所述微粒在冻干后于溶液中重悬。在特定的实施方案中，所述 溶液是水。在特定的实施方案中，重悬所述微粒来使得额外的肿瘤裂解物穿透所述微粒并 随后再次冻干该组合。在其它实施方案中，所述组合承受多次冻干和重悬。在其它实施方 案中，所述装载了肿瘤裂解物的微粒在冻干后使用前于乙醇中灭菌。
[0054] 在特定的实施方案中，通过如下将所述肿瘤裂解物装载入所述微粒：(a)孵育所 述裂解物和所述微粒的悬浮液，使得所述裂解物穿入所述微粒的空心内部并冻干装载了所 述裂解物的微粒的悬浮液以及（b)任选地重悬所述微粒，孵育重悬的微粒并冻干重悬的微 粒和任何尚未在微粒内的肿瘤裂解物。
[0055] 在使用YCWP的具体实施方案中，YCWP的数目为约IxlO9且肿瘤裂解物的体积为约 50 μ L(从约200 μ g的肿瘤组织生成）。在特定的实施方案中，YCWP的数目是IxlO9且肿瘤 裂解物的体积为50 μ L (来自200 μ g的肿瘤组织）。在特定的实施方案中，步骤（a)中的所 述孵育在约4°C持续约2小时。在特定的实施方案中，步骤（a)中的所述孵育在4°C持续2 小时。在一些实施方案中，前文所述悬浮液在步骤（b)冻干约2小时的时程或2小时的时 程。在一些实施方案中，步骤（c)中的YCWP在水中重悬，包括约50 μ L水或50 μ L水。在 一些实施方案中，重悬的YCWP在步骤（d)于约4°C孵育约2小时或于4°C孵育2小时。
[0056] 树突状细朐
[0057] 本文所述的"树突状细胞"指从外周血单核细胞（"PBMC"）生成的细胞。在一个 实施方案中，树突状细胞通过下列步骤制备：(a)收集血液，（b)稀释所述血液，（c)对PBMC 实施密度梯度分离，（d)裂解红细胞并洗涤所述PBMC，（e)孵育所述PBMC，（f)去除未粘附 的细胞以及（g)在培养基中培养粘附的细胞。
[0058] 在一些实施方案中，所述树突状细胞是培养不超过5天的未成熟的树突状细胞。 在其他实施方案中，所述树突状细胞已培养6-8天。
[0059] 在特定的实施方案中，所述血液是肝素化的。在特定的实施方案中，步骤（c)的密 度梯度分离包括将血液放置在淋巴细胞分离培养基中且随后离心所述血液。在特定的实施 方案中，所述离心在约1000倍重力实施约20分钟或在1000倍重力实施20分钟。在特定 的实施方案中，第二次离心在步骤（d)之前实施且在约500g实施约5分钟或在500g实施5 分钟。在特定的实施方案中，第三次离心在步骤（d)之前实施且在约500g实施约10分钟 或在500g实施10分钟。在特定的实施方案中，所述裂解使用ACK裂解溶液实施，随后进行 孵育，优选地在室温持续约5分钟，且接下来是随后的离心。在特定的实施方案中，将PBMC 在RPMI-1640培养基中洗涤。在特定的实施方案中，所述PBMC在步骤（e)于约37°C在烧瓶 中孵育约1-2小时或在37°C孵育1-2小时。在特定的实施方案中，将无血清DC培养基添加 至烧瓶中。
[0060] 在一些实施方案中，一种或多种细胞因子存在于培养基中，包括，但不限于，粒细 胞巨噬细胞集落刺激因子（800单位/ml)以及IL-4 (500单位/ml)。
[0061] 吞噬在树突状细朐中的装裁了肿瘤裂解物的微粒
[0062] 装载了肿瘤裂解物的微粒被吞噬于单核细胞中，优选地，于树突状细胞中。在一个 实施方案中，所述装载了肿瘤裂解物的微粒与树突状细胞共同孵育从而使得所述细胞吞噬 装载了肿瘤裂解物的微粒。
[0063] 在特定的实施方案中，所述微粒与所述树突状细胞以约100:1的比例或以100:1 的比例孵育。所述孵育可实施约1小时、1小时或优选地少于1小时。
[0064] 在特定的实施方案中，收集包含所述肿瘤裂解物微粒的树突状细胞并洗涤，举例 来说，至少1、2、3或4次。在其他实施方案中，所述树突细胞在洗涤后孵育并在冷冻培养基 中重悬。在特定