胰岛素与本申请所述的持续释 放胰岛素融合共配制。
[0097] 在又一个实施方式中，胰岛素氨基酸序列可以含有赖谷胰岛素（也称为 APIDRA，Sanof i-Aventis)的A链和/或B链。赖谷胰岛素是通过人胰岛素B链3位的天冬 酰胺被赖氨酸取代和29位的赖氨酸被谷氨酰胺取代形成的短效类似物。与常规人胰岛素 相比，赖谷胰岛素起效更为迅速和作用持续时间更短。因此，在一些实施方式中，将赖谷胰 岛素的A链和B链与本申请所述的融合蛋白策略联用。在其他实施方式中，将赖谷胰岛素 与本申请所述的持续释放胰岛素融合共配制。
[0098] 在另一个实施方式中，胰岛素氨基酸序列可以含有甘精胰岛素（也称为 LANTUS，Sanofi-Aventis)的A链和/或B链。LANTUS具有延迟的吸收，由于其酸性pH导 致其在中性生理pH下形成胰岛素晶体的微沉淀。甘精胰岛素与人胰岛素的差异为A链21 位的天冬酰胺被甘氨酸取代并且B-链的C-末端添加了两个精氨酸。与睡时使用的中性鱼 精蛋白锌（NPH)胰岛素（中效胰岛素）相比，甘精胰岛素在2型糖尿病患者中与更少的夜 间低血糖相关。因此，在一些实施方式中，将甘精胰岛素的A链和B链序列与本申请所述的 用于持续释放的融合蛋白策略联用。在其他实施方式中，将甘精胰岛素与本申请所述的速 效胰岛素融合共配制。
[0099] 在又一个实施方式中，胰岛素氨基酸序列可以含有地特胰岛素（也称为 LEVEMIR，Novo Nordisk)的A链和/或B链。地特胰岛素是可溶性（在中性pH)长效胰岛素 类似物，其中在B30的氨基酸苏氨酸被除去并且14-碳、肉豆蔻酰脂肪酸被乙酰化为LysB29 的e-氨基。皮下注射后，地特胰岛素解离，从而暴露能可逆性地与白蛋白分子结合的游离 脂肪酸。这样在稳态时，游离未结合胰岛素的浓度极大地降低导致稳定的血浆葡萄糖水平。 因此，在一些实施方式中，将地特胰岛素的A链和B链序列与本申请所述的用于持续释放的 融合蛋白策略联用。在其他实施方式中，将地特胰岛素与本申请所述的速效胰岛素融合共 配制。
[0100] 在一些实施方式中，胰岛素氨基酸序列可以是单链胰岛素类似物（SIA)(例如，如 美国专利6, 630, 438和W0 2008/019368所述，其全部内容通过引用并入本申请）。单链胰 岛素类似物包含一组结构相关的蛋白，其中A链和B链通过多肽接头共价连接。所述多肽 接头将所述B链的C-末端与所述A链的N-末端连接。所述接头可以是任意长度，只要所 述接头提供对SIA具有葡萄糖摄取和胰岛素受体结合效应所必须的结构构象即可。在一些 实施方式中，所述接头的长度为约5-18个氨基酸。在其他实施方式中，所述接头的长度为 约9-15个氨基酸。在某些实施方式中，所述接头为约12个氨基酸长。在某些示例性实施方 式中，所述接头具有序列 KDDNPNLPRLVR(SEQ ID N0:26)或 GAGSSSRRAPQT(SEQ ID N0:27)。 然而，应理解该序列的多种变体是可能的，如基本上不会损失所产生的SIA在葡萄糖摄取 和胰岛素受体结合活性方面作用的长度（添加和缺失）和氨基酸取代。例如，可以在任一 末端添加或除去基本上不会降低所产生的SIA活性的若干不同的氨基酸残基。
[0101]目前在临床上研发的示例性单链胰岛素类似物是albulin (Duttaroy等， 2005, Diabetes 54:251-8)。Albulin能够在酵母或哺乳动物细胞中生产。其由通过十二肽 接头连接在一起的人胰岛素的B链和A链组成（与天然人胰岛素具有100%的一致性）并 且融合至天然人血清白蛋白的NH2末端。对于albulin的表达和纯化而言，使用四重叠引 物和PCR扩增构建编码单链胰岛素的合成基因，所述单链胰岛素包括由十二肽接头连接在 一起的成熟人胰岛素的B链和A链。将所得到的PCR产物连接在人血清白蛋白（HSA)单肽 和成熟HSA的NH2末端之间的框架中，其包含于用于在酵母中表达的pSAC35载体中。根据 本发明，abulin的HSA成分可以被如本申请所述的提供持续释放的氨基酸序列所取代。
[0102] 因此，在一个方面，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含提供改进的治 疗性质（例如持续释放或减少多聚体形成）的氨基酸序列，包括例如，弹性蛋白样肽（ELP)， 和胰岛素氨基酸序列。例如，在某些实施方式中，所述胰岛素是哺乳动物胰岛素，如人胰岛 素或猪胰岛素。根据本发明，可以将提供持续释放或减少多聚体形成的氨基酸序列与胰岛 素的A链、或B链或者这两者偶联（例如通过重组融合或化学缀合）。在一些实施方式中， 将提供从注射部位缓慢吸收的氨基酸序列与胰岛素A链共价结合。所述胰岛素可以含有胰 岛素原并且包含A链、B链和C链中的每一个，或者可以含有仅含A链和B链的加工形式。 在一些实施方式中，A链和B链通过短连接肽连接以形成单链胰岛素。所述胰岛素可以是人 胰岛素的功能性类似物，包括在（A链和B链之一或这两者的）N-末端和/或C-末端截短 或延伸1至10个氨基酸，包括1、2、3或约5个氨基酸的功能性片段。功能性类似物相对于 天然序列而言（例如SEQ ID NO:24和25)可以含有1至10个氨基酸插入、缺失和/或取 代（共同地），并且在各情况下均保留肽的活性。例如，所述胰岛素B链的位置3、28、29和 30以及A链的位置21可以被取代，包括被K3、G21、K28、D28、P29、Q29取代。在一些实施 方式中，在B链的C-末端加入1至5个氨基酸，或可以除去B链的T30。此类改变可以任选 地对应于赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、甘精胰岛素和地特胰岛素的序列。因此，功 能性类似物相对于天然序列而言（其可以含有A链和B链，或者A链、B链和C链）可以具 有1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失和/或取代（共同地）并且在一些实施方式中可以进 一步支持迅速起效或延迟起效。可以使用任意可用的检测确证或测定此类活性，包括本申 请所述的那些。在这些或其他实施方式中，所述胰岛素链具有与A链和B链的各天然序列 (SEQ ID N0S:24和25)具有至少约75%、80%、85%、90%、95%或98%的同一性的氨基酸 序列。可以使用任意比对工具确定两条序列之间的序列同一性（例如天然序列和功能性类 似物），包括Tatusova等，Blast 2序列-一种用于比较蛋白和核苷酸序列的新工具，FEMS Microbiol Lett. 174:247-250(1999)。所述胰岛素成分可以含有本领域公知的其他化学修 饰。
[0103] 在一些实施方式中，本发明提供了基础胰岛素和餐时胰岛素的联用疗法，包括本 申请所述的速效和延迟起效胰岛素疗法的任意组合，并且其中至少一种此类试剂具有提 供使多聚体形成丧失或持续释放的融合伴侣。在一些实施方式中，至少一种试剂是甘精胰 岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、单链胰岛素类似物 (SIA)和 albulin。
[0104]为了表征胰岛素类似物或含有提供持续释放的氨基酸序列的胰岛素类似物的 体外结合性质，可以在多种表达胰岛素受体的细胞系中进行竞争结合检测（Jehle等， 1996, Diabetologia 39:421-432)。例如，可以使用过表达人胰岛素受体的CH0细胞进行竞 争结合检测。胰岛素还能够与低于胰岛素受体的亲和性与IGF-1受体结合。为确定含有提 供持续释放的氨基酸序列的胰岛素类似物的结合亲和性，可以在L6细胞中使用 1251_标记 的IGF-1进行竞争结合检测。
[0105] 胰岛素的活性包括刺激外周葡萄糖处置和抑制肝脏葡萄糖产生。可以使用公知的 方法在体外检测含有提供持续释放的氨基酸序列的胰岛素类似介导这些生物活性的能力。 例如，可以测定含有提供持续释放的氨基酸序列的类似物在3T3-L1脂肪细胞中对葡萄糖 摄取的作用并且将其与胰岛素比较。使用具有生物活性的类似物对细胞进行预处理将通常 产生剂量依赖性的2-脱氧葡萄糖摄取增加。可以在任意数量的细胞类型例如H4IIe肝细 胞瘤细胞中测定含有提供持续释放的氨基酸序列的胰岛素调节葡萄糖产生的能力。在这项 检测中，使用具有生物活性的类似物进行预处理将通常产生剂量依赖性的所释放的葡萄糖 量的抑制。
[0106] 提供持续释放和/或多聚体形成丧失的氨基酸序列
[0107]在一些实施方式中，提供持续释放的氨基酸序列包含通过蛋白主链基团和/或侧 链基团形成氢键的结构单元，并且其可能有助于形成基质的疏水性相互作用相关。在一些 实施方式中，所述氨基酸侧链不含有氢键供体基团，其氢键基本上通过蛋白主链形成。示例 性的氨基酸包括脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸和异亮氨酸，以及类似的氨基酸。在一些 实施方式中，所述结构单元是基本上重复的结构单元，以形成基本上重复的结构基序和基 本上重复的氢键结合力。在这些和其他实施方式中，所述氨基酸序列包含至少10 %、至少 20%、至少40%或至少50%的脯氨酸，其可能位于一种模式中。所述脯氨酸的模式可以形 成重复的转角结构，或形成具有少的或无定义的二级结构的伸展构象（例如无0片层 或a螺旋）。在这些实施方式中，将所述融合伴侣定义为随机卷曲构象。在这种情况下，脯 氨酸残基的模式指氨基酸序列至少50%或至少75%的脯氨酸残基是可定义的单元或主序 列部分。在其他实施方式中，所述氨基酸序列包含具有氢键供体侧链的氨基酸，如丝氨酸、 苏氨酸和/或酪氨酸。在一些实施方式中，所述重复序列可以含有1至约4个脯氨酸残基， 其余的残基独立地选自非极性残基，如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。非极性 或疏水性残基可能有助于形成基质的疏水性相互作用。
[0108]在这些实施方式中，所述氨基酸序列在高于贮存温度的温度下注射后可以形成 "凝胶-样"状态。具有重复肽单元的示例性序列在较低温度下可能是相对非结构化的，并 且在较高的温度下实现氢键键合的结构化状态。
[0109]在一些实施方式中，在体温下能够形成所述基质的氨基酸序列是具有4至10个氨 基酸的重复单元的肽。所述重复单元在基质形成中可以形成1、2或3个氢键。在某些实施 方式中，在体温下能够形成所述基质的氨基酸序列是丝蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白或角蛋白 的氨基酸序列，或其模拟物，或者在美国专利6, 355, 776中所公开的氨基酸序列，其通过引 用并入本申请。
[0110] 在某些实施方式中，所述氨基酸序列是弹性蛋白样蛋白（ELP)序列。所述ELP序 列包含或由于弹性蛋白相关或模拟其的结构肽单元或序列组成。所述ELP序列由3至约20 个氨基酸，或者在一些实施方式中，由4至10个氨基酸的结构单元构成，如4、5或6个氨 基酸。各结构单元的长度可以是变化的，也可以是均一的。示例性的结构单元包括SEQ ID NOS: 1-12 (如下文所示）所定义的单元，可以将其作为重复结构单元使用，包括串联重复单 元，或者可以将其在一些组合中使用。因此，所述ELP可以包括或基本上由选自如下文所定 义的SEQ ID N0S:1-12的结构单元组成。
[0111] 在一些实施方式中，包括其中的结构单元是ELP单元的实施方式，所述氨基酸序 列包含或基本上由约50至约500个结构单元组成，或者在某些实施方式中约50至约200个 结构单元，或者在某些实施方式中约80至约180个结构单元，或者约100至约150个结构 单元，如SEQ ID N0S: 1-12所定义的一个单元或其组合。因此，所述结构单元共同地可以具 有约50至约2000个氨基酸残基，或者约100至约800个氨基酸残基，或者约200至约700 个氨基酸残基，或者约400至约600个氨基酸残基，或者约400至约1000个氨基酸残基，或 者约500至约1000个氨基酸残基，或者约600至约1000个氨基酸残基，或者约700至约 1000个氨基酸残基的长度。
[0112] 所述氨基酸序列可以显示出具有选定制剂的可见或可逆的反相转化。也就是说， 在低于转变温度（Tt)时，所述氨基酸序列在所述制剂中可能是结构混乱和高度可溶的，但 是当所述制剂的温度上升至高于Tt时，其显示出尖锐的（2-3°C范围）无序至有序的相转 变。除了温度以外，氨基酸聚合物的长度、氨基酸组成、离子强度、pH、压力、温度、选定的溶 剂、存在的有机溶质和蛋白浓度也可以影响转变性质，并且这些可以针对所需的吸收性质 在制剂中定制。可以通过确定胰岛素氨基酸序列的血浆浓度或随时间的活性容易地对吸收 性质进行检测。
[0113] 在某些实施方式中，所述ELP成分可以形成结构单元，包括但不限于：
[0114] (a)四肽 Val-Pro-Gly-Gly，或 VPGG(SEQ ID N0:1);
[0115] (b)四肽 Ile-Pro-Gly-Gly，或 IPGG(SEQ ID N0:2);
[0116] (c)五肽 Val-Pr〇-Gly-X-Gly(SEQ ID N0:3)，或 VPGXG，其中 X 是任意天然的或非 天然的氨基酸残基，并且其中X任选地在多聚物或寡聚物重复之间改变；
[0117] (d)五肽 Ala-Val-Gly-Val-Pro,或 AVGVP(SEQ ID N0:4);
[0118] (e)五肽 Ile-Pro-Gly-X-Gly，或 IPGXG(SEQ ID N0:5)，其中 X 是任意天然的或非 天然的氨基酸残基，并且其中X任选地在多聚物或寡聚物重复之间改变；
[0119] (f)五肽 Ile-Pro-Gly-Val-Gly，或 IPGVG(SEQ ID N0:6);
[0120](g)五肽 Leu-Pro-Gly-X-Gly，或 LPGXG(SEQ ID N0:7)，其中 X 是任意天然的或非 天然的氨基酸残基，并且其中X任选地在多聚物或寡聚物重复之间改变；
[0121] (h)五肽 Leu-Pro-Gly-Val-Gly，或 LPGVG(SEQ ID N0:8);
[0122] (i)六肽 Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly，或 VAPGVG(SEQ ID N0:9);
[0123] (j)八肽 Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly，或 GVGVPGVG(SEQ ID N0:10);
[0124] (k)九肽Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Val-Gly-Ala-Gly，或VPGFGVGAG(SEQ ID N0:11); 和
[0125] (1)九肽Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Gly，或VPGVGVPGG(SEQ ID N0:12) 〇
[0126] 由SEQ ID NO: 1-12定义的此类结构单元可以形成结构重复单元，或者可以联合 使用以形成ELP。在一些实施方式中，所述ELP成分完全（或几乎完全）由选自SEQ ID NO: 1-12的结构单元中的一个或其组合（例如2、3或4个）形成。在其他实施方式中，至少 75%、至少80%或至少90%的ELP成分由选自SEQ ID N0:1-12的结构单元中的一个或其 组合形成，并且其可以以重复单元的形式存在。
[0127] 在某些实施方式中，所述ELP包含Val-Pro_Gly-X-Gly(SEQ ID N0:3)的重复单 元，其包括串联重复单元，其中X如上文所定义，并且Val-Pr〇-Gly-X-Gly(SEQ ID N0:3)单 元的百分率相对于整个ELP成分（其可以包含VPGXG(SEQ ID N0:3)以外的结构单元）高 于所述ELP的约50 %、或者高于约75 %、或者高于约85 %、或者高于约95%。所述ELP可 以含有SEQ ID N0:3的基序，其客体残基X在所述基序中在至少2个或至少3个单元之间 变化。所述客体残基可以独立地选自例如非极性或疏水性残基，如氨基酸V、I、L、A、G和 W(并且可以对其进行选择以保留所需的反相转变性质）。
[0128] 在一些实施方式中，所述ELP可以形成转角结构。适于形成转角结构的示 例性肽序列如国际专利申请PCT/US96/05186中所述，其通过全文引用并入本申请。例如， 可以对序列VPGXG(SEQ ID N0:3)中的第4个残基（X)进行改变，而不会消除转角的形 成。
[0129] 可以使用表示法ELPk[XiYj_n]描述示例性ELP的结构，其中k表示特定的ELP 重复单元，括号内的大写字母是单字母氨基酸代码，其相应的下标表示各客体残基X在结 构单元中（在适用的情况下）的相对比例，以及n以结构重复数描述ELP的总长。例如， ELP1[V5A2G3-10]表示含有10个五肽VPGXG(SEQ ID N0:3)重复单元的ELP成分，其中X 是相对比例为约5:2:3的缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；ELPl[KlV2Fl-4]表示含有4个五肽 VPGXG(SEQ ID N0:3)重复单元的ELP成分，其中X是相对比例为约1:2:1的赖氨酸、缬氨 酸和苯丙氨酸；ELPl[KlV7Fl-9]表示含有9个五肽VPGXG(SEQ ID N0:3)重复单元的多 肽，其中X是相对比例为约1:7:1的赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸；ELPl[V-5]表示含有5个 五肽VPGXG(SEQ ID N0:3)重复单元的多肽，其中X是缬氨酸；ELPl[V-20]表示含有20个 五肽VPGXG(SEQ ID N0:3)重复单元的多肽，其中X是缬氨酸；ELP2[5]表示含有5个五肽 AVGVP(SEQ ID N0:4)重复单元的多肽；ELP3[V-5]表示含有 5 个五肽 IPGXG(SEQ ID N0:5) 重复单元的多肽，其中X是缬氨酸；ELP4[V-5]表示含有5个五肽LPGXG(SEQ ID N0:7)重 复单元的多肽，其中X是缬氨酸。
[0130] 关于ELP，Tt是客体残基疏水性的函数。因此，通过改变客体残基的一致性及其摩 尔分数，可以合成出在较宽范围内显示出反相转变的ELP。因此，可以通过在ELP序列中引 入更高分数的疏水性客体残基在给定ELP长度降低Tt。适宜的疏水性客体残基的示例包 括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨基酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。也可以使用具有中度疏水性 的酪氨酸。相反地，可以通过引入残基增加Tt，如选自下述的那些：谷氨酸、半胱氨酸、赖氨 酸、天冬氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸和谷氨酰胺。
[0131] 对于分子量>100,000的多肽而言，在？(^/1^96/0518