蛋白酶k在皮肤保健和化妆品领域中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及天然蛋白酶K和蛋白酶K突变体在美容、化妆品行业的应用。更具体 而言，本发明涉及天然蛋白酶K及经过基因改造的突变型重组蛋白酶K在用于去除老化角 质细胞的美容、化妆品行业中的应用。
【背景技术】
[0002] 前瞻产业研究院发布的《2013-2017年中国化妆品终端渠道建设与投资前景分析 报告》数据显示，2008-2012年，我国化妆品行业的市场规模总体上呈逐年上升态势。2008 年，我国化妆品行业的市场规模仅为465. 3亿元；到2012年，已上升为近843亿元,5年 内增长了 80%多。从增长速度来看，受金融危机的影响，2008年和2009年的增速较缓， 2010-2012年的增速持续上升，2012年达到20. 55%。从这些数据可以看出，化妆品产业的 发展创新仍大有可为。
[0003] 由于蛋白酶安全无毒素，对动植物蛋白、多肽具有较强的水解能力，目前在化妆品 行业，已存在关于木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的应用报道。
[0004] 例如，目前已经应用于皮肤美容的木瓜蛋白酶通过作用于人体皮肤老化角质层， 促使其分解、退化、去除，达到促进细胞生长的效果；木瓜蛋白酶还可直接将深褐色的酪蛋 白水解为淡色或无色的酪氨酸，水解物在皮肤表层形成一层氨基酸衍生物薄膜，使皮肤保 持润湿与光滑。
[0005] US6846485B2中则公开了来源于鱼类的丝氨酸蛋白酶在药物和化妆品方面的应 用。具体而言，该文献公开了用从鱼提取的丝氨酸蛋白酶（包括从鳕鱼（如大西洋鳕鱼） 中提取的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）治疗各种疾病和紊乱（如炎性疾病，由病毒、细菌和真 菌引起的传染性疾病等）以及含有这些蛋白酶的药物组合物。
[0006] 蛋白酶家族中的蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，能够消化富含二硫键的天然角 蛋白，来源于林伯氏白色念球菌（Tritirachium album limber) (Ebeling W.等，Eur J Biochem. 1974Augl5 ;47(1) :91-7)。蛋白酶K最大的特点在于对天然蛋白质具有广谱高效 的切割能力，是现有蛋白酶中活性最高的一种。该酶偏好于切割脂肪族氨基酸和芳香族氨 基酸，特别是丙氨酸的羧基端肽键。此外，蛋白酶K稳定性非常好，在pH4~pH12、温度范 围20°C~65°C的条件下均有活性，在多种能够使蛋白质变性的化学试剂（如SDS、尿素、螯 合剂（如H)TA)及巯基试剂（如胰蛋白酶抑制剂或糜蛋白酶抑制剂））中也具有切割蛋白 质的能力。亦即，在其它蛋白酶种类已经失活的复杂溶液缓冲条件下，蛋白酶K仍然具有活 性。
[0007] 鉴于此特性，蛋白酶K在洗涤、制革和食品饲料行业具有替代现有蛋白酶，实现更 高效和低成本的潜在能力。近年来，蛋白酶K的应用不仅仅局限在医疗诊断及科研领域。在 实现规模化工业生产的前提下，蛋白酶K还可以替代作用范围较窄的其它蛋白酶，应用于 工业制革、造纸、饲料等行业中。另外，蛋白酶K也可以替代传统的可能存在污染的化学方 法处理原材料，去除不必要的蛋白质杂质。
[0008] 尽管蛋白酶K具有以上出色活性，但目前国内外未见蛋白酶K应用于美容、化妆品 行业的报道。
【发明内容】
[0009] 皮肤分为表皮、真皮及皮下组织。皮肤的表皮又分为五层，从下往上依序是基底 层、棘状细胞层、颗粒层、透明层及角质层。其中，皮肤基底层是皮肤细胞的"发源地"，新生 的皮肤细胞随着其结构和功能的不断成熟、分化，逐步离开基底层，向外层表皮移动，变成 棘细胞，再变成粒细胞，最后完全角化成为角质细胞，然后逐渐向角质层最外面移动，直至 从皮肤表面脱落。角质层则由多层扁平的角质细胞组成，细胞已完全角化、干硬，无细胞核 和细胞器，细胞轮廓不清。皮肤表面角质层厚，皮肤会失去光泽，灰暗、脱皮、产生皱纹、长痘 等。
[0010] 本发明人通过深入研究，发现蛋白酶K具有和木瓜蛋白酶类似的作用，能够有效 地去除皮肤老化角质层，从而使皮肤恢复细嫩和光泽；此外，蛋白酶K在室温条件下更加稳 定，其作用在极端pH、盐离子、除垢剂等不利于其它蛋白酶的情况下仍然十分有效。据文献 报道，蛋白酶K是所有蛋白酶中活性最高的品种，所以蛋白酶K在用量较少的情况下也能达 到与其它蛋白酶相同的效果。较少的用量意味着可以减少可能的过敏反应并增加液体和 半固体化妆品的稳定性。此外，蛋白酶K还具有很高的安全性，能够根据需要选择性地去除 老化角质层，保留部分角质层及全部基底层，不会伤及剩余的皮肤表皮层和真皮层。
[0011] 进而，本发明人发现，除天然蛋白酶K外，只要保留了天然蛋白酶K的活性，基因突 变型重组蛋白酶K、尤其是比天然蛋白酶K的活性更高的基因突变型重组蛋白酶K在皮肤老 化角质层去除方面也能够显示出出色的效果。
[0012] 基于以上研究，本发明提供了天然蛋白酶K及其突变体在制备用于去除老化角质 细胞的化妆品组合物中的用途，从而完成了本发明。
【具体实施方式】
[0013] 本文中使用的术语"天然蛋白酶K"具有与"野生型蛋白酶K"相同的含义，用于描 述自然界中天然存在的蛋白酶K。此外，术语"基因突变型重组蛋白酶K"及"蛋白酶K突变 体"在本文中可互换使用。
[0014] 在本文中，当提及术语"蛋白酶K "时，旨在涵盖天然蛋白酶K和蛋白酶K突变体。
[0015] 天然蛋白酶K前体由384个氨基酸组成（SEQ ID NO. 1，UniProtKB/ Swiss-Prot :P06873. 2)，包括15个氨基酸长度的信号肽、90个氨基酸长度的前肽及279个 氨基酸长度的成熟蛋白酶K。
[0016] 根据本发明的一个实施方式，可将天然蛋白酶K用于制备去除老化角质细胞的化 妆品组合物。根据本发明的一些实施方式，所述天然蛋白酶K的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示，该氨基酸序列由369个氨基酸组成，包括90个氨基酸长度的前肽及279个氨基酸长 度的成熟蛋白酶K。
[0017] 根据本发明的另一个实施方式，只要蛋白酶K突变体保留了天然蛋白酶K的活性， 便可将此类蛋白酶K突变体用于制备去除老化角质细胞的化妆品组合物。根据本发明的一 些实施方式，所述蛋白酶K突变体可以是CN102839165A中所公开的蛋白酶K突变体，其在 天然蛋白酶K的基础之上具有如下突变：
[0018] (1)将天然蛋白酶K氨基酸序列（SEQ ID NO. 2)中第151位的Y突变为A、第208 位的K突变为H、第273位的S突变为T、第293位的G突变为A、第332位的K突变为R、 第337位的S突变为N ;任选地，还进行下述任意1种以上的突变：
[0019] (2)将第123位的S突变为A ;
[0020] (3)将第180位的L突变为I。
[0021] 在本发明中，"123 位"、"151 位"、"180 位"、"208 位"、"273 位"、"293 位"、"332 位" 及"337位"并不是必然表示从所述蛋白酶K的N端起的绝对位置，而是表示与SEQ ID NO. 2 的氨基酸序列相比的相对位置。例如，在含有SEQ ID NO. 2的氨基酸序列的蛋白酶中，当该 蛋白酶123位的N端某一位置缺失了一个氨基酸，上述的123位即变为122位。即使在这 一情况下，所述从N端残基起计数为122位的氨基酸在本发明中仍为" 123位"的氨基酸。 通过将感兴趣的蛋白酶的氨基酸序列与SEQID NO. 2的氨基酸序列进行比对而确定所述氨 基酸的相对位置。
[0022] 下文中，将上述蛋白酶K突变体分别称为mutProK6、mutProK7_l、mutProK7_2及 mutProK8 (参见图 1)。
[0023] 可通过本领域技术人员已知的任何方法获得用于制备本发明化妆品组合物 的天然蛋白酶K以及基因突变型重组蛋白酶K(例如但不限于mutProK6、mutProK7-l、 mutProK7-2和mutProK8)。优选地，可采用CN102839165A中所公开的制备方法。
[0024] 在本发明的化妆品组合物的制备中，除蛋白酶K外，可使其包含化妆品上可接受 的其它活性剂，例如但不限于，具有抗老化活性的物质；对皮肤具有脱色、美白或清洁活性 的物质；具有减肥活性的物质；具有保湿活性的物质；具有镇定、舒缓或放松活性的物质； 具有刺激皮肤微循环以改善特别是面部肤色光泽的活性的物质；用于对油性皮肤进行护 理、具有皮脂调节活性的物质；用于清洗或净化皮肤的物质；具有抗自由基活性的物质；以 及它们的任意混合物。
[0025] 在本发明的化妆品组合物的制备中，还可使其包含至少一种化妆品上可接受的辅 剂，例如但不限于，色素、表面活性剂、粘性剂、芳香剂、pH调节剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定 剂、增溶剂以及它们的任意混合物。
[0026] 在本发明的实施方式中，所述化妆品组合物可为精华素、乳液、霜、水凝胶等，例 如可为面膜、水包油乳剂、无水组合物，或可为条状物形式、贴剂形式，或为唇膏、睫毛膏或 粉底型化妆产品的形式。
[0027] 根据本发明的一些实施方式，该化妆品组合物可通过局部施用到个体皮肤进行施 用。根据本发明一个优选的实施方式，该化妆品组合物可施用到超过35岁、超过40岁、超 过45岁、超过50岁、超过55岁乃至超过60岁的个体的皮肤上。
[0028] 在本公开的基础之上，本领域技术人员能够根据需要确定化妆品组合物中蛋白 酶K的含量。例如，当蛋白酶K含量过低时，可能难以有效去除皮肤老化角质层；当蛋白酶 K含量过高时，可能会导致不必要的成本提高。根据本发明的一些实施方式，在所制备的 用于去除老化角质细胞的化妆品组合物中，蛋白酶K的浓度可以为80ii g/ml-100ii g/ml、 80 u g/ml-150 u g/ml、80 u g/ml-200 u g/ml ;或者可以为 100 u g/ml-150 u g/ml、100 u g/