给药与照射组(IR+CQ)小鼠平均体重略有减小，其余各组小鼠平均体重均升高(图3)，照射加连续给药组瘤体积显著减少(如图4、5所示)，联合处理组的肿瘤重量也显著降低(如图6所示)。上述结果说明，从形态上观察，氯喹联合重离子照射有显著的抗肿瘤作用。
[0064]2.电子显微镜观察肿瘤细胞自噬
[0065]将预处理的肿瘤组织用2%的四氧化锇固定，梯度乙醇和环氧丙烷脱水，LX-112包埋，切片机切片，铜网捞出，0.2%柠檬酸铅和1%的醋酸铀染色，透射电镜观察。以细胞内出现闭合囊泡结构，且该囊泡与细胞质相比有色差，囊泡中有内含物，体积超过200nm且具有膜包裹为自噬阳性，我们发现，与对照组相比，照射组肿瘤组织切片中可看到明显的自噬现象。
[0066]3.组织病理学检测
[0067]苏木精伊红(HE)染色:将组织切片在二甲苯中脱蜡2次，每次10分钟，移入无水乙醇中2次，每次5分钟，然后依次移入95 %、70 %、50 %乙醇中各2次，每次2分钟，最后用蒸馏水小心冲洗，移入苏木精染液染色5?10分钟，冲洗玻片上多余染液，0.5?1%盐酸酒精(70%酒精配制)分色数秒钟，镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止。流水冲洗15?30分钟，移入伊红染液染色1?5分钟，依次经95%、100%酒精脱水各2次，每次2?3分钟，二甲苯透明2次，每次10分钟，擦去切片周围多余二甲苯，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固，干燥后用显微镜观察。
[0068]小鼠肿瘤组织切片的HE染色结果表明，与对照组相比，联合处理组的肿瘤组织比较松散，能观察到更多的细胞形态异常，并可见染色质固缩、细胞缩小和碎裂等凋亡特征(如图7所示)，可见氯喹联合重离子处理，可引起肿瘤组织发生明显的组织病理学变化。
[0069]4.TUNEL法检测细胞凋亡
[0070]将组织切片用二甲苯浸洗2次，每次5分钟；用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次，每次3分钟，PBS漂洗2次；用Proteinase K工作液处理组织15?30分钟，在21?37°C或者加细胞通透液8分钟，PBS中漂洗两次，吸干样品周围区域；加50ul TUNEL反应混合液(现配)在样品上，加盖玻片或封口膜在37°C湿润黑暗环境中温育60分钟，PBS冲洗3次；吸干样品周围区域，向样品加50ul Converter-POD，加盖玻片或封口膜在37°C湿润黑暗环境中温育30分钟，PBS冲洗3次；加50?lOOul DAB底物，15?25°C温育10分钟，PBS冲洗3次；加玻璃盖玻片(用PBS或甘油封片)光镜下观察。在光镜观察前可进行复染，苏木精或甲基绿染色数秒，立即用自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
[0071]如图8所示，对照组细胞凋亡(TUNEL阳性，深棕黄色点)率较低，单纯给药组凋亡率略有升高，氯喹联合重离子处理组的凋亡率显著增加。
[0072]5.Western-blot检测自卩蜜和凋亡相关蛋白
[0073]组织蛋白提取:把肿瘤组织剪切成细小的碎片，取适量的裂解液，使用前数分钟内加入PMSF (终浓度为ImM)，按照每20mg组织加入150?250 μ 1裂解液的比例加入裂解液，通过超声处理使组织充分裂解，12000rpm离心5分钟，取上清即为组织蛋白，用标准BCA法测蛋白浓度，并向蛋白中加入上样缓冲液，金属浴煮沸15分钟，再用Western-blot实验检测相关蛋白的表达情况。
[0074]与对照组相比，单纯照射可提高自噬早期标志蛋白LC3-1I蛋白的表达，氯喹联合照射处理进一步提高了该蛋白的表达量；联合处理提高了自噬晚期标志蛋白P62的表达，这是因为重离子照射诱导了细胞自噬的发生，而氯喹又有效的抑制了自噬的晚期过程，阻止了自.流(autophagy flux)的畅通，从而出现LC3-1I和P62蛋白表达量同时升高的现象。联合处理组的促凋亡蛋白Bax表达高于单纯照射组，Caspase-3作为重要的凋亡执行者分子，其表达也有相同的趋势，照射组的Bax和Caspase-3均高于对照组。抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平并未受到照射或者氯喹的影响。上述结果说明了氯喹联合照射处理有效诱导了肿瘤细胞的凋亡。
[0075]以上的实验结果证明使用抑制自噬提高离子束治疗肿瘤疗效的氯喹类药物后，较单独的离子束照射具有更显著抑制肿瘤细胞生长、肿瘤组织生长的效果，所以，氯喹类自噬抑制剂可以增强包括质子束和重离子等在内的离子束照射效果，可增强粒子束治疗的疗效。
[0076]以上的实验结果证明所述的肿瘤联合治疗方法，存在氯喹类自噬抑制剂和离子束照射的协同作用，增强了包括质子束和重离子束在内的离子束对肿瘤组织的照射损伤。
[0077]以上的实验结果证明所述的抑制自噬提高离子束治疗肿瘤疗效的氯喹类药物，可用于实体瘤的治疗，包括头颈部癌症(臂、副鼻腔、唾液腺等)、非小细胞肺癌、肝癌、前列腺癌、骨和软组织肉瘤、直肠癌、恶性黑色素瘤、脑肿瘤、胰腺癌、食道癌、大肠癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、主腹膜癌等癌症的治疗。
[0078]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种利用自噬抑制剂氯喹提高离子束治疗肿瘤疗效的方法，其特征是使用氯喹类自噬抑制剂和离子束照射，其采用的氯喹类自噬抑制剂对肿瘤进行预处理，再进行离子束照射，抑制肿瘤的生长；具体包括如下步骤: (1)药物配制:将氯喹类自噬抑制剂溶解在生理盐水中，制成药物溶液，将该溶液过滤待用； (2)药物注射:通过注射给药，剂量为2?50μ Μ或者20?500mg kg 'day \注射后4小时进行离子束照射； (3)离子束照射:采用离子束治疗装置，通过离子加速器将离子源产生带电离子加速到速度约为光速的70%，通过束流输运线传输到治疗室，再使用照射设备调整照射野与肿瘤形状一致，进行肿瘤治疗。 (4)监测:照射完毕后，持续监测进食情况和体重，并测量肿瘤体积。2.如权利要求1所述的利用自噬抑制剂氯喹类药物提高离子束治疗肿瘤疗效的方法，其特征在于:所述的第一步骤中的氯喹类自噬抑制剂包括氯喹、羟氯喹和4-氨基喹啉，氯喹类自噬抑制剂用药量为2?50 μΜ或20?500mg kg May ^3.如权利要求1所述的一种利用自噬抑制剂氯喹类药物提高离子束治疗肿瘤疗效的方法，其特征在于:所述的第二步骤和第三步骤中的离子束包括质子束和重离子束，所述的重离子束包括氦(He)、锂(Li)、铍(Be)、硼⑶、碳(C)、氮(N)、氧(0)、氟(F)、氖(Ne)、硅(Si)、氩(Ar)、铁(Fe)、铜(Cu)、铀(Pt)、金(Au)离子，离子束照射使用剂量范围:单次照射剂量为2?8Gy，总照射剂量为30?80Gy。4.如权利要求3所述的一种利用自噬抑制剂氯喹类药物提高离子束治疗肿瘤疗效的方法，其特征在于:所述的重离子束优选碳离子束和氧离子束。5.如权利要求3所述的一种利用自噬抑制剂氯喹类药物提高离子束治疗肿瘤疗效的方法，其特征在于:所述的离子束照射的次数为1?35次。6.如权利要求5所述的一种利用自噬抑制剂氯喹类药物提高离子束治疗肿瘤疗效的方法，其特征在于:优选4?20次。
【专利摘要】本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种利用自噬抑制剂氯喹提高离子束治疗肿瘤疗效的方法。其特点是包括使用氯喹类自噬抑制剂和离子束照射，采用氯喹类自噬抑制剂对肿瘤进行处理，再进行离子束照射，抑制肿瘤的生长。两者协同作用可以提高离子束治疗中单次照射的辐照损伤效应，从而达到提高肿瘤组织辐照效应增强的功效。其使用氯喹类自噬抑制剂后，离子束照射对肿瘤细胞的损伤提高23％，对肿瘤组织的生长抑制率显著提高1.75倍。其显著提高离子束治疗中单次照射的效果，减少治疗次数，缩短治疗周期，也可提高治疗设备的利用率，降低治疗成本，减少患者的经济负担。
【IPC分类】A61K31/4706, A61N5/10, A61P35/00
【公开号】CN105250296
【申请号】CN201510681716
【发明人】郑小刚, 金晓东, 陈卫强, 李强, 李翡翡, 刘雄雄, 叶飞, 刘岩, 戴中颖
【申请人】中国科学院近代物理研究所
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月19日