养箱中培养。
[0052] 1. 3细胞冻存
[0053] 取1盘处于对数生长期的细胞，胰酶消化并收集到离心管中，1 OOOr/min离心 5min，弃上清。然后加入lmL冻存液，轻轻吹散细胞制成细胞悬液，将细胞悬液加入到1. 5mL 的冻存管中。在冻存管上标明细胞的名称，保存时间，保存者的姓名。先将冻存管放入4°C 冰箱，放置约30min。接着置于-20°C冰箱，放置约2h。然后放于-80°C超低温冰箱中过夜。 第二天将冻存细胞置液氮罐中长期保存。
[0054] 2、细胞计数法绘制细胞生长曲线
[0055] (1)取对数生长期A375黑色素瘤细胞，计数，调整细胞密度为2X 104/mL。
[0056] (2)将细胞悬液接种于12孔板中，1. 5mL/孔。
[0057] (3) 12h后，待细胞贴壁，换lmL无血清DMEM培养基，并分别用5yg/mL小豆蔻提取 物和DMS0 (对于DMS0稀释的小豆蔻提取物控DMS0浓度在1/1000以下，确保对细胞无害） 处理，每组细胞设3个平行孔，置于5% C02、37°C恒温培养箱中进行培养。
[0058] (4)分别于他、2处、4811、7211、9611终止培养，收集各组细胞，加入0.25%胰蛋白酶 消化，离心，重悬。
[0059] (5)细胞计数：吸取细胞混悬液10 yl，加入等体积的台酚蓝区分活细胞，吸取 10 y L混合液轻轻加入细胞计数板凹槽中，保证无空隙和气泡。倒置显微镜下，计数周边四 个大方格内的细胞数，代入公式：原细胞混悬液浓度（细胞数/mL) = (4个大方格的细胞数 /4) X104X稀释倍数。
[0060] (6)计算活细胞数目，绘制细胞生长曲线。
[0061] 3、MTT法检测细胞增殖
[0062] (1)取对数生长期的A375细胞，消化，离心，重悬，计数，调整细胞悬液中细胞的密 度为 2X104/mL。
[0063] (2)将各组细胞悬液接种于96孔培养板中，200 y L每孔，每组细胞3个平行孔，同 时设空白对照孔（只加入培养基）。
[0064] (3)12h待细胞贴壁后，换200yL无血清DMEM培养基，并分别用5yg/mL小豆蔻提 取物和DMS0处理。
[0065] (4)分别于0、1、2、3、4天终止培养。
[0066] (5)每孔加入浓度为5mg/mL的四甲基偶氮唑蓝20 yL继续培养细胞4h。
[0067] (6)吸弃各小孔内的培养基，加入200 y LDMS0,在微振荡器上振荡lOmin，使结晶 物充分溶解。
[0068] (7)以空白对照孔调零，采用自动酶标仪测定各孔570nm处的吸光光度值（0D 值），以对应的0D值表示细胞增殖能力，各组取3个平行孔的平均值，以时间为横轴，以各吸 光度值为纵轴绘制细胞生长曲线。
[0069] 4、BrdU免疫荧光检测细胞增殖
[0070] (1)准备爬片：将爬片放入75%酒精中浸泡24h消毒处理。
[0071] (2)将无菌爬片放置24孔培养板内，取对数生长期的A375黑色素瘤细胞，消化，离 心，制成细胞悬液，2X 104cell/孔，接种于放有爬片的孔中。
[0072] (3) 12h待细胞贴壁后，换lmL无血清DMEM培养基，并分别用5 yg/mL小豆蔻提取 物和DMSO处理。
[0073] (4)72h 后，在培养基中加入 10 y 1 fcdU(lmg/mL)，37°C培养 lh。
[0074] (5)取出24孔板，冷PBS洗5minX2次，4%多聚甲醛固定细胞，室温30min。
[0075] (6) PBS 洗 5min X 3 次。
[0076] (7) 2mol/L HC1 处理，室温 lOmin 后，37°C 20min。
[0077] (8)细胞用 1%TritonX-100 通透处理，洗 5minX3 次。
[0078] (9) 10%山羊血清封闭，室温，lh。
[0079](10)加入&'dU 单克隆抗体（1 : 300 稀释），37°C 1. 5h。
[0080] (11) 1XPBST 摇洗 5minX3 次。
[0081](12)加&'dU 二抗（1 : 300)，室温避光 lh 后，1XPBST 洗 3 次。
[0082] (13)DAPI染色液染细胞核15min。
[0083] (14)PBS 洗 5minX3 次。
[0084] (15)加1滴抗荧光淬灭封片液，中性树胶封片，荧光显微镜观察、照相。
[0085] 5、统计分析
[0086] 应用SPSS 17. 0统计分析软件，采用两独立样本t检验及单因素方差分析进行数 据分析，数据用X±S表示，P < 0. 05为有统计学意义。
[0087] 二、数据分析
[0088] 细胞形态观察及计数显示，与DMS0对照组相比，小豆蔻提取物处理A375细胞24h、 4811、7211后，活细胞数显著降低达44.5%。结果见表1(乍<0.05，*1 3<0.01￥6^118 0150 group)〇
[0089] MTT结果显示，小豆蔻提取物能显著抑制A375细胞增殖，0D值呈浓度（5 y g/mL、 10 y g/mL、20 y g/mL)依赖性下降达27. 3 %，差异有统计学意义。结果见表2 (*P < 0. 05， <0? 01 versus DMSO group) 〇
[0090] 通过BrdU免疫荧光染色进一步证实小豆蔻提取物能抑制黑色素瘤细胞增殖， 5yg/mL小豆蔻提取物处理A375细胞3天后，与对照（26. 07±2. 59% )相比，实验组BrdU 阳性细胞百分比（7. 55 ±2. 76% )显著降低（P = 0? 000)。
[0091] 本实验检测了小豆蔻提取物对黑色素瘤细胞增殖的影响，细胞计数和MTT分析结 果均证明小豆蔻提取物可显著抑制黑色素瘤细胞生长，且细胞数与小豆蔻提取物浓度呈依 赖性下降。BrdU免疫荧光染色也显示小豆蔻提取物处理后BrdU阳性细胞百分比显著低于 对照组，说明小豆蔻提取物可抑制A375黑色素瘤细胞增殖。
[0092] 表1细胞计数法测定小豆蔻提取物对A375黑色素瘤细胞的抑制（X lOVmL)
[0093]
[0094] 表2 MTT法测定小豆蔻提取物对A375黑色素瘤细胞活力的抑制
[0095]
[0096] 实施例4 :片剂的制备
[0097] 按实施例1方法先制得提取物，按其与赋形剂重量比为1 : 8的比例加入赋形剂， 制粒压片。
[0098] 实施例5 : 口服液的制备
[0099] 按实施例1方法先制得提取物，按常规口服液制法制成口服液。
[0100] 实施例6 :胶囊剂或颗粒剂的制备
[0101] 按实施例1方法先制得提取物，按其与赋形剂重量比为1 : 9的比例加入赋形剂， 制成胶囊或颗粒剂。
[0102] 实施例7:注射液的制备
[0103] 按实施例1方法制得提取物，加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
[0104] 实施例8 :无菌粉针的制备
[0105] 按实施例1方法先制得提取物，溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗 过滤，再无菌精滤，分装于安瓿，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
【主权项】
1. 一种小豆蔻提取物，其特征在于所述提取物由以下方法制备： 步骤一：小豆蔻药材粉碎，水蒸汽蒸透，烘干； 步骤二：用75%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味得到浓缩液； 步骤三：对步骤二浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石 油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； 步骤四：正丁醇萃取物用AB-8大孔树脂富集，先用10%乙醇冲洗8个柱体积除去多糖， 再用65%乙醇洗脱6个柱体积，收集65%洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。2. 根据权利要求1所述的提取物，其特征在于步骤一中蒸制方法为：高压灭菌锅105°C 蒸制2小时。3. 根据权利要求1所述的小豆蔻提取物，其特征在于：所述提取物的液相分析方法 为： 色谱柱：Diamonsil C18 柱（4. 6mmX 250mm，5 y m); 流动相：A为乙腈，B为0. 1%磷酸溶液(三乙胺调节pH值至6. 5); 梯度洗脱程序：〇? 〇l~70min，A 20% - 80% ; 流动相流速：1. OmL ? mirT1; 检测波长：240nm ;柱温：30°C ; 进样量：10 yL。4. 药物制剂，其特征在于：所述制剂含有治疗有效量的权利要求1所述的小豆蔻提取 物和药学上可接受的载体。5. 如权利要求1所述的小豆蔻提取物在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。6. 如权利要求4所述的药物制剂在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种小豆蔻提取物及其抗肿瘤用途，属于中药领域，具体涉及一种小豆蔻提取物及含有该提取物的药物制剂，该小豆蔻提取物可以用来制备治疗黑色素瘤的药物。本发明通过对小豆蔻药材蒸制处理，生成更多小极性的化合物，增强细胞膜通透性，具有抑制黑色素瘤细胞的作用。本发明提供的液相分析方法可以用于建立该提取物的指纹图谱，用于控制不同产地、批次药材制备的提取物的批间差异性。
【IPC分类】A61P35/00, G01N30/02, A61K36/9064
【公开号】CN104958679
【申请号】CN201510313188
【发明人】徐蒙蒙
【申请人】徐蒙蒙
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月9日