的实施方案中，所述重悬浮液产生约IOx IO6细胞/ml或IOx 10 6细胞/ml 的浓度。在特定的实施方案中，所述重悬浮液在使用前冷冻保存。
[0065] 痔苗
[0066] 在一个实施方案中，所述包含装载了肿瘤裂解物的微粒的树突状细胞被用作疫苗 来预防和/或治疗疾病，包括癌症。待治疗的疾病不特别限制，但取决于装载入微粒中的特 定的肿瘤裂解物。举例来说，将使用来自乳腺癌肿瘤的肿瘤裂解物的疫苗用于治疗乳腺癌。 在另一实施方案中，将患者自身的肿瘤细胞用于产生疫苗。举例来说，所述疫苗可使用来自 于乳腺癌相关的肿瘤的肿瘤裂解物生产且随后施用于提取所述肿瘤的乳腺癌患者。在另一 实施方案中，约200 μ L IOxlO6浓度的包含装载了肿瘤裂解物的微粒的树突状细胞形成疫 苗的一个剂量。
[0067] 在另一实施方案中，在将剂量施用于患者前所述剂量通过将200 UL等分试样稀 释至Iml终体积进行施用。在特定的实施方案中，所述等分试样用包含5 %人血清白蛋白的 无菌生理盐水稀释。在特定的实施方案中，稀释前需要将所述200 yL等分试样融化。在这 样的方案中，融化和将所述剂量施用于患者之间的时间长度应不多于2小时。在一些实施 方案中，所述稀释的等分试样在3cc注射器中施用。在一些实施方案中，使用不小于23Ga. 的注射器针头。
[0068] 在另一实施方案中，对患者施用至少1、2、3或4个剂量。在特定的实施方案中，每 四周对患者进行再次接种疫苗。在特定的实施方案中，每次接种施用约1-2百万的包含装 载了肿瘤裂解物的微粒的树突状细胞。在另一实施方案中，所述包含装载了肿瘤裂解物的 微粒的树突状细胞通过注射施用于患者。在特定的实施方案中，所述装载了肿瘤裂解物的 微粒注射入患者位于或接近（1)肿瘤或（2)淋巴结处。
[0069] 在一些实施方案中，疫苗不与任何其他免疫抑制治疗如类固醇或化疗共同施用。 疫苗可使用任何技术包括静脉注射和吸入来施用。
[0070] 疫苗还可包含生物佐剂，包括但不限于核酸如GpC寡核苷酸、蛋白质或肽表位如 破伤风类毒素 MHC II类-结合p30肽。
[0071] 实施例1 :制备树突状细胞
[0072] 树突状细胞从患者的PBMC生成。PBMC通过抽血200ml之后进行标准操作流程自 患者收集。随后将血液转移至250ml离心管并用IX PBS以1:1稀释。随后，35ml稀释的 血液在50ml管中层铺于15ml室温的淋巴细胞分离培养基（LSM ;MediateCh)上并于室温在 1000 g离心20分钟。PBMC层通过从LSM梯度吸取移出并置于干净的50ml离心管中。加入 四体积的IX PBS且随后将离心管倒置来混合内容物。PBMC随后在室温以500g离心5分钟。 将IOml的IX PBS加入至每管且重悬细胞并汇集于1管中。PBMC再次以500g在室温离心 10分钟，在20至40ml的ACK裂解溶液（Cambrex)中重悬且在室温孵育5分钟。所述细胞 在1500rpm再次离心5分钟。PBMC在30ml RPMI-1640培养基（Mediatech)中重悬。随后 将细胞转入2-4个T75烧瓶中。所述烧瓶在37°C孵育1至2小时。未粘附细胞随后通过 漂洗去除。随后，将IOml的IX PBS加入每个烧瓶中，涡旋摇动（swirl)烧瓶，并去除PBS。 随后，将IOml的完全DC培养基（无血清DC培养基+800U/ml GM-CSF+1000U/ml IL-4)添 加至每个烧瓶。烧瓶随后在37°C，5% CO2孵育2天。在第三天，将IOml的完全DC培养基 添加至每个烧瓶中。细胞随后再孵育2天。在第6或7天，获得的未成熟的DC是准备就绪 可供使用的。
[0073] 图1提供了树突状细胞生成的概要。
[0074] 实施例2 :制备肿瘤裂解物
[0075] 肿瘤样品从患者获得。将脂肪和坏死组织与肿瘤组织分开后，对所述组织称重并 加入IX PBS (每200 μ g组织50 μ L PBS)且将所述肿瘤用外科手术刀在IX PBS中彻底切 碎。肿瘤细胞随后经历4轮冷冻和融化。在液氮中实施冷冻20分钟并在室温实施融化。制 备的肿瘤裂解物通过分光光度计定量。取一等分试样用于质量控制测试。其余以配制物保 存在< -135°C用于疫苗的制备。冷冻融化循环后可任选地添加少量的佐剂。
[0076] 图2提供了肿瘤细胞裂解物加工的概要。
[0077] 实施例 3 AljgYCWP
[0078] YCWP从Fleishmans面包酵母或等效物制备。简而言之，IOg Fleishmans面包酵母 在100mL的IM NaOH中悬浮并加热至80°C持续1小时。未溶解的酵母细胞壁通过在2000x g离心10分钟回收。回收的酵母细胞壁随后在用HCl将pH调整至4. 5的100mL水中重悬 并在55°C孵育另外一小时，且随后通过离心回收。回收的YCWP随后用水洗涤一次，异丙醇 洗涤4次且最后用丙酮洗涤两次。一旦YCWP彻底干燥，将其在PBS中重悬，计数，等分成 IXlO9微粒的组并冻干以用于疫苗的制造。
[0079] 图3提供了酵母细胞壁微粒加工的概要
[0080] 实施例 4 AljgYCWP
[0081] 通过以下过程将三克活性干燥酵母（Fleischmann's或等价物）在水中洗绦三次： 将所述酵母在30ml的无菌水中悬浮，祸旋振荡（vortex)，并在室温于800-1000x g离心5 分钟。倾倒上清后，将酵母沉淀在50ml的IM NaOH中重悬并在90°C水浴中加热1小时。
[0082] 酵母悬浮液随后在800-1000x g离心5分钟，且沉淀在25-30mL酸性水中（pH用 HCl调整至4. 5)重悬。重复酸性水洗涤步骤直至悬浮液的pH〈7.0。随后将沉淀在30mL酸 性水中重悬并在75°C水浴中孵育1小时。酵母沉淀通过1000 x g离心5分钟回收，且随后 用IOmL无菌水洗绦3次，IOmL异丙醇洗绦4次且最终IOmL丙酮洗绦两次。将丙酮小心除 去，且将沉淀均匀展开在烧杯的玻璃表面上，使其空气干燥过夜。
[0083] 收集干燥的YWCP并在真空罐中于4°C保存且随后在10_15mL过滤的70%乙醇中 洗涤3次。在最后的洗涤中对YWCP进行短暂超声处理，且若需要重复所述超声处理至将各 团块（clump)分散。一旦去除乙醇，在无菌水中洗涤YWCP。将IOOyl的YWCP等分试样分 散入 2. OmL 圆底折顶离心管（rounded-bottom snap top centrifuge tube)中，置于冰箱 1小时，冻干，并在真空罐中于4°C保存供将来使用。
[0084] 实施例5 :将肿瘤裂解物装载入YCWP
[0085] 将完全无水的YCWP悬浮液（IX IO9)与50 μ L在PBS中的肿瘤裂解物（来自200 μ g 的肿瘤组织）于4°C接触2小时，使得裂解物穿透YCWP的中空内部来产生装载的YCWP。悬 浮液随后冻干2小时。冻干后，将50 μ L水添加至装载的YCWP，再于4°C孵育2小时并再次 冻干来产生干肿瘤裂解物于其中空内部中的YCWP。装载的YCWP随后通过在乙醇中洗涤灭 菌并保持在乙醇中。
[0086] 图4提供了 YCWP装载流程的概要。
[0087] 实施例6 :用肿瘤裂解物装载YCWP
[0088] 患者的肿瘤活检样品与50-100 μ 1的裂解缓冲液（PBS)(取决于肿瘤样品的量） 小心混合，混合过程中避免气泡，且随后在4°C孵育30分钟。混合物在丙酮-干冰浴和37°C 水浴经历冷冻-融化3次，并随后在4°C以最大的速度离心10分钟。将50 μ 1制备的肿瘤 裂解物加入包含IOmg干燥的YCWP的2mL无菌离心管使得液体肿瘤裂解物覆盖YCWP。混合 物在4°C孵育2小时直至液体肿瘤裂解物浸入YCWP。
[0089] 随后将所述管放置于_85°C冰箱30分钟来快速冷冻沉淀。将所述管放置在冻干 机过夜。将50 μ 1无菌水添加至干燥的酵母沉淀上并在4°C孵育2小时来使得液体浸入沉 淀。
[0090] 将所述管放置于-85°c冰箱30分钟来快速冷冻沉淀。将所述管放置在冻干机过 夜。干燥的微粒随后在ImL 70%的乙醇中重悬并在4°C保存供将来使用。
[0091] 实施例8 :制备包含装载了肿瘤裂解物的微粒的树突状细胞
[0092] 离心装载了肿瘤裂解物的YCWP在70%乙醇中的悬浮液。将乙醇小心除去并替换 为ImL PBS。对装载的YWCP进行超声处理。用无菌IX PBS洗涤装载的YCWP。最终洗涤后， 在PBS中重悬装载的YCWP至约IX IO8微粒/100 μ I PBS。
[0093] 以1:100的比例将装载的YCWP添加至树突状细胞培养物中，并将所述培养物放 回37°c孵育箱中。随后，将下列因子添加至培养物：以1:5000的体积比将在无菌水中的 50 μ g/mL的TNF- α添加至培养物（每IOmL培养物2 μ L);以1:1000的体积比将在无菌水 中的10 μ g/mL的IL-I β添加至培养物；以1:1000的体