，可以使用lmg/m2至40mg/m 2体表面积每天的剂量。以药学可接受的盐给 药时，剂量可以游离碱的形式计算得出。在一些实施方式中，组合物每日给药1至4次。可 选择地，本发明的组合物可通过连续静脉输注的方式给药，各种活性成分的剂量优选最高 至1000mg/m 2体表面积每天。如本领域技术人员将理解的那样，在某些情况下，需要以超出 或者远远超出上述优选剂量范围的量施用本文公开的化合物以有效地和积极性地治疗特 别恶性的疾病或感染。在一些实施方式中，化合物将在一段连续治疗的时期内施用，例如一 周或更多，或者几个月或几年。
[0172] 可单独调整给药量和间隔以提供足以维持治疗效果或最低有效浓度（MEC)的活 性部分血浆水平。每种化合物的MEC将变化，但是可根据体外数据估计。获得MEC所需要 的剂量将取决于个体的特性和给药途径。无论如何，HPLC测定法或生物测定法可用于确 定血浆浓度。
[0173] 利用MEC值还可以确定给药间隔。应当使用能维持血浆水平在10-90%时间高于 MEC的方案来施用组合物，通常30-90%，最通常50-90%。
[0174] 对于局部性给药或者选择性吸收，药物的有效局部浓度可与血浆浓度不相关。
[0175] 所施用组合物的量取决于受治疗的受试者、受试者的体重、痛苦的严重程度、给药 方式和处方医师的判断。
[0176] 利用已知方法可以评估本文公开化合物的效能和毒性。例如，特定化合物或者共 享某些化学部分的化合物亚组的毒理学可通过测定对细胞系的体外毒性而确定，例如哺乳 动物细胞系，优选人细胞系。这类研宄的结果经常可以预测对动物的毒性，例如哺乳动物， 或更特别地，人。可选择地，可使用已知方法确定动物模型中特定化合物的毒性，例如小鼠、 大鼠、家兔或猴子。使用几种公认的方法可确定特定化合物的效能，例如体外方法、动物模 型、或人临床试验。几乎每种状况都存在公认的体外模型，包括但不限于癌症、心血管疾病 和各种免疫功能异常。相似地，可接受的动物模型可用于确定用于治疗这些状况的化学物 质的效能。当选择模型来测定效能时，本领域技术人员可以受到本领域状况的引导而选择 适当的模型、剂量、和给药途径、和给药方案。当然，人临床试验也可以用于测定化合物对人 类的效能。
[0177] 如果需要，本发明的组合物可存在于包装或分配装置中，其可包含一种或更多种 包含活性成分的单位剂量。包装可例如包含金属或塑料箔，例如罩泡包装（blister pack)。 包装或分配装置也可附带给药说明书。包装或分配装置也可附带连同容器的告示，该告示 以管理药物制造、使用或销售的政府机构规定的形式，其中告示反应了该机构批准的人用 或兽用药物形式。例如，这样的告示可以是美国食品与药品管理局对处方药批准的标签，或 者是批准的产品说明书（product insert)。还可将包含本发明化合物的组合物制备到相容 的药物载体中，放入适当的容器中，标明所治疗的适应症。
[0178] 在整个说明书当中，特定化合物的任何详细描述应当被理解为包括该化合物和其 任何（其他）药学可接受的盐。
[0179] 在BER的第一步骤中，一连串的糖基化酶识别异常的碱基例如N3 mA和 N7mG(O' Connor 等人，''Isolation and structure of a cDNA expressing a mammalian 3-methyladenine-DNA glycosylase"EMBO J. 9 :3337_3342,1990 ;Samson 等人，"Cloning and characterization of a3-methyladenine DNA glycosylase cDNA from human cells whose gene maps to chromosome 16" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :9127_9131， 1991)、T:G 错配(Neddermann 等人"Functional expression of soluble human interleukin-11 (IL-ll)receptor alpha and stoichiometry of in Vitro IL-llreceptor complexes with gpl30"J. Biol. Chem. 271 :12767-12774,1996)、和脱氨碱基例如次黄 嘌呤/被氧化的8-氧-7,8-二氢鸟嘌呤或尿嘧啶AWollberg等人"Isolation and characterization of the human uracil DNA glycosylase gene"Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86:8693-8697,1989 ;01sen 等人"Molecular cloning of human uracil-DNA glycosylase，a highly conserved DNA repair enzyme"EMB0 J. 8:3121-3125,1989; Radicella 等人 "Cloning and characterization of hOGGl，a human homolog of the OGGlgene of Saccharomyces cerevisiae"Proc. Natl. Acad. Sci. USA94. 8010-8015,1997; Rosenquist 等人"Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase"Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :7429-7434,1997)。N-糖苷键经过酶或者自然 水解和释放异常碱基之后，AP(无嘌呤/无嘧啶）核酸内切酶水解磷酸二酯主链5'导致 损伤，并且dRpase (-种DNA脱氧核糖磷酸二酯酶，其活性与聚合酶0相关）切除残留的 dRp，产生一个核苷酸缺口。DNA聚合酶0填补了缺口，DNA连接酶封住切口。这个途径称 为短补缀BER。BER可替换的途径包括DNA合成以填补2至13个核苷酸的缺口。该长补缀 修复需要增殖细胞核抗原（PCNA)和PCNA-依赖的DNA聚合酶（Wilson "Mammalian base excision repair and DNA polymerase beta"Mutation Res. 407 :203_215,1998)〇
[0180] 多-(ADP-核糖）-聚合（PARP)通过本身或与XRCC1相互作用而充当DNA链 断裂的切口传感器，参与BER。PARP与受损的DNA结合，产生自动核糖基化作用。然 后经修饰的蛋白释放和允许其他蛋白质进入并修复DNA链断裂（Wilson "Mammalian base excision repair and DNA polymerase beta"Mutation Res. 407 :203_215,1998 ; Molinete 等人，"Over production of the poly (ADP-ribose)polymerase DNA-binding domain blocks alkylation-induced DNA repair synthesis in mammalian cells'^EMBO J. 12:2109-2117,1993 ;Caldecott 等人，"XRCCI polypeptide interacts with DNA polymerase and possibly poly (ADP-ribose) polymerase，and DNA ligase III is a novel molecular 'nick-sensor' in vitro"Nucleic Acids Res. 24 :4387_4394,1996) 〇 因此，切口形成之后PARP在短补缀和长补缀修复中参与BER。看起来BER在可替代（长补 缀修复）途径中最有效。图6显示了培美曲塞和MX的联合增加了断裂的PARP形成。DNA 双链断裂和凋亡的增加不依赖Bcl-2途径。
[0181] 通常，下文使用的命名和下面描述的在细胞培养、组织培养、肿瘤生物学和分子 遗传学方面的实验室操作在本领域中是公知和常用的。使用标准技术用于细胞培养方 法、试验设计和化合物制剂及命名。根据制造商的说明书来进行一般的化学反应和纯化 步骤。通常根据本领域的常规方法和各种一般性参考文献来完成这些技术和操作（通 常参见 Sambrook 等人，Molecular Cloning :ALaboratory Manual，2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，N. Y?，和 Current Protocols in Molecular Biology (1996) John Wiley and Sons，Inc.，N.Y.，其通过援引引入本文），这些 技术和方法遍布在该文献当中。那其中包含的所有信息通过援引引入本文。
[0182]培美曲塞（2-[4_[2_ (4_ 氛基 _2_ 氧 _3, 5, 7_ 二氣杂二环[4. 3. 0]壬 _3,8,10-二 烯-9-基）乙基]苯甲酰基]氨基戊二酸）（ALMTA?;Eli Lilly&Co.)是具有下述结构的 抗代谢化学治疗药物：
[0183]
[0184] 培美曲港定Jan贩外_肥_反市u/yr而tw吓ekw脚n 土机市u iiusei卞用的抗叶酸剂抗肿 瘤药。培美曲塞抑制胸核苷酸合成酶（TS)、二氢叶酸还原酶（DHFR)和甘氨酰胺核糖核苷酸 转甲酰酶（GARFT)、参与胸苷和嘌呤核苷酸从头生物合成的酶。培美曲塞被FDA批准用于 治疗非小细胞肺癌和被批准与顺铂（以铂为基础的化疗药物）联合治疗恶性胸膜间皮瘤。 治疗间皮瘤（与顺铂联用）或非小细胞肺癌的推荐剂量是约500mg/m2体表面积每天，作为 静脉输注剂在每个21-天周期的第一天施用超过10分钟。对于和甲氧胺的治疗联用，培 美曲塞代表性的剂量范围通常是200mg/m2至1，000mg/m2体表面积每天，或者500mg/m2至 600mg/m2体表面积每天；甲氧胺代表性的剂量范围是1至200mg/m2体表面积每天，或者6 至120mg/m2体表面积每天。在一个实施方式中，培美曲塞以和如上描述相同的方式施用； 然而，静脉输注可进行超过15分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟或更长时间，并且可 在第1天进行，加上给定周期的一个或更多个额外的天数，给定周期可以是1周、2周、3周、 1月或更长。
[0185] 实施例
[0186] 材料和方法
[0187] 化学物质和试剂。甲氧胺（MX)购自Sigma (ST. Louis，Mo. )。MX溶于无菌水（pH 7.0)中。
[0188] 蛋白质印迹法（Western Blotting)用于探测PARP断裂。150V条件下在Bio-Rad 微型胶装置中用SDS-PAGE(12%聚丙烯酰胺）溶解细胞提取物1小时。在100V条件下使用 Bio-Rad微型转移印迹槽（mini Trans-Blot cell) 1小时，将蛋白质转移到PVDV膜上。用 15TBS缓冲溶液中的5%的奶粉阻断沾上印迹的膜，然后用抗-PARP抗体C2-10 (Trevigen， Gaithersburg，Md.)探测2小时。用TBS-Tween20(0. 05% )洗涤三个5分钟后，用第二种 抗体抗 _ 小鼠 HRP-抗 IgG 培养印迹 1 小时（Amersham Life Science，Arlington Height 111.)。根据制造者的说明书（Amersham Life Science，Arlington Heights，111.)用 ECL 使抗体结合显现。
[0189] 裸小鼠肿瘤。将肿瘤细胞（5xl06)注射到6-8周龄的雌性无胸腺HSD裸小鼠的侧腹 部。动物接受每日5次下列腹膜内注射：盐水、单独的培美曲塞（150mg/kg)、单独的MX(4mg/ 1^)，或者培美曲塞与1乂比例为26.7:1.0的培美曲塞（15〇11^/1^)和1?(41^/1^)联合。以 测径器测量肿瘤，使用 National Cancer Institute 公式：V = L (mm) xl2 (mm)/2,其中 L 是 肿瘤的最大直径，I是肿瘤的最小直径。当肿瘤的体积达到约100_150mm3时，荷瘤小鼠被随 机指定用于对照组或治疗组（6-9只小鼠/组）。
[0190]实施例1
[0191] 图8显示在人NCI-H460NSCLC细胞系模型、A549NSCLC细胞系模型、HCT116结肠癌 细胞系模型和MDA-MB-468乳腺癌细胞系模型中，所有接受甲氧胺（MX) +培美曲塞的组比单 独接受培美曲塞的组表现出更强的肿瘤生长延迟。MX逆转了 NCI-H460NSCLC细胞系和HCT 116结肠癌细胞系对培美曲塞化学治疗效果的耐药性。
[0192]实施例2
[0193] 为了测定培美曲塞+甲氧胺（MX)相对于单独培美曲塞对产生AP位点数量的影 响，使用醛反应性探针（ARP)试剂来测定由培美曲塞形成的和由MX阻断的AP位点。ARP和 MX对AP位点具有相似的反应性，它们尤其与醛基反应，醛基是AP位点的一种开环形式。这 样的测定发描述于 Liu 等人，（Molecular Cancer Therapeutics 2:1061-1066, 2003)中， 并基本根据Nakamura等人，（Cancer Res. 58 :222-225,1998)的描述进行操作。用培美曲塞 (0、100、200或400 ym)处理H460细胞24小时。然后从细胞中提取DNA(15yg)，并在37°C 下用ImM ARP培养10分钟。用乙醇沉淀和洗涤DNA，然后重悬于TE缓冲液（10mM Tris-HCl， pH 7. 2, ImM EDTA)中，在100°C下使之变性5分钟。然后迅速在冰上冷冻DNA，并与等量的 醋酸铵（2M)混合。然后使用真空过滤装置在硝酸纤维素膜上固定单链DNA。室温下用抗生 蛋白链菌素-结合的辣根过氧化物酶培养该膜30分钟，用洗涤缓冲液（20mM Tris-HCl，ImM EDTA，0. 26M NaCl，1% Tween-20)漂洗。用 ECL 试剂（Amersham，Piscataway，NJ)使 ARP-AP 位点显现。结果显示在4A中。100、200和400 yM剂量的培美曲塞诱导AP位点的形成，AP 位点诱导作用程度与培美曲塞剂量成比例（图4A)。在培美曲塞中加入MX与单独培美曲塞 相比显著地减少了可探测AP位点的数量。在24小时、48小时和72小时观察200 yM培美 曲塞和6mM MX的联合效果。结果显示在图4B中。随着时间的过去，单独培美曲塞组和培 美曲塞与MX联合组都减少了可探测的AP位点的数量。
[0194] 概括来说，培美曲塞诱导AP位点的形成，而培美曲塞和100 yM MX的联合将可探 测AP位点降低到对照水平，这并不是AP位点缺失的原因，而是由于AP位点被MX所占据， 致使它们不能被APR利用。AP位点的占据是时间依赖性的，这表明持续的MX水平对于最大 效果来说是必需的。
[0195]实施例3
[0196] 使用DNA链断裂测定法来测定培美曲塞和甲氧胺（MX)增加由细胞凋亡和DNA链 断裂介导的肿瘤细胞死亡的能力。彗星分析测定法描述在Liu等人（前文）中，其基于在电 场影响下变性的、断裂的DNA片段迀移出细胞的能力。当通电流时，未受损的DNA移动较慢， 并且其保留在细胞核区域范围内。基于对DNA "彗星"拖尾形状和迀移距离的评估来评价 细胞内DNA损伤（Helma等人，，Mutat. Res. 466 :9-15,2000)。在各自暴露于200 yM培美曲 塞、6mM MX或200 yM培美曲塞+6mM MX 4小时之后采集细胞并用PBS洗涤。在42°C下，以 1 : l〇(v/v)比例将H460细胞的混悬液（lX105/ml冷PBS)与1%低胶凝温度琼脂糖混合， 迅速用移液管将75 y 1转移到彗星载玻片（CometSlide) (Trevigen，Inc.，Gaithersburg， MD)上。当放置低胶凝温度琼脂糖之后，在4°C下将载玻片沉入预冷的溶胞缓冲液（lOmM Tris-HCl，pH 10. 5-11. 5,2. 5M NaCl，100mM EDTA，包含使用前加入的 1% Triton X-100)l 小时。溶胞后，用蒸馏水洗涤载玻片，将其纵向排列在电泳槽中，沉入碱性缓冲液（50mM NaOH，pH 12-12. 5, ImM EDTA)30 分钟。然后在 18V(0. 6V/cm)、250mA 的条件下，使载玻片在 碱性（pH> 13,300mM NaOH，lmM EDTA)和中性溶液（1 X TBE)中电泳25分钟。碱性电泳 探测的是从AP位点和其他对碱性不稳定的DNA加合物产生的单链和双链DNA断裂，而中性 电泳主要探测的是双链DNA断裂。取出载玻片，用中和缓冲液（0. 5M Tris-HCl，pH 7. 5)洗 涤10分钟，然后用PBS洗涤，之后将其在室温下过夜风干。根据制造者的说明书利用银染 色试剂盒（Trevigen)将DNA染色。使用Olympus显微镜观察彗星。用数码相机捕获图象 并利用NIH图象软件分析。
[0197] 彗星图象显示在图1A(碱性测定法）和1B(中性测定法）中。用培美曲塞和MX 处理之后，观察不同的彗星，其