进行。组构成为:生理盐水滴眼组(对照)、化合物I的0.4%溶液滴眼组和化合物I的0.8%溶液滴眼组，滴眼为每天进行三次。将光凝固处理当天作为第O天，从第O天到第7天进行滴眼，在第7天制作脉络膜铺片，通过FITC-凝集素染色评价血管。具体来说，首先，将观察到出血、组织破坏等的斑点作为排除例，使用NIS-Elements AR Vers1n 4.13计算各采用例的斑点的CNV体积后，算出了每只眼的平均值(μπι3)。
[0111]2.结果和考察
[0112]结果表示于图9。相对于对照组(control)的CNV体积为109177±26399 μ m3，化合物I的0.4%和0.8%溶液滴眼组中，CNV体积分别为56408 ±9007 μ m3、88387 ±33678 μ m3，表明脉络膜血管新生受到了抑制。
[0113]实施例3对于Kimba小鼠的效果
[0114]为了在已知的作为视网膜血管新生发病的VEGF转基因小鼠的Kimba(trVEGF029)小鼠中考察化合物I的有效性，按照以下的方法进行了研究。
[0115]1.试验方法
[0116]A.在试验中使用的药剂和动物
[0117]与实施例1 一样配制了化合物I溶液:0.8%溶液(滴眼量:20 μ I)
[0118]实验动物:Kimba小鼠(从 L1ns Eye Institute Ltd.购入，每组 6 只)
[0119]B.药物给药方法和评价方法
[0120]对同一天出生的Kimba小鼠，从出生后I个月开始使用生理盐水(对照)或化合物I的0.8%溶液进行每天三次滴眼，在2周的滴眼后，在麻醉下，使用荧光眼底造影检查和光学相干断层扫描仪进行了评价。具体地说，首先，荧光眼底造影检查为:使用托吡卡胺滴眼，在将小鼠的瞳孔散瞳后，通过氯胺酮100mg/kg和赛拉嘆10mg/kg的腹腔内给药进行麻醉，接着，在腹腔内注入荧光素荧光眼底造影剂6 μ 1/g后，使用德国海德堡视网膜血管造影仪(HRA，海德堡，德国)进行了荧光眼底造影检查。另外，光学相干断层扫描仪的评价为:使用托P比卡胺滴眼使小鼠的瞳孔散瞳后，通过氯胺酮100mg/kg和赛拉嘆10mg/kg的腹腔内给药进行麻醉，使用Cirrus HD-OCT (Carl Zeiss Meditec，都柏林，CA)以5线、6mm长对X轴和Y轴方向进行拍摄，测量了平均最大视网膜厚度(统计分析采用学生t检验)。
[0121]2.结果和考察
[0122]结果表示于图10和图11。图10的上部为荧光眼底造影，下部为使用光学相干断层扫描仪得到的各组的具有代表性的摄影图像。另外，作为参考例，同时示出正常小鼠的图像(左侧，该实例的最大视网膜厚度为276 μπι)。表明相比于生理盐水滴眼中观察到水肿、视网膜呈现肥厚，化合物I的0.8%溶液滴眼中水肿受到抑制，视网膜厚度也为正常小鼠的水平。图11为将视网膜厚度的数值进行绘制后的图，相比于生理盐水滴眼组(对照)的平均最大视网膜厚度361.8±36.1 μ m，化合物I的0.8%溶液滴眼组为256.7±35.7 μπι，表明视网膜的肥厚具有显著性地受到抑制。
[0123]实施例4对于紧密连接的效果
[0124]为了考察化合物I对于细胞间屏障的有效性，按照以下的方法进行了研究。
[0125]1.试验方法
[0126]按照通常的方法，将小鼠脑微小血管内皮细胞b-END3(bEND.3:ATCC CRL_2299(注册商标))在3.5cm的培养皿中继代培养(9 X 15个细胞/培养皿)，从继代第6天开始试验。药物处理条件为:无处理例(图中标注为对照)、VEGF刺激例[(25ng/ml，24小时:图中标注为VEGF (25ng/ml 24小时)刺激]、化合物I (3 μ M或30 μ M)预处理(3小时)后VEGF刺激例[25ng/ml，24小时:图中标注为VEGF+化合物I (3 μ M 3小时)预处理或VEGF+化合物I (30 μ M 3小时)预处理]、IL-6刺激例[10ng/ml，24小时:图中标注为IL_6(10ng/ml24小时)刺激]和化合物I (30 μ Μ)预处理(3小时)后IL-6刺激例[10ng/ml，24小时:图中标注为IL-6+化合物I (30 μ M 3小时)预处理]共计5个实例或6个实例。
[0127]试验后的细胞按照以下顺序进行免疫染色，对紧密连接蛋白-5(Claudin-5)或纤维状肌动蛋白(F-Actin)的表达进行了评价。也就是说，将试验后的细胞在常温下使用100 %甲醇处理5分钟，再使用50 %甲醇处理5分钟，使用PBS进行清洗(5分钟X 2次)。接着，使用棉棒在盖玻片上整理，使用Dako免疫组化笔在周围画圈，在10%正常山羊血清(10%正常山羊血清即用型(Invitrogen))中进行封闭(30分钟，常温)，在4°C放置一夜。将兔抗紧密连接蛋白-5抗体(兔抗-Claudin-5(Invitrogen34-1600))或兔抗纤维状肌动蛋白抗体(兔抗F-actin (B1ssusa bs_1571R))的25倍稀释液滴下50-70 μ I后，使用PBS清洗(10分钟Χ3次)，进行了一级处理。将其在常温下遮光静置60分钟，使用经AlexaFluo488(注册商标)标记的抗兔 IgG FITC (Alexa Fluo488anti_Rabbit IgG FITC)的 200倍稀释液进行二级抗体处理后，使用PBS进行清洗(10分钟X3次)。使用DAPI将核进行染色，接着使用封片剂Crystal Mount盖上盖玻片，使用显微镜(X400倍)进行了摄影。关于紧密连接蛋白-5的结果表示于图12，关于纤维状肌动蛋白的结果表示于图13。
[0128]2.结果和考察
[0129]Claudin-5的免疫染色结果表示于图12，F-Actin的免疫染色结果表示于图13。如由图12表明的那样，由VEGF或IL-6刺激导致的Claudin-5表达下降通过化合物I的预处理得到改善。另外，如由图13表明的那样，由VEGF或IL-6刺激而产生的F-Actin的聚合通过化合物I的预处理得到抑制。因此，表明可以期待化合物I对细胞间屏障的破坏具有抑制效果。
[0130]工业实用性
[0131]本发明的(S)-(-)-1-(4-氟-5-异喹啉磺酰基)-2_甲基-1，4-高哌嗪或其盐或它们的溶剂化物具有优秀的血管新生抑制作用，作为用于眼底疾病、特别是糖尿病视网膜病变或年龄相关性黄斑变性的预防或治疗的医药是有用的。
【主权项】
1.以(S)-(-)-1-(4-氟-5-异喹啉磺酰基)-2-甲基-1，4-高哌嗪或其盐或它们的溶剂化物作为有效成分的眼底疾病的预防或治疗剂。2.根据权利要求1所述的预防或治疗剂，其中，所述眼底疾病为糖尿病视网膜病变。3.根据权利要求1所述的预防或治疗剂，其中，所述眼底疾病为糖尿病黄斑水肿。4.根据权利要求1所述的预防或治疗剂，其中，所述眼底疾病为年龄相关性黄斑变性。5.根据权利要求1-4任一项所述的预防或治疗剂，所述预防或治疗剂为滴眼剂。6.用于预防或治疗眼底疾病的医药组合物，所述医药组合物含有(S) - (-)-1-(4-氟-5-异喹啉磺酰基)-2-甲基-1，4-高哌嗪或其盐或它们的溶剂化物以及药学上允许的载体。7.根据权利要求6所述的医药组合物，其中，所述眼底疾病为糖尿病视网膜病变。8.根据权利要求6所述的医药组合物，其中，所述眼底疾病为糖尿病黄斑水肿。9.根据权利要求6所述的医药组合物，其中，所述眼底疾病为年龄相关性黄斑变性。10.根据权利要求6-9任一项所述的医药组合物，所述医药组合物为滴眼剂。11.滴眼药，所述滴眼药含有(S)- (-)-1-(4-氟-5-异喹啉磺酰基)-2-甲基-1，4-高哌嗪或其盐或它们的溶剂化物以及滴眼药中允许的载体。12.眼底疾病的预防或治疗方法，其特征在于，给予有效量的(S)-(-)-1-(4-氟-5-异喹啉磺酰基)-2-甲基-1，4-高哌嗪或其盐或它们的溶剂化物。13.根据权利要求12所述的方法，所述给予为滴眼给药。14.(S)-(-)-1-(4-氟-5-异喹啉磺酰基)-2-甲基-1，4-高哌嗪或其盐或它们的溶剂化物用于制备眼底疾病的预防或治疗剂的用途。15.根据权利要求14所述的用途，其中，所述眼底疾病的预防或治疗剂为滴眼药。
【专利摘要】本发明提供用于眼底疾病、特别是糖尿病视网膜病变或年龄相关性黄斑变性的预防或治疗的药剂。以(S)-(-)-1-(4-氟-5-异喹啉磺酰基)-2-甲基-1,4-高哌嗪(以下表示为化合物1)或其盐或它们的溶剂化物作为有效成分的眼底疾病的预防或治疗剂。
【IPC分类】A61P27/02, A61K31/496
【公开号】CN105050600
【申请号】CN201480013090
【发明人】石桥逹朗, 中尾新太郎, 有田量一, 水野宪, 土浦暁史
【申请人】国立大学法人九州大学, 兴和株式会社
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2014年3月3日
【公告号】WO2014174747A1