一种小豆蔻提取物及其抗肿瘤用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药领域，具体涉及一种小豆蔻提取物及含有该提取物的药物制剂， 该小豆蔻提取物可以用来制备治疗黑色素瘤的药物。
【背景技术】
[0002] 植物小豆蔻为多年生草本。根茎粗壮，棕红色。叶两列，叶片狭长披针状，叶鞘具 棕黄色柔毛。穗状花序由茎基部抽出。花序显著伸长，花排列稀疏，花冠白色。果实长卵圆 形，果皮质韧，不易开裂。种子团分3瓣，每瓣种子5~9枚，种子气味芳香而峻烈。主产越 南、斯里兰卡和印度南部的马拉巴（Malabar)海岸。实成熟时收采，除去残留的果柄，晒干。 使用部分为姜科植物小豆蔻的干燥果实。
[0003] 药材小豆蔻为姜科植物小豆蔻Elettaria cardamomum(L. )Maton的干燥近成熟果 实，是藏医与维吾尔医用药，以"加素"之名始载于《四部医典》，现被多国药典收载。小豆蔻 是世界著名的植物药与香料，被称为"香料之后"，原产于印度南部、斯里兰卡及瓜地马拉等 地，在印度传统医学中使用历史超过两千年，具有祛风、健胃的功效。目前中医很少使用，小 豆蔻曾以"豆蔻"之名收载于1953年版中国药典。
[0004] 小豆蔻已报道的成分主要为挥发油，以及多糖与蛋白质，推测还含有黄酮类化合 物，但目前尚未见黄酮类成分单体的分离与鉴定。挥发油是小豆蔻中重要的活性成分，含量 高达7%，超声提取得到的挥发油以a-乙酸松油脂、桉油精、芳樟醇、a-松油醇、乙酸芳 樟酯为主，与超临界C0 2提取所得成分类似；如以正己烷提取，挥发油组分有所不同，为柠檬 烯、桉油精、萜品油烯、月桂烯。此外，还含有麝香草醇、橙花基醋酸酯、蒎烯、橙花叔醇、香桧 烯等。
[0005] 小豆蔻药理活性多样，尤以抗肿瘤活性报道最多，涉及皮肤、肺、结肠等多个部位 的肿瘤，对胃肠道也有较好的保护作用，此外，还具有抗菌、抗氧化、抗炎、镇痛等作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种小豆蔻提取物，该提取物的制备方法和液相分析方 法，含有该提取物的药物制剂及利用该提取物制备治疗黑色素瘤药物的用途。
[0007] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0008] 一种小豆蔻提取物，该提取物由以下方法制备：
[0009] 步骤一：小豆蔻药材粉碎，水蒸汽蒸透，烘干；
[0010] 步骤二：用75%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味得到浓缩液；
[0011] 步骤三：对步骤二浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得 到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
[0012] 步骤四：正丁醇萃取物用AB-8大孔树脂富集，先用10%乙醇冲洗8个柱体积除去 多糖，再用65%乙醇洗脱6个柱体积，收集65%洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。
[0013] 进一步地，步骤一中蒸制方法为：高压灭菌锅105°C蒸制2小时。
[0014] 为了能够通过建立HPLC指纹图谱的方法控制不同产地、批次药材制备的小豆蔻 提取物批间差异，所述提取物的液相分析方法为：
[0015] 色谱柱：DiamonsilC18 柱（4. 6mmX 250mm，5 y m);
[0016] 流动相：A为乙腈，B为0. 1 %磷酸溶液（三乙胺调节pH值至6. 5);
[0017] 梯度洗脱程序：0? 01 ~70min，A 20% - 80% ;
[0018] 流动相流速：1. OmL ? mirT1;
[0019] 检测波长：240nm ;柱温：30°C ;
[0020] 进样量：10 yL。
[0021] 药物制剂，含有治疗有效量的所述小豆蔻提取物和药学上可接受的载体。
[0022] 所述的小豆蔻提取物在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
[0023] 所述的药物制剂在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
[0024] 本发明提取物用作药物时，可以直接使用，或者以药物制剂的形式使用。
[0025] 所述药物制剂含有治疗有效量的本发明小豆蔻提取物，其余为药物学上可接受 的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0026] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。本发明提取物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
[0027] 本发明的优点：本发明通过对小豆蔻药材蒸制处理，生成更多小极性的化合物，增 强细胞膜通透性，具有抑制黑色素瘤细胞的作用；本发明提供的液相分析方法可以用于建 立该提取物的指纹图谱，用于控制不同产地、批次药材制备的提取物的批间差异。
【附图说明】
[0028] 图1为小豆蔻提取物HPLC液相图谱。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0030] 主要试剂和材料：小豆蔻药材购自安徽毫州中药材市场；食品级乙醇购自上海凌 峰化学试剂有限公司；医药级AB-8大孔树脂购自天津波鸿树脂有限公司；乙腈为HPLC级， 购于TEDIA ;85%磷酸为HPLC级，购于TEDIA ;色谱用纯净水为哇哈哈纯净水。人A375黑色 素瘤细胞株由第三军医大学赠。DMEM培养基、0. 25%胰酶购自美国Gibco公司；MTT(3-(4， 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐；四甲基偶氮唑蓝、DMS0 (二甲基亚砜）、BrdU 购自美国Sigma公司；鼠抗BrdU多克隆抗体购自美国ABcam公司；山羊抗鼠二抗购自美国 Cell signaling公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国Promega公司。
[0031] 恒温C02培养箱，普通冰箱，-80°C冰箱均为美国Forma公司；超净工作台购自 中国苏州净化工程公司；倒置显微镜，倒置荧光显微镜购自Olympus公司；电热恒温培养 箱购自中国上海跃进医疗器械厂；自动酶标仪购自日本Wako公司；紫外分光光度仪购自 美国Beckman公司；J6-HC高速离心机购自美国Beckman公司；低温微量离心机购自德国 Eppendorf公司；振荡摇床购自美国Forma公司。
[0032] 实施例1 :小蓮提取物制备
[0033] 取小豆蔻药材5kg粉碎，用纱布包裹，置于高压灭菌锅中蒸制2小时，温度105°C， 取出置烘干箱中烘干；烘干药材用75%乙醇热回流提取三次，每次提取2小时，每次用75% 乙醇15L，合并提取液，浓缩至无醇味（3L);浓缩液依次用石油醚（3LX3次）、乙酸乙酯 (3LX3次）和水饱和的正丁醇（3LX3次）萃取，分别得到石油H萃取物、乙酸乙酯萃取物 和正丁醇萃取物；正丁醇萃取物用AB-8大孔树脂富集，先用10%乙醇冲洗8个柱体积出去 多糖，再用65%乙醇洗脱6个柱体积，收集65 %洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥（545g)。
[0034] 实施例2 :液相色谱分析
[0035] 供试品溶液配制：取实施例1方法制得的提取物5mg至50mL棕色容量瓶中，加 30mL 20%乙腈水溶液超声溶解，冷却至室温后，继续加20%乙腈水溶液定容。
[0036] 分析方法：
[0037] 高效液相色谱仪：Agilent 1260,二元泵；
[0038] 色谱柱：Diamonsil C18 柱（4. 6mmX 250mm，5ym);
[0039] 流动相：A为乙腈，B为0? 1 %磷酸溶液（三乙胺调节pH值至6. 5);
[0040] 梯度洗脱程序：0? 01 ~70min，A 20% - 80% ;
[0041] 流动相流速：1. OmL ? mirT1;
[0042] 检测波长：240nm ;柱温：30°C ;
[0043] 进样量：10 yL。
[0044] 对用10批不同产地、批次小豆蔻制备的提取物进行分析，建立指纹图谱进行匹 配，结果1~9号峰在10批样品色谱图中均出现。因此标定9个峰为共有指纹峰，据此建 立该提取物的HPLC指纹图谱，结果见图1。
[0045] 实施例3 :小豆蔻提取物药理试验
[0046] -、试验方法
[0047] 1、细胞培养
[0048] 1. 1细胞复苏
[0049] 将冻存在液氮罐中的A375黑色素瘤细胞取出，迅速放入37°C的温水中，轻轻摇动 使其尽快融化（大约lmin)。然后吸出细胞悬液，加入到已加有2mL培养基的离心管中，轻 轻吹打混匀，800r/min，离心5min，弃去上层培养基。用含有10 % FBS和1 %的青霉G/链霉 素的DMEM培养基8mL制成细胞悬液后，接种至10cm培养盘中。然后置于5% C02、37°C恒 温培养箱中进行培养。
[0050] 1. 2细胞传代
[0051] 显微镜下观察细胞融合度达80% -90%时即可进行传代。先用2mLPBS洗涤细胞2 次，然后加入0. 25 %的胰酶lmL。轻轻水平摇动培养盘，使消化液能覆盖细胞的表面，然后 置于37°C温箱中消化约lmin。置于显微镜下见细胞变圆回缩，然后迅速加入lmL含有FBS 的培养基终止消化。轻轻吹打至细胞分散均匀，然后根据细胞密度按照1 : 2或1 : 3传 代，重新接种于新的培养盘，于5% C02、37°C恒温培