，未检测到任一参数的显著增加。见图2C。
[0154] CR-MSCs存在于透明关节软骨中，响应于损伤而出现数量增加。软骨组织损伤后， 这些细胞有参与修复过程的能力，但其本身不足以导致恰当的软骨修复。由此，患者的关 节软骨缺乏支持无痛关节运动的恰当能力，患者常常需要手术干预和/或关节置换以维持 他们的生活质量。我们发现，ANGPTL3和尤其是工程化蛋白酶抗性ANGPTL3肽具有指导人 CR-MSCs分化为软骨细胞的能力，特别是分泌透明关节软骨蛋白II型胶原和sox9,而抑制 纤维软骨形成（通过X型胶原的表达而显示）。
[0155] 据我们所知，没有ANGPTL3表达的报道，在我们的研究中使用Western印迹在人软 骨细胞、人MSC或人滑膜成纤维细胞中也未观测到ANGPTL3表达。在啮齿类动物的关节中， 采用免疫组织化学（IHC)发现很少表达至没有表达。然而，在人骨关节炎滑液中（n = 2)， 采用酶联免疫吸附实验（ELISA)检测到低水平ANGPTL3 (1. 3-6. 0纳克/毫升），表明在受损 的关节中全身循环性蛋白可进入滑膜腔。
[0156] 实施例4:构建体的体内分析
[0157]小鼠急性损伤手术樽型。对先前所描述的模型Glasson, S. S.， 等，Osteoarthritis Cartilagel5, 1061(2007)进行适应性修改，手术切断C57BL/6小鼠（N =12/组）右膝的前交叉韧带（ACL)、内侧半月板胫侧韧带（MMTL)、和内侧副韧带（MCL)， 诱导膝关节的不稳定性，从而导致0A表型。为评价ANGPTL3治疗的潜在治疗益处，术后15 周，如图6A所示在第17-19周小鼠关节内给药，一次/每周：mANGPTL3剂量=200ng/膝。 按0-4级定性评估胫骨平台：0为正常，5为重度骨关节炎（软骨的全层破坏）。来自每只 小鼠的两个切片由2个独立的观察者进行盲分级（图6B)。
[0158] 通过失能测试，或通过使用失能监测装置测定小鼠以手术处理的腿站立的时间相 对于以未处理腿站立的时间的百分比，确定动物中骨关节炎诱导的疼痛的缓解。图7描述 了读数结果，代表术后第35和56天的疼痛反应，报告为手术肢体相对于非手术肢体的负 重％。处理为使用全长小鼠ANGPTL3(WT17-460)或C端人ANGPTL3(WT225-460)按上述给 药的小鼠的结果。
[0159]小鼠慢件0A樽铟（胶原酶VII诱导的）另一广泛伸用的骨关节炎动物樽姻一一 胶原酶VII诱导的慢性关节损伤模型一一被用于评价构建体的体内功效。模型和评价如以 前所述进行。见 van der Kraan, P. M.，等，Am. J. Pathol. 135, 1001 (1989);和 Johnson, K.， 等，Science336, 717(2012)。简而言之，三（3)天炎症期后是由胶原酶诱导的关节去稳定， 导致轻度至中度软骨破坏。在诱导后，在膝中关节内施用构建体，自加入胶原酶VII后3周 开始，每周一次，持续3周。治疗后40(42)天，收集关节和切片。通过股骨和胫骨平台的组 织学关节严重度评分，定量组织修复。关节严重度得分通过上述组织学评分确定。图8描 述了使用225WT，225KQ，228KQ，233KQ，和241KQ构建体的修复。为确认蛋白在关节中的存在 (长期关节内保留），固定组织和染色，通过免疫组织化学分析WT蛋白构建体的存在。分析 证实了蛋白质的存在，表明ANGPTL3的关节内保留（对脂质/甘油三酯未观察到影响，使用 标准代谢组评估，数据未显示。）
[0160] 组织学分析和分级番红菌素0染色的内侧胫骨平台切片（用于检测损伤部位的蛋 白聚糖，如上所述），显示软骨基质的再生（数据未显示）。定性分析证实蛋白聚糖的替换 类似于在幼稚小鼠中观察到的水平，而媒介物对照没有表现出类似的替换。此外，注射损伤 处后8周，如上所述对组织切片进行II型胶原染色。定性分析证实以构建体处理的关节中 II型胶原增加，类似于在幼稚小鼠中观察到的水平；而媒介物处理的对照未表现出类似的 增长（数据未显示）。
[0161]半月板撕裂大鼠樽铟
[0162] 还使用大鼠手术损伤模型评估构建体的体内功效。该模型和评价最初如Gerwin N?等Osteoarthritis Cartilage. Suppl 3:S24(2010)先前描述的实施。简言之，剃除膝关 节皮肤上的毛发，通过切口分离内侧副韧带（MCL)，稳定MCL，用手术刀造成半月板的远端 切口。在手术后第1，2和3周，关节内注射构建体蛋白质或媒介物对照，并在手术后第4周 和6周收集关节和切片。对股骨和胫骨平台进行组织学关节严重度评分，以如上所述量化 组织修复。针对该6周分析，显示了数据。
[0163] 治疗后健康的透明软骨替换了损伤。如上所述组织学分析及分级番红菌素0染色 的软骨的外侧胫骨平台，并量化。结果显示，采用242KQ构建体治疗的动物表现出了软骨基 质再生和蛋白聚糖替换，类似于在幼稚小鼠中见到的水平；而媒介物对照未出现类似的替 换。参见图9。用225WT看到了类似的结果。
[0164] 使用自上述模型稍加改动的手术诱导的半月板撕裂模型，在Lewis雄性大鼠中引 发软骨损坏，以检测242KQ体内促进软骨修复的功效。对大鼠进行手术，完全切断内侧副韧 带和内侧半月板，从而使关节去稳定，由此将来的负重将导致软骨的快速退化。在针两侧上 均进行切割以切断韧带，从而确保完全切开。然后将刀片在髌韧带下方滑入滑膜腔，以尖端 切割半月板。当关节外侧脱位时完成成功的切割。手术后一周，通过关节内注射体积25uL 的242KQ或盐水到关节内滑膜腔中，向大鼠给药。
[0165] 半月板撕裂手术后28天和关节内注射盐水或构建体后21天，处死研究动物，并收 集受累关节用于分析，以PBS中10%福尔马林固定，甲酸脱钙，石蜡包埋后切片。切出冠状 切片，进行番红菌素0染色、或不染色以备将来的免疫组化染色。分析表明，内侧胫骨平台 有最大数量的软骨损坏，并且决定仅在关节的该区域进行242KQ功效的评估。使用OARSI 评分系统，对每个动物（n= 10)跨胫软骨宽度的六个切片以盲法给出软骨严重性得分。在 不同时间点进行两次评分，然后平均得分以产生软骨损伤分数。此外，使用MATLAB中生成 的自定义脚本（script)，进行客观评分分析。该算法确定关节软骨表面并客观量化其它软 骨参数（分区分析，番红菌素〇强度，软骨面积，软骨厚度）。结果见图10A。
[0166] 至少在人类中，软骨的结构修复不总是伴随着疼痛的缓解。虽然啮齿动物的生理 和步态明显与人类不同，但评估242KQ以确定治疗后在步态或手术肢体上所用时间的长度 上是否有任何改善。对242KQ治疗的大鼠进行失能监测。大鼠接受如上所述的改动的半月 板手术。术后一周，注射242KQ到滑膜腔中。第28天，将大鼠放置在失能监测器上以后肢 站立，经过10分钟获取每只大鼠的随后30个读数，以确定在每个后肢上使用（重量分布） 的时间的百分比。这些数据指示疼痛诱导的重量重分布，已经确定，在大鼠半月板撕裂模型 中，手术后一周用242KQ治疗导致了大鼠的等同负重能力的部分恢复。见图10B。
[0167] 在自发或手术软骨修复过程中主要的挑战之一是透明关节软骨被纤维软骨置换。 为探讨ANGPTL3介导的软骨修复类型，从收集自上述大鼠半月板撕裂研究的大鼠膝获取切 片，染色以观察II型胶原（指示透明关节软骨）和X型胶原（指示纤维软骨）的存在。单 次注射20yg242KQ之后，X型胶原表达量定性减少。
[0168] 通过如下方式确定在静脉内和关节内注射到大鼠膝中后242KQ的长期保留：1241 标记蛋白，施用后PET/uCT成像以监测保留。见，Gerwin，N.，等（2006)Advanced drug delivery reviews 58, 226-242。1六注射242KQ到关节中后平均停留时间（MRT)被确定为~ 17. 3h，这比报道的标准2-3小时明显增加（见表6)
[0169]表6:124I242KQ的持久性
[0170]
[0171] 犬部分半月板切除术关节损伤樽铟
[0172] 我们也在犬关节损伤模型中评价了ANGPTL3的活性。依据Connor，J. R.,等,Osteoarthritis and carti1age/OARS,Osteoarthritis Research Societyl7, 1236-1243(2009)的描述，实施该模型和评估。简而言之，剃光膝关节皮肤上的 毛发，通过切口分离内侧副韧带（MCL)，稳定MCL，用手术刀造成半月板的远端切开。在手术 后四（4)天，动物接受蛋白构建体（犬全长ANGPTL3)的每周两次给药（1.5ug或15yg)、或 单次给药（30ug)(在第7天）或媒介物对照（关节内注射）。第28天对犬实施安乐死，按 上述用于大鼠和小鼠实验的方法，对膝实施组织学、切片和分级。图10显示与犬ANGPTL3 治疗相关的修复的合计总体得分。在组织学分级和评价番红菌素〇染色的犬关节切片后， 在盐水组中出现最严重软骨丢失的区域是30 yg单剂CANGPTL3施用后病变面积最大减少 的关节部分。
[0173] 应理解，本文描述的实施例和实施方案用于举例说明目的，其各种修饰或改变对 于本领域技术人员将是明了的，并包括在本申请的精神和范围内和后附权利要求书的范围 内。
[0174] 序列
[0175]
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[0180] CN 105025917 A W -p 40/45页
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[0183]
[0184] L/1N 丄 UDU 乙 丄 / A / w i - -t-t/ -to
[0185]
【主权项】
1. 分离的多肽，其包含与选自表1序列的氨基酸序列具有至少95%氨基酸序列同一性 的氨基酸序列，其中多肽在参考SEQ ID NO: 1所确定的位置423包含非K或R的极性氨基 酸，且多肽具有软骨发生活性。2. 权利要求1的多肽，其中该多肽包含与SEQ ID N0:30，SEQ ID N0:31，SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :34, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO :36, SEQ ID NO :37, SEQ ID N0:38, SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41,SEQ ID N0:65, SEQ ID N0:66, SEQ ID NO :67, SEQ ID NO :68, SEQ ID NO :69,或 SEQ ID NO :70 之任一的氨基酸序列具有至少 95% 序列同一性的氨基酸序列。3. 权利要求2的多肽，其中该多肽包含与SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:58, SEQ ID N0:59, SEQ ID N0:60, SEQ ID N0:61,SEQ ID N0:62，SEQ ID N0:63,或SEQ ID N0:64之任一的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的 氨基酸序列。4. 权利要求1的多肽，其中该多肽包含SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31，SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID N0:38, SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41,SEQ ID N0:65, SEQ ID N0:66, SEQ ID NO :67, SEQ ID NO :68, SEQ ID NO :69,或 SEQ ID NO :70 之任一的氨基酸序列。5. 权利要求4的多肽，其中该多肽包含SEQ ID N0:14，SEQ ID N0:15，SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22,SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID N0:58，SEQ ID N0:59，SEQ ID N0:60，SEQ ID N0:61，SEQ ID N0:62，SEQ ID N0:63,或 SEQ ID N0:64之任一的氨基酸序列。6. 权利要求 1 的多肽，其中该多肽与 SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :34, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO :36, SEQ ID NO :37, SEQ ID NO :38, SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41,SEQ ID N0:65, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:67, SEQ ID NO :68, SEQ ID NO :69,或SEQ ID NO :70之任一的氨基酸序列具有至少95%序列同一性。7. 权利要求6 的多肽，其中该多肽与 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:58, SEQ ID N0:59, SEQ ID N0:60, SEQ ID N0:61,SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:63,或SEQ ID N0:64之任一的氨基酸序列具有至少95%序列同一性。8. 权利要求1的多肽，其中该多肽是选自表1序列的氨基酸序列。9. 权利要求 8 的多肽，其中该多肽是 SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31，SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41,SEQ ID N0:65, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:67, SEQ ID NO :68, SEQ ID NO :69,和 SEQ ID NO :70 中的任一个。10. 权利要求9 的多肽，其中该多肽是SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59，SEQ ID N0:60，SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:63,或 SEQ ID N0:64 中的任一个。11. 权利要求1-10之任一的多肽，其中位置423的氨基酸是Q或S，或位置423的氨基 酸缺失。12. 权利要求1-10之任一的多肽，其中位置423的氨基酸是Q。13. 权利要求1-10之任一的多肽，其中位置423的氨基酸是S。14. 权利要求1-11之任一的多肽，其中该多肽PEG化。15. 权利要求1-14之任一的多肽，其中该多肽与以下任一融合：人血清白蛋白（HAS)、 免疫球蛋白重链丨旦定区（Fe)、聚组氣酸、谷脫甘妝S转移酶（GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白 G、或甘露糖结合蛋白（MBP)、或其片段。16. 权利要求15的多肽，其中该异源肽融合在所述多肽的氨基末端。17. 权利要求15的多肽，其中该异源肽融合在所述多肽的羧基末端。18. 药物组合物，其包含权利要求1-17之任一的多肽。19. 权利要求18的药物组合物，还包含透明质酸或其衍生物。20. 权利要求18的药物组合物，还包含选自以下的活性剂：口服鲑鱼降钙素、 SD-6010(iN0S抑制剂）、维生素D3(胆钙化醇）、胶原水解物、FGF18、BMP7、rusalatide acetate,鳄梨大豆非阜化物（ASU)、kartogenin、类固醇、和非留体抗炎药（NSAID)。21. 用于在患者中治疗、改善或防止关节炎或关节损坏的方法，其中该方法包括向患者 的关节施用治疗有效量的权利要求18的药物组合物，由此在患者中治疗、改善或防止关节 炎或关节损坏。22. 权利要求21的方法，其中患者患有关节炎或关节损坏。23. 权利要求21的方法，其中患者有罹患关节炎或关节损坏的危险。24. 权利要求22或23的方法，其中关节炎是骨关节炎、创伤性关节炎、或自身免疫性关 节炎。25. 权利要求21-24之任一的方法，其中组合物还包含透明质酸。26. 权利要求21-25之任一的方法，还包括对受累关节实施手术。27. 权利要求21-24之任一的方法，其中所述药物组合物在手术期间或之后施用。28. 权利要求26的方法，其中所述药物组合物与下述任一联合施用：骨髓刺激、软骨置 换、自体软骨细胞植入（ACI)、基质诱导的自体软骨细胞植入（MCI)。29. 权利要求21-26之任一的方法，其中所述药物组合物与一种或多种其它软骨发生 因子联合施用。30. 权利要求21-26之任一的方法，其中所述药物组合物在基质或生物相容性支架中 施用。31. 诱导间充质干细胞分化为软骨细胞的方法，该方法包括使间充质干细胞接触有效 量的权利要求1-17之任一的多肽以诱导该间充质干细胞分化为软骨细胞。32. 权利要求31的方法，其中该方法在体内实施，干细胞存在于人类个体中。33. 权利要求32的方法，其中个体患有关节炎或关节损坏。34. 权利要求32的方法，其中个体有罹患关节炎或关节损坏的危险。35. 权利要求33或34的方法，其中关节炎是骨关节炎、创伤性关节炎、或自身免疫性关 节炎。36. 权利要求32-25之任一的方法，还包括对个体的受累关节实施手术。37. 权利要求32-35之任一的方法，其中所述多肽在手术期间或之后施用。38. 权利要求32-35之任一的方法，其中所述多肽与一种或多种其它软骨发生因子联 合施用。39. 权利要求36的方法，其中所述多肽与下述任一联合施用：骨髓刺激、软骨置换、自 体软骨细胞植入（ACI)、基质诱导的自体软骨细胞植入（MCI)。40. 权利要求36的方法，其中所述多肽在基质或生物相容性支架中施用。41. 治疗罹患或有危险罹患关节损坏或关节炎的个体的方法，包括向个体施用治疗有 效量的权利要求1-17之任一的多肽。42. 权利要求41的方法，其中患者患有关节炎或关节损坏。43. 权利要求41的方法，其中患者有罹患关节炎或关节损坏的危险。44. 权利要求42或43的方法，其中关节炎是骨关节炎、创伤性关节炎、或自身免疫性关 节炎。45. 权利要求41-44之任一的方法，还包括施用透明质酸。46. 权利要求41-45之任一的方法，还包括对受累关节实施手术。47. 权利要求41-45之任一的方法，其中所述多肽在手术期间或之后施用。48. 权利要求46的方法，其中所述多肽与下述任一联合施用：骨髓刺激、软骨置换、自 体软骨细胞植入（ACI)、基质诱导的自体软骨细胞植入（MCI)。49. 权利要求41-46之任一的方法，其中所述多肽与一种或多种其它软骨发生因子联 合施用，或除施用所述多肽外还施用一种或多种其它软骨发生因子。50. 权利要求41-46之任一的方法，其中所述多肽与基质或生物相容性支架联合施用， 或除施用所述多肽外还施用基质或生物相容性支架。
【专利摘要】本发明提供新的蛋白酶抗性多肽、以及用于治疗、改善或预防关节损坏相关病症，包括急性关节损伤和关节炎，的组合物和方法。
【IPC分类】C07K14/475, A61K38/18
【公开号】CN105025917
【申请号】CN201480012768
【发明人】K·约翰逊, J·石
【申请人】诺华股份有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年3月7日
【公告号】CA2903448A1, WO2014138687A1