用于治疗关节损坏的肽和组合物的制作方法
【专利说明】用于治疗关节损坏的肽和组合物
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年3月8日递交的美国临时专利申请号61/775, 400和2014年2 月10日递交的美国临时专利申请号61/938, 123的优先权和权益，所有这些文献均完整地 特此并入作为参考。
[0003] 发明背景
[0004] 骨关节炎（0A)是最常见的肌肉骨骼紊乱。大约4千万美国人目前患有0A ;预计该 数目在接下来的20年里会由于群体老龄化和寿命的增加而增加到6千万，从而导致0A成 为第四大致残原因。0A的特征在于，缓慢的关节退行性破坏，包括关节软骨（含有为关节提 供润滑和缓冲的细胞和基质）和位于关节软骨下方的软骨下骨。0A可以被认为是各种病因 学因素的后果。例如，它可以由关节软骨或骨的异常生物机械压力或遗传性或获得性异常 而引起。目前0A治疗包括使用口服NSAID或选择性环加氧酶2 (C0X-2)抑制剂缓解疼痛、 关节内（IA)注射活性剂例如皮质类固醇和透明质酸、以及手术方法。
[0005] 关节损坏例如急性关节损伤，例如半月板或韧带撕裂、或关节内骨折，也可以导致 关节炎，例如创伤后关节炎。由于关节软骨具有有限的修复能力，甚至小的不可检测的损伤 也常常可能随时间而恶化并导致0A。目前关节损伤的治疗可以包括手术和聚焦于使受伤关 节再生的其它侵入性方法，以及用活性剂治疗以减少疼痛和炎症。
[0006] 间充质干细胞（MSCs)存在于成年关节软骨中，分离后可以在体外程序化以分 化为软骨和其它间充质细胞谱系，并可以用于软骨再生。部分地，该过程受生长因子 (TGF 0 s，BMPs)、血清条件和细胞-细胞接触的调节。W02011/008773描述肽组合物及其用 于治疗或预防关节炎和关节损伤的用途和用于诱导间充质细胞分化为软骨细胞的用途。此 外，W02011/008773描述小分子化合物、组合物及其用于改善关节炎和关节损伤的用途和用 于诱导间充质细胞分化为软骨细胞的用途。
[0007] 尽管手术技术和再生技术已经在软骨恢复、延缓退化和改善关节损坏的修复上取 得了一些进展，但是仍持续需要用于有效软骨再生、治疗关节损坏、和改善或防止0A的改 良组合物和方法。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明涉及鉴定新的血管生成素样3(ANGPTL3)多肽和蛋白质变体，所述变体具 有改善的药物性质，例如比野生型ANGPTL3更稳定、更不易于发生蛋白水解和酶促降解。本 发明还提供在哺乳动物中用于治疗关节损坏或关节损伤的组合物和方法、和改善或预防关 节炎、关节损坏或关节损伤的方法。
[0010] 因此，本发明提供蛋白酶抗性多肽，其包含与选自表1序列之任一或多个的氨基 酸序列具有至少95%氨基酸序列同一性、或至少96%，97%，98%，99%或100%氨基酸序 列同一性的氨基酸序列，如本文进一步描述。表1的修饰多肽在位置423包括非K或R的 极性氨基酸，其中所述位置参照全长ANGPTIL3多肽序列SEQ ID N0:1确定。一些实施方案 中，参照SEQ ID NO: 1确定的位置423的氨基酸是Q或S。一些实施方案中，参照SEQ ID NO: 1确定的位置423的氨基酸是Q。一些实施方案中，参照SEQ ID NO: 1确定的位置423 的氨基酸是S。一些实施方案中，参照SEQ ID NO: 1确定的位置423的氨基酸缺失。此外， 提供的多肽具有软骨发生活性。
[0011] 一些实施方案中，多肽包含与 SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41,SEQ ID N0:65, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69,和SEQ ID NO:70中任一个具有至少95 %同一性或至少 96 % ,97 % ,98 % ,99 %或100 %同一性的序列。一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21,SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID N0:60,SEQ ID N0:61,SEQ ID N0:62,SEQ ID N0:63,和 SEQ ID N0:64 中任一个具有至少 95%同一性或至少96% ,97% ,98% ,99%或100%同一性的序列。一些实施方案中，多 肽包含表1中的任一序列。一些实施方案中，多肽包含SEQ ID N0:30，SEQ ID N0:31，SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID N0:38, SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41,SEQ ID N0:65, SEQ ID N0:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69,和 SEQ ID NO:70 中的任一个。一些实施方案中， 多肽包含 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21,SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID N0:61,SEQ ID N0:63,和SEQ ID N0:64中的任一个。一些实施方案中，多肽是表1中 的任一序列。一些实施方案中，多肽是 SEQ ID N0:30，SEQ ID N0:31，SEQ ID N0:32，SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41,SEQ ID N0:65, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69,和SEQ ID NO: 70中的任一个。一些实施方案中，多肽是SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID N0:21,SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26, SEQ ID N0:27, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:58, SEQ ID N0:59, SEQ ID N0:60, SEQ ID N0:61,SEQ ID N0:63,和 SEQ ID N0:64 中的任一个。
[0012] 本发明多肽可以并入一种或多种化学修饰（例如，PEG化）。一些实施方案中，本 发明多肽可以以融合蛋白的形式包含异源肽，其中所述异源肽可以任选地融合在该多肽的 氨基端或羧基末端。本发明还提供编码本发明多肽的多核苷酸；包含编码该多肽的多核苷 酸的载体；和包含该载体的宿主细胞。
[0013] 本发明还提供包含本发明多肽和可药用载体的药物组合物。该组合物可以用于本 文所述的在患者中治疗、改善或防止关节炎或关节损坏的方法中，其中该方法包括向患者 的关节施用治疗有效量的本发明药物组合物。可以得益于该方法的病症实例包括，但不限 于关节炎（例如，骨关节炎、创伤性关节炎）、和关节损坏（例如，急性关节损伤）。
[0014] 本发明还提供治疗个体的方法，包括施用治疗有效量的本发明多肽。所提供的方 法包括治疗罹患或有危险罹患关节损坏和/或关节炎的个体，包括向个体施用治疗有效量 的一种或多种本发明多肽或其药物组合物。本发明还提供诱导间充质干细胞分化为软骨细 胞的方法，包括使间充质干细胞接触有效量的本发明多肽以诱导该间充质干细胞分化为软 骨细胞。
[0015] 本发明的这些和其它方面，包括其它特征、优点和实施方式，将在以下详细描述和 后附本发明权利要求书中进一步详细地描述和阐释。
[0016] 附图简述
[0017] 图1描述经工程化的hANGPTL3蛋白的示意图，该工程化改善蛋白稳定性和增强蛋 白水解抗性。在野生型蛋白和肽序列的蛋白生产过程中，在Lys423和Ser424之间观察到 100%的断裂。为了减少蛋白水解，产生了各种突变肽，其中Lys 423被突变为Gin或Ser; 或Ser424被突变为Thr ;或Lys 423被缺失。
[0018] 图2A和B描述在ANGPTL3和工程化构建体存在或不存在时软骨特异性蛋白质的 表达。对固定的细胞进行（2A)2A型前胶原定量（PIIANP)或（2B)II型胶原定量，以确定在 实施例中所述处理后分化为软骨细胞的细胞％。图2C描述在ANGPTL3或工程化构建体存 在或不存在时血管发生测定试验的定量结果，其中与阳性对照蛋白bFGF比较。总管长度和 分支点数量是血管发生的定量量度。尽管其他人已经报道了 ANGPTL3的血管发生活性，且 本研究证实活性与FGF的活性一样好；但是结果说明在C端ANGPTL3构建体中没有显著活 性保留。
[0019] 图3显示在ANGPTL3或工程化构建体存在时软骨特异性蛋白质表达的增加。3A.在 处理后10天使用qRT-PCR评价细胞，以测量在所述处理后软骨特异性蛋白的RNA表达。 Lubricin，聚集蛋白聚糖（aggrecan)和Sox9代表软骨相关蛋白；IGF和IFITM1代表分化 潜力，骨钙蛋白（osteocalcin)和X型胶原代表骨/纤维化相关蛋白。3B.在所述处理后3 天评价细胞。用工程化构建体或野生型ANGPTL1C端区多肽处理后，观察到增加的聚集蛋白 聚糖表达。
[0020] 图4显示ANGPTL3和工程化构建体的软骨保护活性。4A?糖胺聚糖（GAG)释放（基 质损坏的一个指标）随着递增量的ANGPTL3和突变构建体而被抑制。使用在所示构建体存 在或不存在下处理的牛软骨，实施离体GAG释放（基质损坏的一个指标）抑制试验。4B和 4C :使用递增量的ANGPTL3和所示工程化构建体抑制了 N0释放。在所示构建体存在或不 存在时处理软骨细胞，之后实施Greiss反应试验，以确定N0释放抑制作用作为软骨保护指 标。
[0021] 图5显示在肥大病况下构建体存在时X型胶原表达（纤维软骨形成活性的指标） 的抑制。在肥大病况下在所示构建体存在或不存在的情况下处理原代软骨细胞，之后通过 免疫荧光评估，以确定X型胶原表达，作为纤维及肥大软骨形成/软骨细胞分化的量度。5A 描述野生型C端ANGPTL3或工程化构建体的结果。5B描述C端ANGPTL3 (WT)或工程化构建 体242KQ或242Kdel或C端ANGPTL1的结果。
[0022] 图6示意性显示给药范例（6A)，之后图示（6B)用小鼠ANGPTL3(17-460)处理后关 节严重度的改善（通过股骨外侧課（lateral femoral condyle)的软骨侵蚀评分测定）。
[0023] 图7显示，在手术诱导软骨损坏和随后用ANGPTL3构建体每周一次持续三周（始 于第7日）处理后，小鼠中的失能测量结果（疼痛指标）。7A显示手术后第35天的失能测 量结果；7B显示手术后第56天进行测量的结果。
[0024] 图8显示，在3次ANGPTL3构建体（所示）的每周一次处理（第7、14和21天） 后，对于小鼠中胶原酶诱导的软骨损坏，关节严重度的总得分和严重度的改善。
[0025] 图9显示，在用工程化ANGPTL3构建体处理后，在关节损坏的大鼠半月板撕裂模型 中的结果。图9A图示处理后5周关节中的蛋白聚糖含量；图9B图示处理后5周股骨关节 严重度得分。结果说明，在3次ANGPTL3构建体（所示）的每周一次处理（第7、14和21 天）后，对大鼠中手术切断半月板诱导的软骨损坏的改善。
[0026] 图10显示，在用工程化ANGPTL3构建体处理后，在关节损坏的大鼠半月板撕裂模 型中的结果。图10A图示通过严重度、番红菌素（safranin)O强度、软骨面积和软骨厚度测 定的体内修复百分数。图10B显示，在手术诱导软骨损坏和随后处理后，大鼠中的失能测量 结果（疼痛指标）。
[0027] 图11图示总体严重度的总得分，以说明：自第4天开始每两周一次给药（各 1. 5ug/剂或15ug/剂）后或仅在第7天给药（单个30 y g剂量）后，犬中由手术破坏内侧 半月板（medial meniscus)诱导的软骨损坏的改善。
[0028] 发明详述
[0029] 本发明至少部分地基于鉴定到可以刺激间充质干细胞分化为软骨细胞并对蛋 白酶（例如胰蛋白酶样蛋白酶）切割具有抵抗性的血管生成素样3(ANGPTL3)多肽。 TO2011/008773描述ANGPTL3肽组合物及肽组合物用于治疗或预防关节炎和关节损伤的 用途和用于诱导间充质细胞分化为软骨细胞的用途。我们发现野生型ANGPTL3蛋白易于 发生蛋白酶剪切和不稳定，由此鉴定了减轻该效应的序列变体。本发明由此提供用于修复 软骨的改良肽组合物。尤其是，提供了根据本发明修饰的ANGPTL3肽，该修饰肽与野生型 ANGPTL3多肽相比具有增加的蛋白酶抗性。本发明还提供用于施用ANGPTL3多肽以预防或 改善关节炎或关节损伤的组合物和方法，其中向关节、软骨组织、或软骨邻近组织中、或全 身性地施用本发明多肽。此外，本发明提供用于诱导间充质干细胞分化为软骨细胞的组合 物和方法。
[0030] 定义
[0031] 术语"蛋白酶抗性"在本文中指包含修饰的多肽，所述修饰可以使该多肽与相应的 未修饰野生型多肽相比更不容易被胰蛋白酶样蛋白酶切割。在特定实施方案中，蛋白酶抗 性多肽是，相对于天然野生型肽序列，在R或K残基上具有氨基酸替代的ANGPTL3多肽。
[0032]"ANGPTL3"指血管生成素蛋白家族的成员。ANGPTL3(GenBank登录号NP_055310. 1) 的氨基酸序列示于SEQ ID N0:1中；相应的多核苷酸序列示于SEQ ID N0:2(NCBI参考序 列号 NM014495. 2,其中 ANGPTL3 编码序列包含 SEQ ID N0:2 的 nt 52-1434)。"ANGPTL3 多 肽"指天然表达的多肽。为了本公开的目的，氨基酸编号典型地参考全长野生型人ANGPTL3 多肽序列（SEQ ID N0:1)确定。因此，在本发明多肽仅含有全长ANGPTL3的C端部分而不 含N端部分的实施方案中，尽管该肽的长度小于460个氨基酸，但位置仍基于SEQ ID NO: 1 编号。例如，提及本发明ANGPTIL3多肽的位置423,即使该本发明ANGPTIL3多肽本身可能 仅200个氨基酸长度，也指SEQ ID NO: 1的位置423。可以通过最佳比对序列，例如，使用默 认CLUSTAL比对参数或默认BLAST2比对参数，并比较序列，以确定与参考序列例如SEQ ID NO: 1中的位置"相应"的目的序列中的氨基酸。例如，"参考SEQ ID NO: 1确定"的目的序 列的位置423、或"相应于" SEQ ID NO: 1位置423的氨基酸，指当目的序列与SEQ ID NO: 1 最佳比对后，与SEQ ID NO: 1的位置423对齐的氨基酸。
[0033] 术语"肽模拟物"（peptidomimetic)和"模拟物"指合成的化学化合物，该化合物 与天然或非天然的多肽（例如ANGPTL3)具有实质上相同的功能特征，但不同的（尽管典 型地是相似的）结构特征。肽类似物在本领域中通常用作和模板肽具有类似性质的非肽 活性化合物（例如药物）。此类非肽化合物被称为"肽模拟物"（"peptide mimetics〃或 〃peptidomimetics〃）（Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29(1986) ；Veber and Freidinger TINS p.392 (1985) ;and Evans et al.J. Med. Chem. 30:1229 (1987))。与治疗有用肽结构 相似的肽模拟物可以用于产生等同或增强的治疗或预防效果。一般，肽模拟物与范例多 肽（即具有生物学或药理学活性的多肽）结构相似（例如在目的多肽中发现的），但一 个或多个肽键任选地替代为选自例如-CH2NH-，-CH2S-，-CH2-CH2-，-CH = CH-(顺式和反 式），-C0CH2-，-CH(OH) CH2-，和-CH2S0-的连接。模拟物可以完全由合成的非天然氨基酸 类似物构成，或可以是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸类似物的嵌合分子。模拟物 也可以并入任何数量的天然氨基酸保守替代，只要该保守替代也不实质性改变模拟物的结 构和/或活性即可。例如，如果模拟物组合物能够具有ANGPTL3多肽的软骨发生活性，则该 模拟物组合物落入本发明范围内。
[0034] 术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该 术语适用于其中的一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸 聚合物、以及天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。本发明多肽、肽和蛋白质包括具有 软骨发生活性的蛋白酶抗性ANGPTL3肽模拟物。
[0035] 术语"氨基酸"指天然的和合成的氨基酸、以及以类似于天然氨基酸的方式发挥 功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸、以及之后 修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、Y -羧基谷氨酸和〇-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指，与天然 氨基酸具有相同的基本化学结构一一即与氢、羧基基团、氨基基团和R基团结合的碳一一 的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍（methionine methyl sulfonium)。此类类似物具有修饰的R基团（例如正亮氨酸）或修饰的肽骨架，但保持与天 然氨基酸一样的基本化学结构。天然编码的氨基酸为20种常见氨基酸（丙氨酸、精氨酸、 天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸）以及吡咯赖 氨酸（pyrrolysine)、P比略啉-羧基-赖氨酸（pyrroline-carboxy-lysine)、和硒代半胱氨 酉爱（selenocysteine) 〇
[0036] "保守修饰的变体"适用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，保守修饰的 变体指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或在该核酸不编码氨基酸序列的情况 下，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，任何给定的蛋白质均可以由多个功能相同 的核酸编码。例如，密码子GCA，GCC，GCG和G⑶均编码氨基酸丙氨酸。因此，在每一个由密 码子规定丙氨酸的位置上，该密码子均可以被改变为任一所述的相应密码子而不改变编码 的多肽。该核酸变异是"沉默变异"，其是保守修饰变异中的一种。本文中每一个由多核苷 酸编码的多肽序列都涵盖该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域技术人员明了，核酸中 的每一个密码子（除了 AUG-一通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG-一通常是色氨酸的 唯一密码子）均可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，本文描述的每一个序列都隐含 了编码多肽的核酸的每一种沉默变异。
[0037] 本领域技术人员明了，对于核酸、肽、多肽或蛋白质序列上的各替代、缺失或添加， 当其导致相对于原始编码的氨基酸序列而言改变、添加或缺失了单个氨基酸或小百分数 的氨基酸，如果该改变造成氨基酸被化学相似的氨基酸替代、和/或造成可以产生与原始 蛋白质具有相似功能活性的结构相似蛋白质的多肽序列时，则该改变导致"保守修饰的变 体"。本领域熟知提供功能相似氨基酸的保守替代表。此类保守修饰变体与本发明的多态 性变体、物种间同源物和等位基因一起涵盖在本发明中，且不排斥本发明的多态性变体、物 种间同源物和等位基因。
[0038] 术语"保守氨基酸替代"指，来自一个保守氨基酸替代组的氨基酸（概念地或以其 它方式）替代为来自相同组的不同氨基酸。替代的一个例子基于分析同源生物的相应蛋白 质之间氨基酸变化的标化频率（参见例如Schulz, G.E.和R.H.Schirme