剂混合的治疗有效量的肽，其中所述配制试剂经选择与施用模 式、递送模式和期望剂量相适宜。见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed.，A. R. Gennaro, ed.，Mack Publishing Company 1990)，及其随后版本。药物组合物中主 要的媒介物或载体可以本质上是水性或非水性的。例如，合适的注射用媒介物或载体可以 是水、生理盐水溶液或人工脑脊液，任选地补充在胃肠外施用的组合物中常见的其他材料。 例如，可以使用缓冲剂，例如，以维持组合物在生理pH值或稍低的pH值，通常在pH值约5 至约8的范围内，并可任选包括山梨糖醇，血清白蛋白，去垢剂，或其他附加成分。在某些实 施方案中，可以使用适当的赋形剂（例如，蔗糖）配制含有本发明多肽或编码本发明多肽的 核酸的药物组合物，以便以冻干形式贮存。
[0113] 在其他实施方案中，用可以造成本发明多肽或编码本发明多肽的核酸控释或缓 释的试剂，如可注射微球，生物可蚀性颗粒，聚合物化合物，珠，或脂质体或其它生物相容 性基质，进行配制，然后制剂可以通过储库（depot)注射递送。例如，可以将本发明多肽 或编码本发明多肽的核酸包囊在脂质体中、或配制成微粒或微囊，或可并入其他媒介物， 如可生物降解的聚合物、水凝胶、环糊精（例如见Gonzalez et al.，1999，Bioconjugate Chem.，10, 1068-1074 ;Wang 等，国际 PCT 公布号 WO 03/47518 和 WO 03/46185)、聚（乳 酸-共-乙醇酸）（PLGA)和PLCA微球（见例如U. S. Pat. No. 6, 447, 796和US专利申请公 布号US 2002130430)、可生物降解的纳米胶囊、和生物粘附性微球中，或经由蛋白质性载体 (0'Hare and Normand, International PCT Publication No. W0 00/53722)或利用缀合物 递送。再其他合适的递送机制包括植入式递送装置。
[0114] 用于治疗上述疾病或病症的本发明化合物的剂量，取决于给药的方式、个体的年 龄和/或体重，以及受治个体的情况，是可变的，并最终由主治医师或兽医决定。施用于个 体的剂量，在本发明的情况下，应当在一段时间足以在个体中引起有益的反应。该剂量是 "治疗有效量"。因此，可以根据所用的本发明特定蛋白质或编码本发明多肽的核酸的有效 性、以及个体的情况和体重或待治疗区域的表面积，来确定合适剂量。剂量的大小也可以由 特定个体中伴随特定蛋白质或载体的施用而出现的任何不良副反应的存在、性质和程度来 确定。施用可以通过单剂量或分剂量来完成，或通过植入装置或导管以连续输注形式实施。 给药频率将取决于所用制剂中本发明多肽或编码本发明多肽的核酸的药代动力学参数。临 床医生可以滴定剂量和/或改变施用以达到期望的治疗效果。根据这些因素，一个典型的 剂量范围从约0. 01 y克/kg到约100mg/kg。在某些实施方案中，剂量范围从约0. 1 y g/ kg 达约 10mg/kg ;或约 0? 1 y g/kg ;约 0? 5 y g/kg ;约 1 y g/kg ;约 2 y g/kg ;约? 5 y g/kg ;约 10 y g/kg ;约 15 y g/kg ;约 20 y g/kg ;约 25 y g/kg ;约 30 y g/kg ;约 35 y g/kg ;约 40 y g/ kg ;约 45 y g/kg ;约 50 y g/kg ;约 55 y g/kg ;约 60 y g/kg ;约 65 y g/kg ;约 75 y g/kg ; 约85 y g/kg ;约100 y g/kg。在一些实施方案中，剂量为约50 y g/kg ;约100 y g/kg ;约 150 y g/kg ;约 200 y g/kg ;约 250 y g/kg ;约 300 y g/kg ;约 350 y g/kg ;约 400 y g/kg ;约 450 y g/kg ;约 500 y g/kg ;约 550 y g/kg ;约 600 y g/kg ;约 650 y g/kg ;约 700 y g/kg ;约 750 y g/kg ;约 800 y g/kg ;约 850 y g/kg ;约 900 y g/kg ;约 950 y g/kg ;约 lmg/kg ;约 2mg/ kg ;约 3mg/kg ;约 4mg/kg ;约 5mg/kg ;约 6mg/kg ;约 7mg/kg ;约 8mg/kg ;约 9mg/kg ;约 10mg/ kg〇
[0115] 施用方法
[0116] 可以递送本发明蛋白质或编码本发明多肽的核酸到受累关节的任何方法均可用。 在本发明中，组合物可胃肠外给药，例如注射，例如，关节内（例，至关节中），静脉内，肌内， 皮下注射；输注或植入，例如，在膜、基质、装置等中。注射、输注或植入时，可直接递送进入 合适的组织或关节，并且递送可以是直接浓注（bolus)递送或连续递送。在一些实施方案 中，递送可以在紧靠受累关节的合适组织中。在一些实施方案中，递送可通过扩散，或通过 定时释放浓注剂进行。在某些实施方案中，控释系统（例如，栗）可以放置在治疗靶（例如， 待施用多肽的关节）附近。在其他实施方案中，可选择组合物以用于摄入，例如，吸入或口 服递送。
[0117] 本发明治疗性多肽或编码本发明多肽的核酸也可以有效地与一种或多种其它活 性剂（例如，透明质酸或其衍生物或盐，生长因子（例如，FGF18，BMP7)，软骨发生剂（例如， 口服鲑鱼降钙素，SD-6010 (iNOS抑制剂），维生素D3 (胆钙化醇），胶原水解物，rusalatide acetate,鳄梨大豆非皂化物（ASU)，在W02012/129562中描述的化合物，kartogenin)，类固 醇，非留体抗炎药（NSAID)等）组合使用，取决于期望的治疗或效果，以提高或增强任一方 的疗效。该方法可涉及在同一时间将两种活性剂施用于患者，其中可以以包括两种活性剂 的单一组合物或药物制剂的形式施用，或施用两个不同的组合物或制剂，其中一个组合物 包括本发明多肽或编码本发明多肽的多核苷酸，而另一组合物包括第二活性剂（多种第二 活性剂）。包含本发明多肽或编码本发明多肽的多核苷酸的治疗性组合物的施用可以在第 二活性剂施用之前或之后，间隔从几分钟到几周。
[0118] 化合物制剂可作为溶液，悬浮液，凝胶，乳液，固体，或作为脱水或冻干粉存放在无 菌瓶中。可以在单位剂量或多剂量的密封容器中，如安瓿和小瓶中提供制剂。在一些实施 方案中，可以在单室或多室的预填充注射器（例如，液体注射器，lysosyringes)中提供制 剂。溶液和悬浮液可以从前述类型的无菌粉末，颗粒和片剂制备。
[0119] 本发明还提供包括本发明多肽或编码本发明多肽的核酸的试剂盒。在一个实施方 案中，提供用于生产单剂量给药单元的试剂盒。试剂盒包括：第一容器，其含有干燥的本发 明多肽或编码本发明多肽的核酸；和第二容器，其具有水性重构配方。在某些实施方案中， 一个容器包括单室预填充注射器。在其它实施方案中，包括多室预填充注射器形式的容器。 实施例
[0120] 下面的实施例用于举例说明，但不限制本发明。
[0121] 实施例1 :蛋白酶抗性Angptl3肽构建体
[0122] 构建各种N-端截断突变体以移除0-连接的糖基化并促进生物物理蛋白表征。为 鉴定抗蛋白酶的肽，将氨基酸取代引入到人Angptl3肽片段（相应于该肽C-端区）的不同 位置。图1显示了人Angptl3中的突变位置。构建体最初制备为带有His标签。这些突变蛋 白是：225-460K423Q (225KQ)，225-460S424T (225ST)，226-460K423Q (226KQ)，226-460K423S (226KS)，228-460K423Q (228KQ)，228-460S424T (228ST)，233-460K423Q (233KQ)，233-460K4 23S (233KS)，241-460K423Q (241KQ)，241-460K423S (241KS)，241-460Kdel (241Kdel)，242-4 60K423Q(242KQ), 242-460K423S(242KS)和 242-460Kdel(242Kdel)。
[0123] 带His-标签的蛋白在HEK Freestyle?细胞中表达，通过Ni-NTA柱层析法纯化。 还克隆了不带标签的C-端构建体，并通过先前描述的方法（Gonzalez R等PNAS 2010)纯 化。简言之，将具有信号序列（1-16)的靶蛋白克隆在具有巨细胞病毒启动子的哺乳动物 表达载体中。在ffiK 293Freestyle(Invitrogen)中DNA/PEI转染后96小时，收获含有分 泌的靶蛋白的培养基并通过Hi-Trap SP柱（GE Healthcare)纯化。蛋白在50mM MES (pH 6. 0)，125mM NaCl 到 50mM MES(pH 6. 0)，150mM NaCl 之间洗脱。SDS-PAGE 电泳确认纯化的 蛋白至少为95 %的纯度。
[0124] 抗蛋白酶抗性通过如下评估。制备的蛋白各10ng与胰蛋白酶以质量比8000:1 (蛋 白质：胰蛋白酶）室温孵育1小时，以进行限制性胰蛋白酶解。然后，加入乙酸使反应到达 pH 3.0,淬灭胰蛋白酶解反应。淬灭后的样品进行LC/MS分析。对应于C端43个氨基酸 (S424-E460)的质量的5min RP HPLC峰是相应野生型蛋白构建体的证据。该剪切位点与全 长野生型angplt3蛋白产生过程中观察到的剪切位点一样，即K423和S424之间。当剪切 位点处的赖氨酸突变为谷氨酰胺时，则缺少该峰。对肽构建体225KQ，228KQ，233KQ，233KS， 241KQ，和242KQ ;及野生型225肽，均进行了制备和分析。对于每一种构建体，当剪切位点 的赖氨酸突变为谷氨酰胺或丝氨酸时，或当423位的赖氨酸缺失时，对应于C端43个氨基 酸的质量的峰缺失。
[0125] 实施例2 :整联蛋白结合试验
[0126]a Vg 3整联蛋白体外检测制备的肽225KQ, 228KQ, 233KQ, 241KQ和242KQ与 a 3整联蛋白的结合。简言之，Maxisorp板用2 y g/mLa V0 3整联蛋白包被，加入不同 浓度的（所示）多肽构建体。通过加入抗_ANGPTL3mAb，之后加入辣根过氧化物酶缀合的山 羊抗小鼠IgG抗体，检测结合的肽。所有被测试的肽保留或改进了整联蛋白结合能力。从 结合数据确定了每个测试肽的EC5。值，结果如表2所示。
[0127] 表2 :ANGPTL3和工程化多肽构建体与整联蛋白的体外结合
[0128]
[0129]a 5 3 1整联蛋白体外检测制备的肽225KQ, 228KQ, 233KQ, 241KQ和242KQ与 a 50 1整联蛋白的结合。用2yg/mLa 50 1整联蛋白，如上所述包被板；加入不同浓度的 (所示）多肽构建体，如上所述进行检测。所有被测试的肽保留或改进了整联蛋白结合能 力。从结合数据确定了每个测试肽的EC 5。值，结果如表2所示。
[0130] 实施例3:构建体的功能分析
[0131] 细朐培养与分化。FACS分选原代人骨髓来源的间充质干细胞（hMSCs)，证明对于 ⑶29,⑶44,⑶166、⑶105而言>98%阳性，对于⑶45而言< 0. 1%阳性；2-8代的细胞用于 实验。人软骨定居MSC(hCR-MSCs)源于人原代关节软骨细胞，其被分离成单细胞、在MSCGM 中克隆生长并通过软骨形成、骨形成和脂肪形成性分化而验证为MSC。FACS分选细胞，证明 对于⑶166和⑶105而言>98%阳性。将hCR-MSC培养多达20代，未鉴定到细胞性质、生长 或分化速率的改变。
[0132]软骨形成。在生理和功能试验中评估本发明的肽构建体，以评价软骨形成活性。
[0133] 在此提供的工程化构建体来自ANGPTL3，其属于七个已识别的ANGPTL蛋白的 家族，这些ANGPTL蛋白的结构与血管生成素相似，但缺乏结合Tie2受体的能力，从而具 有不同的功能。ANGPTL蛋白质含有N端卷曲螺旋结构域（CCD)和C端纤维蛋白原样结 构域（FLD)，被认为受到其微环境的严格调控，与细胞外基质（ECM)如纤连蛋白和整联 蛋白相互作用。Conklin 等，Genomics 62 (3):477-482 (1999) ;Goh YY 等，Am J Pathol 177(6):2791-2803 (2010) ;GohYY 等 J Biol Chem 285(43):32999-33009 (2010)。 与 ANGPTL3最密切相关的ANGPTL家族成员，ANGPTL1 (全长和C-端结构域）和ANGPTL4 (全长 和C端结构域），的序列见表3 ;表5B展示了在这些家族成员的C端结构域之间的比对。表 5A提供了 ANGPTL1、ANGPTL4、以及其他血管生成素蛋白ANGPTL7、ANGPT1和ANGPT2在胞外 结构域和C-末端结构域上的序列同一性。ANGPTL3的C端结构域（CT)与CT ANGPTL1共享 37%的序列同一性，和(^4~6?114共享40%的序列同一性。
[0134] 依据Johnson, K.，等，（2012) Science336, 717的先前描述，体外诱导和评估基于 细胞的二维软骨形成。简言之，将原代人骨髓来源的间充质干细胞（hMSCs)接种于生长培 养基中，随后改为有或无构建体的软骨细胞形成性刺激培养基。
[0135] 固定孔并用罗丹明B染色（此时结节容易通过肉眼检测并通过光学显微镜捕获图 像），以最初获取结节形成的图像。为促进高通量的基于成像的检测和定量，采用与胶原非 特异结合的尼罗红染色软骨生成性结节。在Acumen eX3(高内涵成像装置）上，采用488 激光器激发，快速检测结节，从而量化尼罗红染色的结节。
[0136] 表3:ANGPTL家族序列
[0137] CN105025917A 说明书 29/45 页
[0138] 表4:ANGPTL家族成员蛋白的软骨形成
[0139]
[0140] 依据Johnson, K.，等，（2012) Science336, 717的先前描述，体外诱导和评估基于 细胞的二维软骨形成。简言之，将原代人骨髓来源的间充质干细胞（hMSCs)接种于生长培 养基中，随后改为有或无构建体的软骨细胞形成性刺激培养基，并培养7天或14天。然后 用甲醛固定细胞，洗涤后使用标准的免疫细胞化学技术染色，以检测主要软骨蛋白2A型前 胶原（PIIANP)(图2A)和II型胶原（图2B)。为检测II型胶原，用添加在透化溶液中的 0.2%胶原酶II (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ)消化细胞。如前所述，通过高内 涵成像（Image Express Ultra (Molecular Devices，Sunnyvale，CA))，利用多波长细胞评 分脚本（multi-wavelength cell scoring script)，对所检测的每种蛋白质，定量免疫焚 光。参见图2。通过如下方法制备细胞，监测聚集蛋白聚糖的表达：简言之，原代hMSC(5000 个细胞）接种于Griener 384孔板中。24小时后，移出生长培养基，替换为25y 1含1%FBS 的DMEM。然后将蛋白质构建体以所示剂量添加到各孔中，37°C培养3天。经10%福尔马林 固定细胞后，使用免疫细胞化学法检测聚集蛋白聚糖的表达。在ImageXpress U1 tra上进行 孔成像，利用多波长细胞评分脚本，n = 6/蛋白浓度，进行定量。图3b示例性显示了，相对 于对照（在无构建体的情况下，仅稀释剂刺激的细胞），WT野生型C端ANGPTL3 (225-460)、 工程化构建体242KQ或242Kdel、或全长ANGPTL1 (ANGPTL蛋白的相关家族成员）的结果。 在分别使用225WT，225KQ，226KQ，228KQ，233KQ，241KQ和242KQ构建体的实验中观察到类似 的结果。
[0141] 采用先前描述的分析试验和方法，在此针对其它ANGPTL相关家族成员，进行了软 骨形成分析试验。进行实验以检查是否密切相关的蛋白质可以赋予软骨形成活性、以及是 否该活性保留在该蛋白质的C末端中。ANGPTL1和ANGPTL4在结节形成试验中显示出活性； 然而，只有ANGPTL1在软骨形成试验中显示出对II型胶原的诱导。见表4。结节形成活性 和II型胶原诱导试验的结果总结在表4中。本文描述对ANGPTL1的其它表征。参见本实施 例的其它部分和图3-5。
[0142] 表5:人血管生成素样家族成员间的序列同源性
[0143] 5A:人血管生成素样家族成员间的序列同一性（E⑶或CTD)
[0144]
[0145] 5B:人血管生成素样家族成员的C-端结构域hANGPTLl (271-491)/ hANGPTL3 (241-460) AANGPTL4 (179-406)的序列比对
[0146]
[0147] RNA表达分析也用于评估软骨特异性蛋白的表达。简言之，在无血清DMEM，IX ITS 加构建体（所示）中，qRT-PCR hMSC在团块培养（pellet culture) (lxlO6细胞/团块）中 培养3,7，10,21天。每3天更换一次培养基。使用1?〇〇116 1^8111^5^161'，定量1^1131'；[(3；[11、 聚集蛋白聚糖、Sox9、IGF1、IFITM1、骨钙蛋白和X型胶原蛋白的mRNA表达（数据汇总自一 式两份重复进行的3次实验（n = 6))。图3A代表242KQ和225WT在第10天的表达数据。 对所有基因，基因表达数据在第3, 7和21天是相似的。
[0148] 全长ANGPTL3先前已经被证明在人和小鼠间充质干细胞中具有软骨形成活性。检 测了构建体在人、小鼠、大鼠和犬间充质干细胞中的活性，以证实其它物种交叉反应能力。 将来自小鼠、大鼠、人和狗的CR-MSC与如上所述构建体一起培养18天。固定培养物，使用标 准的免疫细胞化学技术染色，以检测软骨细胞特异性蛋白II型胶原；并使用高内涵成像， 定量II型胶原阳性细胞。对于评价的每个物种的细胞，证实了量化的II型胶原量的相似 倍数增加。
[0149]软骨保护。在功能试验中评价肽构建体,以评估软骨保护活性。
[0150]依据Johnson,K.，等，（2012)Science336, 717-721描述，实施离体糖胺聚糖（GAG) 释放抑制试验（指示基质损坏）。简言之，分离牛软骨，打孔成对称圆，并放入器官培养。在 存在或不存在蛋白构建体时，用20ng/ml TNFa和l〇ng/ml抑瘤素M(OSM)(炎性介质）处 理切片48小时以诱导软骨基质降解，由此鉴定糖胺聚糖（GAG)释放的抑制百分数。图4A 所示结果呈现了汇总自4个供体（n =12)、使用所示工程化构建体和WT225-460获得的结 果。
[0151]依据Johnson, K.，等，（2012)Science336,717-721 描述，实施体外一氧化氮（N0) 抑制试验（软骨保护的指标）。简言之，原代软骨细胞用所示蛋白质构建体处理48小时。 进行Greiss反应，以确定构建体对NO释放抑制的影响，显示在图4B中的结果呈现了以所 示工程化构建体和WT C端片段225-460获得的结果。图4C中的结果呈现了使用野生型C 端ANGPTL1、工程化ANGPTL3 242KQ或对照获得的结果。
[0152]纤维软骨形成的抑制。在添加抗坏血酸和存在或不存在(所示）构建体的情况 下，如上所述培养原代人关节软骨细胞14天以诱导肥大，并通过免疫荧光评价X型胶原的 表达。图5A中所示结果呈现了使用所示构建体225WT或242KQ得到的数据。图5B中所 示结果呈现了使用野生型C端ANGPTL1、工程化ANGPTL3 242KQ或242Kdel、或野生型C端 ANGPTL3片段225-460获得的数据。如通过X型胶原表达所检测到的，野生型或活性构建体 的存在导致对肥大情况下纤维软骨形成的抑制作用。
[0153]血管发牛。已经报道，ANGPTL3蛋白的WT C端结构域在体外和在体 内在大鼠角膜模型中具有血管发生活性和性质。参见Camenisch等，J. Biol. Chem. 277 (19) : 17281-17290 (2002)。为了解决体内施用C端ANGPTL3后诱导新血管的可能 危险，检查了体外血管发生试验。简言之，使用基础内皮细胞培养基，对原代人脐静脉内皮 细胞（HUVEC)实施血清饥饿过夜。然后，使用cell tracker green标记细胞，加入包埋了 蛋白构建体（所示）的预包被的matrigel板。在全长ANGPTL3(50ng/ml)或242KQ(50ng/ ml)或bFGF(50ng/ml)(作为阳性对照）存在下培养18小时后，使用高内涵成像，定量分支 点数目和形成的总血管长度，作为血管发生活性的量度。与存在全长ANGPTL3或阳性对照 下看到的效果相反，当细胞与242KQ -起孵育时