酸序列共价连接形成，其直接或通过短或长的接头部分，通过治疗 性proteinacious成分上的一个或多个官能团例如胺基、羧基、苯基、疏基或羟基形成共价 缀合物。可以使用多种常见的接头，例如二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、碳二亚胺、二（羟基琥 珀酰亚胺）酯、马来酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺酯、戊二醛等。
[0167] 此外，非肽化学间隔可以是任意适宜的类型，包括例如生物缀合技术，Greg T.Hermanson，Academic Press, Inc.出版，1995中所描述的功能接头，和交联试剂技术手 册，Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Illinois)中所提及的那些，其全部内容均通 过全文引用并入本申请。示例性的化学间隔包括同双功能接头，其能够与Lys的胺基连接， 以及异双功能接头连接，所述的异双功能接头能够在一个末端与Cys连接和在另一个末端 与Lys连接。
[0168] 在某些实施方式中，将在室温下（或人体体温，例如Tt>37°C )不转变的相对较小 的ELP成分（例如小于约30kDa、25kDa、20kDa、15kDa或10kDa的ELP成分）化学偶联或交 联。例如，可以将两个具有相同或不同性质的相对小的ELP成分化学偶联。在一些实施方 式中，此类偶联可以发生在体内，通过在ELP的C-末端上或其周围加入单一的半胱氨酸残 基。此类ELP成分可以分别与一个或多个胰岛素氨基酸序列融合，以便在靶点增加活性或 亲合性。
[0169] 治疗疾病的方法
[0170] 在不同实施方式中，所述治疗提供持续的血糖控制。血糖控制指在糖尿病患者中 典型的血糖（葡萄糖）水平。多种糖尿病的长期并发症，包括微血管并发症是由于多年的 高血糖导致的。良好的血糖控制是糖尿病护理的重要目标。由于血糖水平在一天中是波动 的并且葡萄糖记录并不是这些改变的完美指示，因此在糖尿病患者的研究试验和临床护理 中使用用于糖基化的血红蛋白的百分率作为长期血糖控制的替代指标。在这项检测中，血 红蛋白Ale或糖化血红蛋白（HbAlc)反映了之前2-3个月的平均葡萄糖值。
[0171] 通过最常用的方法在具有正常的葡萄糖代谢的非糖尿病人群中，糖化血红蛋白水 平通常为约4-6% (正常范围可能随着方法而改变）。"完美的血糖控制"指葡萄糖水平一 直是正常的（例如约70 - 130mg/dl，或者约3. 9-7. 2mmol/L)并且不能区别非糖尿病人群。 事实上，由于治疗措施是不完美的，即使"好的血糖控制"所描述的血糖水平在大多数时间 里也是平均略高于正常水平的。值得注意的是所认为的"好的血糖控制"随着年龄和患者对 低血糖的敏感性而改变。美国糖尿病协会建议患者和医师要努力将平均葡萄糖和血红蛋白 Ale值控制在低于200mg/dl (llmmol/1)和8%。"差的血糖控制"指持续升高的血糖和糖化 血红蛋白水平，其可能在严重并发症出现前的数月和数年间在例如约200 - 500mg/dl (约 ll-28mmol/L)和约9-15%或更高的范围内。
[0172] 在不同实施方式中，本申请所述的本发明的药物组合物用于管理和护理患有疾病 如糖尿病或高血糖或者任意其他状况的患者，对于这些患者胰岛素的施用适用于抗击或减 轻这些状况的症状和并发症，其包括多种代谢病症。治疗包括施用本发明的药剂、组合物或 制剂以阻止所述症状或并发症的起始、减轻所述症状或并发症，或者消除所述疾病、状况或 病症。本方法包括治疗1型糖尿病，即机体不产生胰岛素并且因此不能控制血液中糖的量 的状况，和2型糖尿病，即机体不能正确地使用胰岛素并其因此不能控制血液中糖的量的 状况。在一些实施方式中，患者患有一种或多种糖尿病并发症，包括心血管并发症，或者在 一些实施方式中患有代谢疾病和/或具有临床肥胖症或超重的特征。在一些实施方式中， 患者（在治疗方案开始时）的HbAlc高于约12%、高于约10%、高于约9%、或高于约8. 5、 或高于约8%、或高于约7. 5%、或高于约7. 0、或高于约6. 5。
[0173] 由于所述活性剂消除或降低与IGF受体的相互作用，在一些实施方式中，本申请 所述的活性剂特别适于长期疗法，包括进行多年的治疗（例如至少约2年、至少约3年、至 少约5年、至少约10年或者更长时间）。
[0174] 在一些实施方式中，本发明提供了施用基础胰岛素和餐时胰岛素联合疗法的方 法，其可以单独或一起施用。例如，在一些实施方式中，患者接受速效和/或长效胰岛素方 案，其中至少一种此类药剂具有提供使多聚体形成丧失或持续释放的融合伴侣。在一些实 施方式中，提供降低多聚体形成的速效胰岛素与甘精胰岛素或地特胰岛素作为共同疗法。 其是指如所描述的向患者施用所述速效胰岛素融合，其中所述患者正在使用甘精胰岛素或 地特胰岛素的基础胰岛素疗法。在其他实施方式中，将提供持续释放的长效胰岛素与赖脯 胰岛素、天冬胰岛素或赖谷胰岛素中的一种或多种作为共同疗法。其是指如所描述的向患 者施用所述长效胰岛素融合，其中所述患者正在使用具有赖脯胰岛素、天冬胰岛素或赖谷 胰岛素的餐时胰岛素疗法。
[0175] 在不同实施方式中，本发明提供了联合疗法和/或共制剂，其包含本申请所述的 药物组合物和有效治疗疾病的其他药剂，例如如上文所述的那些。
[0176] 在一些实施方式中，本发明提供了（持续释放胰岛素或餐时胰岛素）与胰高血糖 素样受体（GLP) -1受体激动剂，如GLP-1 (SEQ IDN0:30)、艾塞那肽-4 (SEQ IDN0:31)，或 如美国专利8, 178, 495中所公开的其功能性类似物或其衍生物的联用或共制剂，其通过引 用并入本申请。在一些实施方式中，所述GLP-1是GLP-1 (A-B)，其中A是1至7的整数和B 是38至45的整数。在一些实施方式中，所述GLP-1是GLP-1 (7-36)，或其功能性类似物，或 者GLP-1 (7-37)或其功能性类似物。在一些实施方式中，所述GLP-1受体激动剂包含还允 许持续释放的融合伴侣，例如具有US 2013/0090285中公开的PK性质，其通过引用并入本 申请。因此，所述GLP-1受体激动剂可以具有SEQ ID N0:32所示的序列。在一些实施方式 中，所述GLP-1受体激动剂融合伴侣是ELP1-120,其中所述客体残基是比例约为5:2:3的缬 氨酸、丙氨酸和甘氨酸。如图37至41所示，此类共制剂提供了协同作用，并且能够降低所 施用的这两种药剂的剂量。
[0177] 在另一个实施方式中，本发明提供了与GLP-2、GIP、胰高血糖素和胃泌酸调节素或 者其功能性类似物和/或其衍生物的联用或共制剂。功能性类似物相相对于天然序列而言 可以含有1至10个氨基酸的插入、缺失和/或取代（共同地）。
[0178] 在不同实施方式中，所述联用疗法和/或共制剂包含与例如ELP或如本申请所述 的基质形成成分的两种或多种融合蛋白。在一些实施方式中，所述ELP包含VPGXG(SEQ ID NO: 3)的至少60个单元、或90个单元、或120个单元或者180个单元，其中X独立地选自氨 基酸。在不同实施方式中，X是比例为5:3:2的V、G或A，或者比例为1:2:1的K、V或F，或 者比例为1:7:1的K、V或F，或者V。
[0179] 在不同实施方式中，组合物包含胰岛素的持续释放形式，其任选地包含胰岛素的 速效形式，其每日在早饭前施用一次。 实施例
[0180] 实施例1--持续释放腠岛素构律体
[0181] 将人胰岛素原与ELP1-120生物聚合物基因融合并在大肠杆菌（E coli)的可溶性 成分中表达。在经纯化酶促过程将胰岛素原部分转化成成熟的胰岛素后，在正常小鼠模型 中测定所述融合蛋白对葡萄糖的降低情况并与单独的胰岛素进行比较。所述胰岛素ELP融 合显示出的对葡萄糖的降低情况与胰岛素类似。此外，在该模型中所述融合蛋白的降低作 用与胰岛素相比具有更长的持续时间。
[0182] 胰岛素融合的构建
[0183] 人胰岛素原由B链和A链组成，其通过31个氨基酸的C肽连接在一起（图1A和 1B)。一旦在A链和B链之间形成二硫键，胰岛素原通过胰酶/羧肽酶B-样系统除去C肽 转化成在体内成熟的胰岛素。可以使用重组的胰酶和羧肽酶B在体外复制这种肽的加工过 程。一旦所述融合在大肠杆菌的可溶性成份中表达，则再折叠步骤不是必需的。
[0184] 合成胰岛素原核苷酸序列并将其亚克隆至基于pET的载体pPB1031中，其定位于 ELP1-120序列的N-末端以制备质粒pPE0139(图2)。
[0185] 图3显示了胰岛素原ELP1-120融合蛋白（SEQ ID N0:14)的氨基酸序列。所述胰 岛素原序列（下划线）与ELP1-120序列融合。所述氨基酸序列任选地在N-末端包括起始 甲硫氨酸残基。
[0186] 发酵
[0187] 在分批补料发酵工艺中，在T7启动子的控制下将胰岛素ELP融合质粒pPE0139在 大肠杆菌的细胞内成分中表达。使用两阶段摇瓶种子培养，使用含甘油的半定义的、无动物 培养基（ECPM+脯氨酸）作为主要碳源和酵母提取物作为主要氮源扩增甘油细胞储备液。在 种子培养阶段获得足够的细胞密度后，将培养物转移至含有与种子培养阶段相同培养基的 发酵罐中。通过PID控制将工艺参数（pH、温度、溶解的氧）保持在设定点。使培养物生长 直至其达到稳定期，随后开始加入甘油/酵母提取物/硫酸镁。将培养物维持在碳限定条 件下并且使用IPTG诱导启动子。在发酵结束时，将培养物离心以便将含有胰岛素ELP融合 的生物质与废弃的培养基分离。将细胞团贮存在_70°C直至进行随后的纯化。
[0188] 胰岛素原ELP的纯化
[0189] 将冷冻细胞团在含有2M尿素的裂解缓冲液（用于使胰岛素原ELP解离）中重悬 并混合直至均匀。使用微流化器进行裂解以破坏细胞膜，然后通过离心进行裂解物的初始 澄清。使用两阶段切向流过滤（TFF)系统进一步澄清和浓缩产品。使用缓冲液将含有胰 岛素原ELP融合的溶液调整浓缩至1M氯化钠并通过疏水性相互作用色谱（HIC)柱（例如 TOSOH PPG 600M)作为捕获步骤并且洗去宿主细胞污染物。梯度洗脱产品以分级分离所有 产品相关的杂质（例如降解物质）。在选定的组分上进行TFF缓冲液交换以便在进行胰岛 素原ELP向胰岛素ELP的酶促转化之前除去残留的盐。
[0190] 胰岛素原ELP融合的酶促过程
[0191] 通过使用重组胰酶和羧肽酶B酶促消化C-肽将经纯化的胰岛素原ELP1-120转化 为胰岛素ELP，胰岛素原与胰岛素原ELP的比例分别为0. 05yg/mg和2. 0yg/mg。在室温 下（20-25°C)孵育反应3至4小时直至C-肽完全裂解以产生成熟的胰岛素ELP。
[0192] 胰岛素ELP的纯化
[0193] 在转化为胰岛素ELP后，通过在捕获HIC柱再处理胰岛素ELP除去残留的酶和产 物变体，其中胰岛素ELP与该柱结合，残留的酶通过该柱。对洗脱得到的产物组分进行渗滤 以除去NaCl，然后通过离子交换（例如P0R0S 50 PI)对其进行纯化，其中离子交换的条件 为使产品流过，使宿主细胞污染物被捕获。最后使用阳离子交换柱（例如P0R0S 50 HS)除 去产物变体、宿主细胞蛋白、内毒素和DNA。然后将洗脱得到的产物浓缩和渗滤至制剂缓冲 液（例如 20mM 组氨酸，110mM NaCl，pH 7. 5)。
[0194] 非还原SDS-PAGE (图4)显示了在经酶促处理后随着C-肽的裂解预期减少的融合 蛋白分子量降低。
[0195] 进行抗_胰岛素B链western印迹（图5)以确证存在与ELP融合的A链和B链。 数据显示在非还原条件下存在B链，这表明在A链和B链之间形成了二硫键。对融合蛋白 和二硫键的还原导致从所述融合中除去了 B链。
[0196] 电喷雾离子化质谱确证了胰岛素原ELP融合的质量（图6)和在酶促除去C-肽后 成熟胰岛素ELP融合的质量（图7)。在这两个样品中存在附加的盐加合物。使用Ellman 试剂检测确证存在二硫键。不存在游离的硫醇表明形成了二硫键。
[0197] 体内葡萄糖降低
[0198] 将正常小鼠禁食过夜并皮下注射生理盐水（阴性对照）、13nmol/kg甘精胰岛素 (阳性对照）或35nmol/kg胰岛素ELP融合（INSUMERA)。在给药前和给药后8小时至24小 时每小时获取血糖读数。在给药后1小时提供食物。图8显示了血糖数据（平均值+-SE)。 与生理盐水对照相比，所述胰岛素ELP融合显示了明显的血糖降低。此外，所述胰岛素ELP 融合显示了血糖降低作用（7小时）长于甘精胰岛素对照（2小时）。
[0199] 在1型糖尿病模型中的体内作用
[0200] 在1型糖尿病（1型糖尿病，T1DM)小鼠模型中给予ELP-胰岛素融合， INSUMERA(PE0139)。特别地，单次给药数据如图9所示。结果表明与等摩尔LANTUS(甘 精胰岛素，SANOFI-AVENTIS)给药相比，INSUMERA的血糖降低持续时间更长。当以每日 方案给予所述化合物时（图10)，结果表明在活性和半衰期方面与LANTUS(甘精胰岛素， SANOFI-AVENTIS)相比，INSUMERA 具有优效性。
[0201] 图11A和11B显示了在1型糖尿病（1型糖尿病，T1DM)小鼠模型中与LANTUS(甘 精胰岛素，SANOFI-AVENTIS)相比INSUMERA(PE0139)具有低的剂量滴定。图11A显示了单 次s.c.给药，图11B 14天每日s.c.给药。在这两种情况下，均显不了 INSUMERA的更加显 著和持续的血糖降低作用。
[0202] 还进行了研究以确定INSUMERA的血糖控制程度，对患者的典型血糖水平进 行检测。图12A和11B显示了相对于LANTUS(甘精胰岛素，SANOFI-AVENTIS)而言， INSUMERA(PE0139)具有显著增加的血糖控制。血糖曲线下面积（AUC)可见减少27-39%。 图12A显示了化合物施用第1天且在0-24hrs的血糖AUC。图12B显示了化合物施用第14 天且在0-24hrs的血糖AUC。在这两个给药方案中，INSUMERA对血糖AUC的降低比LANTUS 更有效。
[0203] 还进行了研究以评估INSUMERA治疗的药代动力学（PK)。在糖尿病猪中，给予单次 s. c.注射（图13A)或连续2周每日s. c.注射（图13B)。结果显示皮下注射后INSUMERA 具有长的半衰期和小的峰谷比值。
[0204] 胰岛素/受体的相互作用
[0205] 下述研究的目的是对胰岛素肽和胰岛素肽/蛋白构建体与人胰岛素和IGF-1受体 的结合情况进行附加检测。
[0206] 分析条件：在25°C下使用配有镍电荷NTA传感器芯片和经过运行缓冲液（10mM 冊?￡5，150禮恥(：1，0.01%了￥6611-20卬117.8)平衡的祀3(3〇代551光学生物传感器进行结 合研究。针对这些研究，假定LCR-1054胰岛素肽的分子量为5808Da以及INS-ELP(B30)和 PE0139的分子量为50, OOODa。
[0207] 还在更高浓度下对INS_ELP(B30)和PE0139进行筛选。在早期检测中，未观察到 INS-ELP(B30)和PE0139的受体结合。在3yM下对这两种待测物重新进行检测，并引入 LCR-1054(600nM)作为阳性对照。
[0208] 在3 yM时，INS-ELP(B30)和PE0139显示出与胰岛素受体表面的结合（图35A)。 在3 yM时，INS-ELP(B30)和PE0139未显示出与IGF-1受体显著的结合（图35B)。
[0209] 为了更加详细的研究这些相互作用，制备新鲜的rhIR和rhIGF-lR的表面。捕获 的带His标签的rhIR的密度约1200RU。IGF-1R通过胺基偶联于相同的芯片上，其密度为 7500RU。通过与600nM LCR-1054的结合确证这些新鲜的rhIR和rhIGF-lR表面的活性。
[0210] 系列浓度的INS-ELP(B30)和PE0139。在初始为20 yM的3倍系列稀释中检测 INS-ELP(B30)和PE0139与这两种受体表面的结合。这两种待测物显示出与胰岛素受体类 似的结合（图36A)。
[0211] 将应答对待测物浓度作图并与样品的结合等温线进行拟合以获得这些相互作用 的亲和性估计值（图36B)。
[0212] 而相反的是，待测物均未显示出与rhIGF-lR表面可靠的结合。事实上，在更高浓 度下来自该表面的应答是负的，因为与固化的IGF-1R相比待测物与对照表面（传感器芯片 上未连接蛋白的区域）显示出更强的结合。
[0213] 因此，本实施例尤其显示了在这些分析条件下INS-ELP(B30)和PE0139以约6-8uM 的亲和性与胰岛素受体结合，并且INS-ELP(B30)和PE0139未显示出任何与IGF-1受体可 检测的结合。
[0214] 随后使用针对受体活化基于细胞的检测对所述构建体与IGF-1R的结合进行了研 究，使用经工程化改造的细胞以表达IGF受体。使用该系统，速效和持续释放构建体均显示 出对IGF受体的一些活化作用，但是其水平显著低于胰岛素（数据未显示）。
[0215] 实施例2-谏效腠岛素构律体
[0216] 为了制备"速效"胰岛素ELP融合，在pPE0139中将胰岛素原序列与长度短于120 个ELP五聚体重复的ELP聚合物基因性融合。这些更短的聚合物具有显著高于生理条件的 转变温度，其有效地去除了所述聚合物的持续释放功能，但是保留了其阻止胰岛素多聚化 的能力并且使其在溶液中具有稳定性。
[0217] 合成胰岛素原核苷酸序列并使用限制性内切酶将其亚克隆进入基于pET的载体 PPE0221中。胰岛素原的位置在ELP1-20序列的N-末端以制备质粒pPE0224(图17)。
[0218] 图18显示了胰岛素原ELP1-20融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:16)。胰岛素 原序列（下划线）与ELP1-20序列（粗体）融合。
[0219] 为构建与长度短于ELP1-20的聚合物融合的胰岛素原，合成所述胰岛素原的核苷 酸序