一种组织工程人工皮肤及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于组织工程生物医用材料和医疗器械领域，涉及一种组织工程人工皮肤及其制备方法。
【背景技术】
[0002]皮肤人体面积最大也是最重要的器官之一，具有呼吸、保持水分和生物屏障功能，但是由于烫伤、感染、摩擦等各种原因造成的皮肤缺损成为常见疾患之一，如何能够开发出一款替代人体皮肤的组织工程皮肤成为研宄的热点。皮肤缺损成为组织工程皮肤的研宄范围包括人工表皮、人工真皮和全层皮肤三个方面。其中，最受人们推崇的是同时含有真皮和表皮两种结构的人工皮肤(引自:人全层组织工程皮肤的研制，金岩等)。
[0003]为了解决皮肤缺损问题，美国已开发出数十种皮肤替代材料，包括有同种异体皮肤、异种皮肤、无细胞皮肤组织工程支架和人工合成材料皮肤。同种异体皮肤有AllopatchHD ?、Alloskin ?、Dermacell?等十余种，无细胞组织工程支架包括有Collaguard?、Integra "等多种皮肤替代材料，这些材料都存在免疫排斥或者需要再次植皮等问题。
[0004]我国在皮肤缺损治疗领域的发展较晚，经过近十年来的发展，有部分产品已经上市，如第四军医大学金岩教授开发的含人体表皮细胞和成纤维细胞的人工皮肤，也有部分产品进入开发应用阶段。刘永庆开发了一种人工皮肤的制备方法(专利公开号CN1485099A)，制备一种含表皮层和真皮层的人工皮肤，但该皮肤存在表皮层和真皮层易分离和无法耐受手术缝合的问题。佘振定开发了一种生长因子缓释型双层人工皮肤(专利公开号为CN101716376A)，高长友等开发的胶原-壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架及其制备方法(公开号CN1785444A)等也都存在表皮层与人体皮肤力学性能不匹配和需要二次植皮的问题。
[0005]为了克服现有人工皮肤的缺点，本发明提供了一种最接近人体皮肤组织的组织工程人工皮肤支架材料，作为缺损皮肤的永久性皮肤替代物，去除了人工皮肤在应用时的免疫排斥、异物反应和病毒感染等方面的问题。本发明所构建的组织工程人工皮肤接近生理状况，不仅可以同时将所缺损的表皮和真皮修复，而且这两种成分具有互相影响的机制，促进彼此的分化，比单纯的人工表皮或是人工真皮更能达到满意的效果，还可以作为载药和干细胞领域的支架载体。
【发明内容】
[0006]本发明针对现有产品的缺陷，目的在于提供一种新型组织工程人工皮肤及其制备方法，该人工皮肤具有表皮层和真皮层结构，表皮层接近于人体皮肤，既能够保持水分，又具有透气透湿等呼吸功能，具有力学强度接近人体表皮层，可以耐受手术缝合操作，真皮层更加接近人体皮肤真皮层的结构，为具有两层不同孔隙率的三维多孔支架结构组成，两层因为孔隙率不同而形成两个层次的梯度结构，这种高度仿生的结构更加有利于真皮再生。
[0007]一种组织工程人工皮肤，包括表皮层和真皮层，其特征在于:所述的表皮层由致密的、带有微孔结构的内部分子取向的半渗透性的薄膜组成，厚度为0.05~1_，所述的真皮层由两层不同孔隙率的三维多孔支架结构组成，其中所述两层中的一层被交联，两层因为孔隙率不同而形成两个层次的梯度结构，厚度为1.5~8_，该人工皮肤可赋予呼吸功能。
[0008]其中，组成表皮层的材料为胶原蛋白或胶原蛋白与壳聚糖的共混材料，组成真皮层的材料为胶原材料或胶原蛋白与壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、海藻酸盐或聚乙烯醇的共混材料。
[0009]其中，所述胶原蛋白为无端肽胶原蛋白。
[0010]其中，组成的表皮层材料在微观结构上是分子取向的，可以接受手术中的缝合操作，厚度为0.05~lmmo
[0011]所述的真皮层由两层不同孔隙率的三维多孔支架结构组成，真皮层厚度为
1.5mm~8mm，其中贴近表皮层的上层多孔支架的孔隙率较低，为70~90%，贴近人体组织的下层多孔支架的孔隙率较高，为90~98% ;贴近人体组织的下层多孔支架材料为交联结构。
[0012]真皮层中的贴近人体组织的下层多孔支架材料为交联结构，其特征在于:所述的交联结构，是海绵通过物理方法、化学方法或两者结合的方法进行交联后形成的。
[0013]表皮层若为胶原与壳聚糖的共混材料，其中胶原的含量为50~99wt% ;真皮层若为胶原与壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、海藻酸盐或聚乙烯醇的共混材料，其中胶原的其中胶原的含量为30~99wt%。
[0014]同时本发明还提供了该人工皮肤的制备方法，制备方法包括以下步骤:
步骤1:以弱酸溶液为溶剂，配置浓度较高的胶原或胶原复合溶液，浓度为0.6~2wt%，装入透析袋中透析2~7天，形成溶液I ;
步骤2:以弱酸溶液为溶剂，配置浓度较低的胶原或胶原复合溶液，浓度为0.2~lwt%，形成溶液II ;
步骤3:将溶液II注入一定深度的模具中，在_80~-20°C下冷冻干燥成海绵，作为真皮层的下层；
步骤4:将步骤3所得到的海绵，使用物理方法、化学方法或两者结合的方法进行交联，得到交联的海绵层；
步骤5:将溶液I注入一定深度的模具中，在0~80°C下通风干燥成薄膜；
步骤6:在步骤5所得的薄膜上注入一定厚度的溶液I，流平一段时间后，将步骤4所得到的海绵层直接帖附在溶液I上，再在-80~-2(TC下冷冻干燥成型，从而形成带有含梯度孔隙率结构的真皮层和带有微孔结构的表皮层的人工皮肤。
[0015]其中，步骤I中，所述浓度较高的胶原或胶原复合溶液，浓度为0.6~2wt%,若为胶原复合溶液，其中材料为胶原蛋白和壳聚糖的共混材料，共混材料中胶原的含量为50~99wt% ;步骤2中，所述的浓度较低的胶原或胶原复合溶液，浓度为0.2~lwt%，若为胶原复合溶液，其中材料为胶原与壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、海藻酸盐或聚乙烯醇的共混材料，共混材料中胶原的含量为30~99wt% ;步骤I和步骤2中，所述的弱酸为稀盐酸、醋酸、甲酸、丙酸、丁酸或乳酸中的一种或多种；步骤I中所述的透析，透析介质为弱酸溶液或水或两者交替进行。
[0016]其中，步骤4中，所述的交联方法中，物理方法有紫外辐照、热脱氢法、辐照灭菌法；化学交联方法有使用碳化二亚胺、二胺、环氧化合物、羟基琥珀酰亚胺、二苯基磷酸盐(DPPA)、戊二醛、甲醛、乙醛酸、京尼平进行交联，使用化学交联剂后，需要经过洗脱程序去除交联剂的残留。
[0017]一种人工皮肤，由上述的方法制备而得，其特征在于:表皮层和真皮层中，所使用的胶原蛋白，是从动物的皮肤、跟腱等组织，通过酶解、盐析、透析等步骤提取的去端肽胶原蛋白，可以是I型胶原蛋白，也可以是I型和III型胶原蛋白的混合物。
[0018]一种人工皮肤，由上述的方法制备而得，其特征在于:真皮层中，还可以加入抗生素、维生素、其他组织中提取的表皮细胞或自体组织提取的骨髓间充质干细胞。
[0019]本发明所具有的优点有:
1.表皮层透析工艺制得，内部分子具有取向性结构，使得表皮层具有与人体皮肤类似的有力学强度，手术中可以耐受缝合操作；
2.表皮层通过溶解挥发法制得，材料与人体表皮相同，具有微孔结构，可使得人工皮肤具有与人体皮肤相似的透氧透湿性能，赋予人工皮肤呼吸功能，同时方面愈合过程中的消毒和给药操作；
3.真皮层更加接近人体皮肤真皮层的结构，为具有两层不同孔隙率的三维多孔支架结构组成，两层因为孔隙率不同而形成两个层次的梯度结构，利于不同类型的细胞长入和增殖，这种高度仿生的结构更加有利于真皮再生；
4.真皮层的海绵结构经过交联，支架结构更加稳定、更富有韧性，有助于自体细胞的的增殖；
5.使用的胶原蛋白为无端肽胶原蛋白，去除了人工皮肤在应用时的免疫排斥、异物反应和