一种夏枯草提取物及其用图
【专利说明】
[技术领域]
[0001]本发明涉及一种中草药提取物，特别是一种夏枯草提取物；尤其涉及该提取物为活性成份在制备治疗埃博拉病毒(EBOV)感染药物用途。
[【背景技术】]
[0002]夏枯草是最常用的中药材之一，唇形科植物夏枯草(Prunella.Vulgaris L.)的干燥果穗，具有清火、明目、散结、消肿的功效。夏枯草中的降糖素具有降血糖的功效，通过修复胰岛细胞，使胰岛素分泌正常，从而达到治疗目的；醇提物对3对小鼠血糖的影响已经得到实验验证，该提取物具有改善糖耐量，对抗肾上腺素提高血糖的作用；熊果酸及冉生物对人体肿瘤细胞具有明显的细胞毒作用，具有明显的抗肿瘤作用；夏枯草皂苷具有明显的抗艾滋病作用；夏枯草总苷具有抗心肌梗死、降低血压的保护作用；其醇提物还具有治疗风湿性关节炎的作用。此外，到目前为止，还没有发现夏枯草其它新的提取物及新用途。
[0003]埃博拉病毒(EBOV)通过引起严重的出血热从而造成感染者高达90%的病死率。目前，国际上仍没有被批准的有效抗埃博拉病毒治疗和预防药物_。因此，新的抗病毒疗法及预防药物的开发对埃博拉病毒爆发的国家及地区显得尤为重要。通过阻断EBOV进入宿主细胞来抵抗感染是一个有吸引力的策略，有限的EBOV糖蛋白特异性单克隆抗体(MAb)已经被证明可以通过阻断病毒进入来抑制EBOV感染。同时，一些抗病毒药物正快速在EBOV流行国家进行人体试验。然而，这仍是个未知数。因此，开发来源丰富，成本低廉，低毒性的抗EBOV药物是很重要和迫切的。中国传统中药植物提取物是重要的抗病毒活性成分的来源。它们获取方便、成本低廉的天然优势，使其对低收入国家EBOV病毒的治疗和预防显得更为重要。
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【发明内容】
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[0004]本发明的目的是提供了一种夏枯草提取物，具有显著的抗埃博拉病毒(EBOV)感染的活性。
[0005]本发明的另一发明目的是提供该新的夏枯草提取物的医药用途。
[0006]本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:
[0007]—种夏枯草提取物，包括:主要成分是水溶性提取物中的多糖分子CHPV。
[0008]本发明还公开了以上述夏枯草提取物作为活性成份在制备治疗EBOV病毒感染药物(水溶性药物，胶囊或片剂)中的应用。
[0009]进一步的，本发明还公开了所述夏枯草提取物作为活性成份在制备预防EBOV病毒感染药物(水溶性药物，胶囊或片剂)中的应用。
[0010]进一步的，本发明还公开了上述夏枯草提取物作为活性成份配合EBOV中和抗体或抗EBOV化学化合物制成混和水溶性药物，胶囊或片剂在制备预防或治疗EBOV病毒感染药物中的应用。
[0011]进一步的，本发明还公开了所述夏枯草提取物作为活性成份制备成外用喷雾药剂和膏药用于预防病毒从破损的黏膜或伤口侵入。
[0012]通过采用本发明的技术方案，经药效学实验证明，本发明所述夏枯草提取物具有显著的抗EBOV活性，其口服生物利用度高，以及丰富的天然资源优势，使这种天然药草提取物及其制备的药品具有有很大的潜力可用于治疗患者感染EBOV的疾病。
[【附图说明】]
[0013]图1A为建立EBOV假病毒系统示意图。
[0014]图1B为埃博拉病毒膜糖蛋白I (EBOV-GPl)，埃博拉病毒膜糖蛋白前体(preGPer)和P24蛋白在转染后细胞中的表达和GPI，P24在VLP中的装配图。
[0015]图1C为等量的埃博拉膜糖蛋白包装的慢病毒样颗粒(GP+- VLP)与无埃博拉糖蛋白包装的慢病毒样颗粒(GP — VLP)病毒颗粒在293T细胞中的感染性分析图。
[0016]图1D为埃博拉病毒膜糖蛋白(EBOV-GP)单克隆抗体2G4抑制埃博拉膜糖蛋白包装的慢病毒样颗粒(EB0V-GP-VLP)在293T细胞中的感染分析图。
[0017]图1E为EB0V-GP-VLP在不同细胞中感染能力对比图。
[0018]图2A为6种传统抗病毒中药及其相关活性成分对比图。
[0019]图2B为不同中药提取物的抗病毒活性对比图。
[0020]图3A为通过在不同时间点加CHPV来区分CHPV在293T细胞中抑制EB0V-GP-VLP的主要作用阶段图。
[0021]图3B、图3C为CHPV通过直接作用慢病毒颗粒(VLP)来抑制病毒进入的示意图。
[0022]图3D为排除CHPV可以被超离沉淀的可能性示意图。
[0023]图3E为CHPV通过作用EB0V-GP-VLP抑制病毒感染图。
[0024]图4A为在人脐静脉内皮细胞(HUVECs_中分析CHPV对EB0V-GP-VLP感染的抑制作用图。
[0025]图4B为在HUVECs中分析CHPV的细胞毒性图。
[0026]图4C为在巨噬细胞中分析CHPV对EB0V-GP-VLP感染的抑制作用图。
[0027]图5A为分析在293T细胞中单克隆抗体2G4与CHPV共同抑制EBOV-GP介导感染的抑制作用图。
[0028]图5B、图5C为巨噬细胞中CHPV土MAb2G4抑制EB0V-GP-VLP的感染效果图。
[0029]图为CHPV或MAb2G4在野生型EBOV感染中的抑制作用图。
[【具体实施方式】]
[0030]下面结合附图和实施例对本发明作进一步的阐述:
[0031]1、EBOV假病毒系统的建立
[0032]通过在293T细胞中共转染编码有Gaussia荧光素酶基因的HIV病毒载体，辅助包装质粒(PCMVAR8.2)，以及埃博拉病毒包膜糖蛋白(EBOV-GP)表达质粒，来建立以埃博拉膜糖蛋白包装的慢病毒样颗粒(EBOV-GP-VLPs)。图1A所示为以EBOV-GP包装的慢病毒样颗粒的产生。将标记Gaussia萤光素酶基因(GLUC+)的慢病毒载体，Δ 8.2和pCAGGSZEBOV_GP进行共转染在293T细胞中。在上清液中产生的病毒颗粒进行超离浓缩后，重悬浮保存备用。同时，HIV的Env+VLP或无任何包膜糖蛋白的VLP分别作为对照。所述的Gaussia萤光素酶(GLUC)是生物发光酶，其能够被分泌到细胞外的培养基中，通过直接测量在培养基中的GLUC活性来分析病毒的复制。
[0033]为了检查EBOV-GP在的细胞和VLP中的表达和装配，病毒产生细胞和病毒裂解物，小鼠产生的EBOV-GPl特异性单抗通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析。在图1B中，PreGP(IlOkDa)和GPl (120_130kDa)两条带在EBOV-GP转染的细胞中清楚地检测到，其分子量与先前所描述的大小相符，为EBOV-GP ο正如本发明所预期的，大量的GPI在EBOV-GP-VLP被检测出来，表明EBOV-GP可以有效地装配在VLP。同时，用兔源的P24抗体，艾滋病毒衣壳Gag p24蛋白在所有细胞裂解物和EBOV-GP的VLP的样品中被检测出来(图1B，下图)。
[0034]为了测试EBOV-GP-VLP是否能够有效感染293T细胞，等量的EBOV-GP-VLP或无包膜VLP (由HIV Gagp24调整)与293T细胞处理4小时。通过测定感染48小时后的上清液中的GLUC活性来评价病毒感染效率。结果表明，EBOV-GP-VLP的能够有效感染293T细胞，而没有病毒包膜蛋白的VLP并不能产生任何GLUC活性(图1C)。
[0035]为了进一步测试VLP的感染是否是由EBOV-GP介导的，之前描述的可以靶向埃博拉病毒糖蛋白的单克隆抗体(MAbs) 2G4可用来有效的阻断EBOV-GP-VLP进入宿主细胞。简言之，EBOV-GP-VLP与2G4混合处理30分钟，然后加入到293T细胞中。在48小时后，通过GLUC活性进行测定感染，结果表明，在293T细胞中EBOV-GP-VLP感染性明显随着2G4剂量增加而降低(图1D)。2G41.72微克/毫升为半数抑制浓度。鉴于EBOV-GP-VLP感染可由单抗显著中和，这清楚地表明，EBOV-GP介导了 VLP的进入和感染。
[0036]同时，EBOV-GP-VLP的感染能力在不同类型的细胞中被评价，包括人宫颈上皮细胞(HeLa细胞)，CD4+TZMbl细胞，人肺癌细胞(A549)