Tspan15在制备骨性关节炎诊断制剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及TSPAN15在制备骨性关节炎诊断制剂中的应 用。
【背景技术】
[0002] 骨性关节炎（osteoarthritis，0A)是一种随着年龄的增长而发生率明显增加的 退行性关节炎疾病，也是老年人关节疼痛和致残的主要原因。根据世界卫生组织的统计，膝 骨性关节炎在女性患病率中占第四位，随着年龄的增长，其患病率也明显上升，大于65岁 的人群中50%以上都有骨性关节炎的临床表现。目前对于骨性关节炎的治疗方法主要是 早期采用非手术治疗，止痛、保护和延缓软骨的退化；晚期软骨破坏严重，有剥脱或者游离 体，骨赘增生等，此阶段就要采用手术治疗，例如关节清理、截骨术或融合术、人工关节置换 术等，而漫长的保守治疗和昂贵的手术费用对于骨性关节炎这种慢性疾病尤不适合。因此， 明确0A的发病机制，找寻预防0A、早期干预并延缓软骨退变进程的方法就成为医学上亟待 解决的问题。
[0003] 发明人对7例骨性关节炎滑膜组织及4例对照样本进行高通量测序，结合生物信 息学方法进行基因筛选，在差异表达明显的基因中挑选出高表达的候选基因TSPAN15，现有 研究中并没有TSPAN15和骨性关节炎相关的报道，进一步，发明人进行了分子细胞生物学 方法验证，证实了TSPAN15在骨性关节炎组织中高表达，TSPAN15抑制剂可用于制备治疗骨 性关节炎药物。本发明提供了一种新的骨性关节炎的治疗靶点，具有重要的临床应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种骨性关节炎诊断制剂，所述骨性关节炎诊断制剂检测 TSPAN15基因和/或TSPAN15基因的表达产物。
[0005] 进一步，所述骨性关节炎诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法 检测骨性关节炎组织中TSPAN15基因的表达，优选的，所述的荧光定量PCR试剂盒中含有一 对特异性扩增TSPAN15基因的引物；所述的基因芯片中包括与TSPAN15基因的核酸序列杂 交的探针，更优选的，荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测TSPAN15基因的上游引物和下 游引物，上游引物序列为SEQIDN0. 9,下游引物序列为SEQIDN0. 10。
[0006] 进一步，所述的骨性关节炎的诊断制剂采用免疫方法检测骨性关节炎滑膜组织中 TSPAN15基因的表达产物，优选的，所述免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。
[0007] 进一步，所述检测TSPAN15表达产物的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所 述试剂盒中的抗体可采用市售的TSPAN15单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被 TSPAN15单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗 涤液，酶反应终止液等。
[0008] 进一步，所述检测TSPAN15蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采 用市售的TSPAN15单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技 术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区（T)喷点 有抗TSPAN15单克隆抗体、质控区（C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0009] 本发明的目的在于提供上述骨性关节炎诊断制剂在制备骨性关节炎诊断工具中 的应用。
[0010] 本发明的目的在于提供一种治疗骨性关节炎的制剂，所述制剂中含有抑制 TSPAN15基因的转录或表达的试剂或化合物。
[0011] 进一步，所述治疗骨性关节炎的制剂中含有激活TSPAN15的抑制基因、激活抑制 TSPAN15表达的蛋白、导入抑制TSPAN15转录或表达的siRNA、激活促进TSPAN15mRNA降解 的microRNA、导入促进TSPAN15蛋白降解的分子、抑制促进TSPAN15表达的因子及蛋白的表 达。
[0012] 优选的，所述治疗骨性关节炎的制剂含有下列中的一组或几组siRNA:SEQID NO. 1 和SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3 和SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 5 和SEQIDNO. 6。更优选 的，所述治疗骨性关节炎的制剂含有siRNA序列为SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6。
[0013] 本发明的目的在于提供上述治疗骨性关节炎的制剂在制备骨性关节炎治疗药物 或试剂中的应用。
[0014] 本发明的目的在于提供一种促进软骨细胞增殖制剂，所述促进软骨细胞增殖制剂 中含有抑制TSPAN15基因和/或TSPAN15基因的表达产物的化合物。
[0015] 进一步，所述促进软骨细胞增殖制剂中含有激活TSPAN15的抑制基因、激活抑制 TSPAN15表达的蛋白、导入抑制TSPAN15转录或表达的siRNA、激活促进TSPAN15mRNA降解 的microRNA、导入促进TSPAN15蛋白降解的分子、抑制促进TSPAN15表达的因子及蛋白的表 达。
[0016] 优选的，所述促进软骨细胞增殖制剂含有下列中的一组或几组siRNA:SEQID Ν0· 1 和SEQIDΝ0· 2、SEQIDΝ0· 3 和SEQIDΝ0· 4、SEQIDΝ0· 5 和SEQIDΝ0· 6。更优选 的，所述治疗骨性关节炎的制剂含有siRNA序列为SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6。
[0017] 本发明的目的在于提供上述促进软骨细胞增殖制剂在制备促进软骨细胞增殖工 具中的应用。
[0018] 为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基 因TSPAN15基因，进而通过分子细胞生物学方法验证了TSPAN15基因与骨性关节炎的关系： TSPAN15基因在滑膜组织中高表达，与骨性关节炎具有很好的相关性，可用于制备骨性关节 炎辅助诊断制剂，具有重要的临床应用价值。
[0019] 本领域人员熟知抑制基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种 和/或几种：通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因mRNA降解的microRNA、导入促进目的 基因编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。
[0020] RNA干扰（RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的 mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断 体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA 设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸 I丐共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子 脂质体试剂法等途径转染细胞。
[0021] 荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标 记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板 的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定 量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、 重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[0022] 基因芯片又称为DNA微阵列（DNAmicroarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚 合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的 靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵 列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸 探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量 检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是 快速简便；三是可同时检测多种疾病。
[0023] 酶联免疫吸附实验（ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标 记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体 等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作 步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和 生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶（HRP)或者碱性磷 酸酶（AP)。
[0024] 常用的免疫胶体金检测技术：（1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切 片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记， 使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。（2)免疫 胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合， 然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。（3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜 作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相 应的抗原或抗体。（4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶 体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本 垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固 定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留， 聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方 便。
[0025] 本发明的目的在于提供一种检测骨性关节炎的基因检测试剂盒，所述试剂盒检测 基因TSPAN15，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDN0. 9，下游引物序 列为SEQIDN0. 10。
[0026] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市