用于血糖控制的治疗剂、组合物和方法
【专利说明】用于血糖控制的治疗剂、组合物和方法
[0001] 优先权
[0002] 本申请要求2013年1月15日提交的美国临时申请号No. 61/752, 542和2013年5 月30日提交的美国临时申请号61/829, 074的利益和优先权，并且其全部内容均通过引用 并入本申请。 发明领域
[0003] 本发明部分地涉及胰岛素融合蛋白，以及包含其的药物组合物和联用疗法，其为 血糖控制提供了治疗益处。
[0004] 背景
[0005] 肽和小分子药物的有效性通常受到此类药物在循环中的半衰期以及难以获 得基本上恒定的血浆水平的限制。例如，肠促胰岛素GLP-1必须以相对较高的剂量 施用以克服其在循环中较短的半衰期，此外这些较高的剂量与恶心相关。Murphy和 Bloom, Nonpeptidicglucagon-likepeptide 1 receptor agonistsiA magic bullet for diabetes ?(非肽类腠高血糖素样肽1夸体激动剂：是治疗糖尿病的魔弾吗？）PNAS 104(3) : 689-690 (2007)。而且，在一些评估中，肽剂血管活性肠肽（vasoactive intestinal p印tide，VIP)显示出低于1分钟的半衰期，这使得将该药剂作为药物使用是不切实际的。 Domschke 等,Vasoactive intestinal peptide in man:pharmacokinetics, metabolic and circulatoryeffects (血管$舌f生肠肽在男f生中的药代云力力学、代i射矛口循环效 应),Gut 19:1049-1053(1978) ;Henning 和 Sawmiller,Vasoactive intestinal peptide: cardiovascular effects(血管活性肠肽的心月庄效应），Cardiovascular Research 49:27-37(2001)。肽类药物较短的血浆半衰期通常是由于其在系统循环中具有 迅速的肾脏清除率和酶促降解所致。
[0006] 胰岛素或其衍生物面临类似的困境，但是还存在其他挑战。胰腺的胰岛细胞在进 餐和头天晚上之间分泌基础水平的胰岛素以确保血糖水平维持在适宜的范围，特别是防止 出现夜间低血糖。进餐消化后，大量胰岛素释放进入循环以便使得葡萄糖在消化和吸收后 内流进入循环。为了优化血糖水平的控制和阻止高血糖，这种被称为餐时胰岛素的物质必 须释放的非常迅速；在正常个体中胰岛素的峰值出现在开始进餐后30-45分钟。
[0007]目前用于1型和2型糖尿病治疗的胰岛素疗法基本上分为两种形式：基础胰岛素 以便在全天提供低水平的胰岛素和用于在餐前立即注射的胰岛素以模拟机体在餐时胰岛 素的正常释放。基础胰岛素产品面临的挑战是提供恒定的胰岛素水平，使其峰和谷水平之 间不存在较大的差异，理想的情况是注射不超过每日一次，优选地每周一次。对于餐时胰岛 素而言，其分子需要非常迅速地从皮下注射部位吸收，其水平在2小时左右以内衰减至接 近基础水平。
[0008]目前可用的餐时胰岛素制剂具有较高的胰岛素浓度，并且这些胰岛素分子在存在 锌时自组装成六聚体。因此，这些胰岛素分子通常以六聚体、二聚体和单体的动态平衡存在 于溶液中，其比例取决于该溶液的浓度和pH。在中性pH的市售胰岛素制剂中，该平衡强烈 偏向于锌稳定的六聚体，其对于保存期限的稳定性是有利的，因为单体胰岛素通常是不稳 定的并可能会脱酰胺。皮下注射时，六聚体胰岛素吸收较差并且必须解离成二聚体和单体 才能摄取进入循环，这导致达到最高水平的显著延迟。
[0009] 速效胰岛素具有改变的氨基酸序列以使得二聚体和六聚体不稳定，这样胰岛素能 够更加迅速的转化为单体形式。但是目前市场上销售的产品与内源性释放的胰岛素相比其 达到峰值水平仍明显较慢，因此需要在餐前20分钟注射才能达到最佳控制。目前正在对多 种方法进行研究以进一步加速注射胰岛素的摄取，包括将注射部位升温以增加血流，注射 酶破坏皮下脂肪层的透明质酸层（Heinemann和Muchmore综述，2012.Ultrafast-Acting Insulins: State of theArt (走召谏效腠岛素：技术现状）.Tournal of Diabetes Science and Technology 6,728-742)。通过合并来自持续的葡萄糖监测的数据扩展胰岛素递送 栗的用途受到越来越多的关注，这最终导致产生需要较少或不需要用户输入的闭环系统。 然而，目前的速效胰岛素作用过于缓慢以至于不能真正产生此类反馈回路系统，因为其对 于血糖水平的作用被显著延迟。在栗储液器的生理上可接受的溶液中稳定的更速效的胰 岛素将能够用于开发此类称为"人工胰腺"的系统（Cenzig, 2012. Undeniable Need for Ultrafast-Acting Insulin:The PediatricPerspective (对于走召谏效腠岛素不可否认的 需求：儿科透视）Journal of Diabetes Science and Technology 6, 797-801) 〇
[0010] 在基础胰岛素产品的研发方面则属于相反情形，其目标为从注射部位具有持续摄 取，或具有延长的循环半衰期的胰岛素分子，或者这两者的组合。目前市场上最受欢迎的基 础胰岛素是精甘胰岛素，但是这种产品不能提供全部24小时的覆盖。
[0011] 因此，仍需要一种显示出具有改善的药学性质的胰岛素疗法，例如改进的基础胰 岛素产品和更速效的餐时胰岛素。特别地，需要具有相容性的和能够共同配制的基础和速 效胰岛素以便能够每日施用一次，以针对否则导致最高或最大程度长期血糖偏移的餐食通 常是早餐提供基础组分加餐时的覆盖。
[0012] 本发明的其他目的从下述本发明的说明书中将是显而易见的。
[0013] 发明概述
[0014] 本发明提供了基于胰岛素的药剂及其组合物、组合和制剂。所述药剂显示出一种 或多种选自下述的益处：持续释放、迅速起效（由于例如六聚体形式丧失或减少）和IGF受 体的降低的活性。本发明在各个方面涉及提供持续释放（例如长效）或速效性质的胰岛素 的融合伴侣，其能够单独施用，或者作为共同疗法单独或一同施用。
[0015] 在一个方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含胰岛素B链和胰岛 素A链和5至200个氨基酸的融合伴侣，如约50至约150个氨基酸残基，所述融合伴侣抑制 胰岛素多聚体（例如六聚体）形成。在一些实施方式中，所述融合伴侣具有伸展构象，其可 以形成随机卷曲或重复的0 _转角构象，其可能是由于所述融合伴侣主序列的脯氨酸残基 和/或总体氨基酸组分的模式导致的。在一些实施方式中，所述融合伴侣的序列含有少于 约35%、或者少于约30%、或者少于约20 %的疏水性残基，疏水性残基不包括丙氨酸、甘氨 酸和脯氨酸。例如，疏水性残基在这个上下文中包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、 半胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸。所述融合伴侣可以包括一个或多个带正电 荷的残基以降低所述融合伴侣的疏水性。在一些实施方式中，减少或消除六聚体形成的序 列不诱导从注射部位的持续释放。在进一步的实施方式中，所述序列稳定在生理上可相容 的溶液中单体或基本上单体形式的胰岛素。在这些方面，本发明提供了用于提供餐时胰岛 素的治疗剂和药物组合物或制剂。
[0016]在另一个方面，本发明提供了用于提供持续血糖控制的药物组合物和制剂，所述 药物组合物和制剂包含有效量的融合蛋白，所述融合蛋白包含胰岛素氨基酸序列（例如胰 岛素A链和胰岛素B链）和融合伴侣，所述融合伴侣具有提供从注射位点持续释放的氨基 酸序列，以及以达到持续释放的药物赋形剂。在一些实施方式中，所述融合伴侣具有伸展构 象，其可以形成随机卷曲或重复的转角构象，其可能是由于所述融合伴侣的脯氨酸残 基和/或总体氨基酸组分的模式导致的。在这些实施方式中，所述融合伴侣可以在约35°C 或约外周体温下显示出相转变（phase transition)，使得导致所述药物从注射部位持续释 放的基质或药物储库。这些方面对于例如在糖尿病患者中提供基础胰岛素是有用的。
[0017]在一些实施方式中，本申请所述的药剂和组合物提供了在IGF受体具有降低的或 可忽略的结合和/或活性的益处，使得制备例如本发明特别适用于1型或2型糖尿病患者 的慢性治疗的药剂、组合物和制剂。
[0018]在一些实施方式中，本发明提供了本申请所述活性剂的共制剂和联用疗法，包括 基础胰岛素和速效胰岛素融合蛋白的共制剂和联用疗法，以及所述胰岛素药剂与其他药剂 如GLP-1受体激动剂的共制剂。例如，在一些实施方式中，本申请所述的基础胰岛素和速效 胰岛素的共同疗法或共制剂通过单次注射为整日提供迅速和持续性的胰岛素作用。此外， 所述持续释放融合蛋白与GLP-1受体激动剂的共制剂能够对血糖控制提供协同效应，包括 在一些实施方式中，通过每周施用一次提供基础胰岛素水平。
[0019]在另一个方面，本发明提供了治疗糖尿病、低胰岛素血症或高血糖症的方法，包括 施用本申请所述的药物组合物、制剂或联合疗法。在一些实施方式中，患者患有1型糖尿病 或2型糖尿病，或者前驱糖尿病。在一些实施方式中，所述方法包括以从每月约1次至约 30次的频率施用本申请所述的药物组合物，包括约每周一次，或者约每周两次或三次，或者 约每日一次。在一些实施方式中，所述方法包括皮下或肌内施用所述药物组合物。在一些 实施方式中，所述方法提供了长期疗法，其中所述药剂施用多年。在施用餐时胰岛素的情况 下，在一些实施方式中，所述方法包括在进餐前立即施用所述药物组合物，例如开始进餐前 约15分钟、约10分钟、约5分钟或小于1分钟。在一些实施方式中，在给药后和/或开始 进餐后30-45分钟获得胰岛素的峰值水平。
[0020] 在一些实施方式中，所述方法包括通过任选地带有闭环系统的栗系统施用本申请 所述的一种或多种药剂或组合物以基于例如通过葡萄糖监测系统确定的血液中的葡萄糖 水平控制胰岛素的递送量。所述系统可以控制和施用基础胰岛素（例如，如本申请所述的） 和速效胰岛素（例如，如本申请所述的），并且还可以控制GLP-1受体激动剂的施用，亦如本 申请所述的。
[0021] 附图简述
[0022] 图1A显示了人胰岛素原序列（SEQ ID N0:13)。胰岛素原序列由与C肽连接的B 链和A链组成。在两个邻近的二元位点（下划线斜体表示）酶促裂解后，C肽被除去以形 成成熟的胰岛素。
[0023] 图1B显示了称为PE0139或INSUMERA或胰岛素-ELP1-120的构建示意图，其具有 与胰岛素A链的C-末端融合的120ELP单元。
[0024] 图2显示了 pPE0139质粒的图谱。
[0025] 图3显示了胰岛素原ELP1-120融合蛋白（SEQ ID N0:14)的氨基酸序列。所述胰 岛素原序列（下划线）与ELP1-120序列融合。所述氨基酸序列任选地在N-末端包括起始 甲硫氨酸残基。
[0026] 图4显示了非还原SDS-PAGE实验。非还原SDS-PAGE显示了 C-肽裂解的酶促加工 后预期减少的融合蛋白分子量。第1道：SEEBLUE? Plus2预染色标准品（INVITR0GEN)， 第2道：ELP1-120,第3道：胰岛素原ELP1-120,第4道：胰岛素ELP-1203 y g，第5道：胰岛 素 ELP1-1206 y g，第 6 道：SEEBLUE? Plus2 预染色标准品（INVITR0GEN)。
[0027] 图5显示了抗-胰岛素B链的western印迹。进行抗-胰岛素B链的western印 迹以确证与ELP融合的A链和B链两者的存在。数据显示在非还原条件下存在B-链，这 表明在A链和B链之间形成了二硫键。融合蛋白和二硫键的还原导致从所述融合中除去B 链。第1道：还原的胰岛素ELP融合显示B链的缺失，第2道：非还原的胰岛素ELP融合显 示B-链的存在，第3道：ELP1-120,第4道：胰岛素原ELP融合显示B-链的存在。
[0028] 图6显示未加工的胰岛素-ELP1-120的ESI-MS数据。电喷雾离子化质谱确证了 未加工的胰岛素原ELP融合的质量为57008. ?a(SGS M扫描代码104531&104532)。存在附 加的盐加合物。
[0029] 图7显示了经加工的pPE0139的ESI-MS数据。电喷雾离子化质谱确证了在酶促除 去C-肽后的成熟胰岛素ELP融合的质量（SGS M-扫描代码107610)。胰岛素ELP的ESI-MS 显示了分子量约53298Da的主要产物峰，其代表C-肽裂解后成熟的胰岛素ELP。小峰可能 归因于部分降解的融合或盐加合物。
[0030] 图8显示了在正常小鼠中使用胰岛素-ELP1-120融合相比于甘精胰岛素血糖更 低。
[0031] 图9显示了在1型糖尿病（1型糖尿病，T1DM)小鼠模型中定量给予 INSUMERA(PE0139)。特别地，显示了单次给药的数据。结果表明与等摩尔LANTUS(甘精胰 岛素，SANOFI-AVENTIS)给药相比，INSUMERA的血糖降低持续时间更长。STZ是链脲菌素； 未给药组指正常的、非糖尿病动物；N =每组8只。
[0032] 图10显示了在1型糖尿病（1型糖尿病，T1DM)小鼠模型中给予 INSUMERA(PE0139)。特别地，显示了每日给药的数据。结果表明在活性和半衰期方面与 LANTUS(甘精胰岛素，SANOFI-AVENTIS)相比，INSUMERA具有优效性。STZ是链脲菌素；未给 药组指正常的、非糖尿病动物；在6h时间点，25mg和50mg/kg组N = 5 ;在8h时间点，25mg/ kg 组 N = 3 和 50mg/kg 组 n = 2 ;在 24h 时间点，25mg/kg 组 N = 1 和 5mg/kg 组 N = 7。
[0033] 图11A显示了在1型糖尿病（1型糖尿病，T1DM)小鼠模型中与LANTUS(甘精胰岛 素，SANOFI-AVENTIS)相比INSUMERA(PE0139)具有低的剂量滴定。特别地，图11A显示了单 次s. c.给药。STZ是链脲菌素；未给药组指正常的、非糖尿病动物；LANTUS组、PE01391mg/ kg 组和未给药组 N = 8 ;PE01393. 33mg/kg 组 N = 7。
[0034] 图11B显示了在1型糖尿病（1型糖尿病，T1DM)小鼠模型中与LANTUS(甘精胰 岛素，SANOFI-AVENTIS)相比INSUMERA(PE0139)具有低的剂量滴定。特别地，图11B显示 了每日s. c.给药14天。STZ是链脲菌素；未给药组指正常的、非糖尿病动物；LANTUS组、 PE01391mg/kg 组和未给药组 N = 8 ;PE01393. 33mg/kg 组 N = 7。
[0035]图 12A显示了相对于LANTUS(甘精胰岛素，SANOFI-AVENTIS) INSUMERA(PE0139)具 有显著增加的血糖控制。相对于Lantus在第1、3、7和14天的血糖曲线下面积（AUC)减少 27-39%。特别地，图12A显示了化合物施用第1天且在0-24hrs的血糖AUC。
[0036]图 12B显示了相对于LANTUS(甘精胰岛素，SANOFI-AVENTIS) INSUMERA(PE0139)具 有显著增加的血糖控制。相对于Lantus在第1、3、7和14天的血糖曲线下面积（AUC)减少 27-39%。特别地，图12B显示了化合物施用第14天且在0-24hrs的血糖AUC。
[0037] 图13A显示了皮下注射后INSUMERA(PE0139)达到了具有较小的峰谷比值的长的 半衰期。特别地，图13A显示了在糖尿病猪中单次s.c.注射后的药代动力学（PK)药物水 平。
[0038] 图13B显示了每日皮下注射后INSUMERA(PE0139)达到了稳态峰谷药代动力学 (PK)水平。特别地，图13B显示了在糖尿病猪中每日s.c.注射2周；测定给药前的PK水 平。
[0039] 图14显示了根据本公开的示例性速效胰岛素的设计。胰岛素B链-胰岛素A 链-ELP1-20的序列如（SEQ ID N0:15)所示。
[0040] 图15显示了速效胰岛素的产生和离子交换色谱。
[0041] 图16显示了与INSUMERA相比速效胰岛素的效能，并且显示其效能相当。
[0042] 图17显示了质粒pPE0224编码的胰岛素原ELP1-20融合蛋白。
[0043] 图18显示了胰岛素原ELP1-20融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:16)。
[0044] 图19显示了质粒pPE0262编码的胰岛素原ELP1-10融合蛋白。
[0045] 图20显示了胰岛素原ELP1-10融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:17)。
[0046] 图21显示了质粒pPE0259编码的胰岛素原ELP2-20融合蛋白。
[0047] 图22显示了胰岛素原ELP2-20融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:18)。
[0048] 图23显示了质粒pPE0266编码的胰岛素原ELP2-10融合蛋白。
[0049] 图24显示了胰岛素原ELP1-10融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:19)。
[0050] 图25显示了质粒pPE0283编码的胰岛素原ELPl-10(4xGlu)融合蛋白。
[0051] 图26显示了胰岛素原ELPl-10(4xGlu)融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:20)。
[0052] 图27显示了质粒pPE0284编码的赖脯ELP1-10融合蛋白。
[0053] 图28显示了赖脯ELP1-10融合蛋白的氨基酸序列（SEQIDN0:21)。
[0054] 图29显示了质粒pPE0285编码的赖脯ELP1-10融合蛋白。
[0055] 图30显示了门冬ELP1-10融合蛋白的氨基酸序列（SEQ IDN0:22)。
[0056] 图31显示了质粒pPE0289