类囊体的大规模制备方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2009年6月24日、申请号为200980127457. 6、发明名称为"类 囊体的大规模制备方法"的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及从光合成生物，诸如绿色植物叶原料（leaf material)中生产类囊体 的大的工业规模方法，所述类囊体用做食品中的成分、食品添加剂（additions to food)、 食品添加物，或用于在人类和动物中预防超重、促进饱满感（promoting satiety)、减少食 物摄取、减轻体重、降低血胰岛素浓度、降低血脂和体脂肪百分比的目的的药物。
【背景技术】
[0003] 超重和肥胖已经成为世界范围的问题。作为代谢综合症的一部分，肥胖可以导致 多种疾病，诸如糖尿病、动脉硬化和高血压。肥胖和超重是能量摄入和能量消耗之间不平衡 的结果，通常是由缺乏食欲控制造成的。单独的高脂饮食或其与蔗糖和其它甜味碳水化合 物的共同摄取是引起肥胖的最重要的因素之一，因为这些饮食容易促进暴食。在本发明中， 我们还发现如在此描述的类囊体的制备在人类中有相似的效果。对于人类的应用，需要大 规模的制备。
[0004] 迄今为止，类囊体的小规模实验室制备与在光合作用研究中使用的方式基本相 同，后者使用含有可保持类囊体功能完整性，即在生物电子传递中有活性的组合物和保存 的氧化还原系统的培养基。
[0005] 然而，要能以大规模生产类囊体将面临大量问题，包括维持蛋白质的完整性，即它 们不应该降解。此外，叶细胞中不需要的组分需要被有效除去，从而从最终产品中清除或基 本除去不需要的组分。
【发明内容】
[0006] 本发明涉及适合含有类囊体的膜级分（fraction)制备的工业生产的大规模方 法。给予人类和动物类囊体需要该方法。在本发明中描述了类囊体对人类在促进饱满感和 预防超重方面的多种影响。当按比例放大方法（其中该方法涉及植物原料）时，存在若干 问题。对于植物原料而言，植物细胞由于覆盖所述细胞的坚硬细胞壁而难以破坏。并且已经 生长于室外旷野中的植物原料已经暴露于不同种类的微生物以及不同的气候条件（这些 是无法控制的）。此外，不需要的化合物，诸如，例如重金属被植物的根摄取，可能影响方法 和最终产品。当植物原料在温室中于受控条件下生长时问题永远不会出现。在收获植物原 料时，非常重要的是，植物内部的所有过程均停止以及微生物不知何故被灭活。如果植物中 的代谢不停止，将出现植物原料的降解，从而使类囊体的分离方法无法实现。本发明的目的 是快速有效的分离类囊体以及维持类囊体的结构，其中蛋白质是完整的，并且用类囊体作 为食品中的成分、食品添加剂、食品添加物、或在人类和动物中促进饱满感、延缓脂肪消化、 降低血胰岛素、减少诸如甘油三酯的血脂肪酸和体脂肪的药物。
[0007] 在第一个方面，本发明涉及一种用于生产至少一种类囊体膜级分的大规模方法， 包括下述步骤：收集超过500kg的量的至少含有类囊体的植物或藻类，用溶液将所述植物 或藻类均质化为勾衆液（homogenate)，从勾楽；液中除去植物残渣，在级分中收集类囊体，浓 缩级分并且将浓缩的级分干燥成粉末或颗粒。可选地，可以和类囊体一起获得/纯化核酮 糖二磷酸羧化酶-加氧酶。
[0008] 在第二个方面，本发明涉及一种用于生产膜级分的大规模方法，包括下述步骤：收 集超过500kg的量的含有类囊体的植物或藻类，用含有例如EDTA的溶液将所述植物或藻类 均质化为匀浆液，从匀浆液中除去植物残渣，在级分中收集类囊体，浓缩级分，用乙醇洗涤 级分，可选地将浓缩的级分干燥成粉末或颗粒。
[0009] 在第三个方面，本发明涉及一种可用如上所述和在详细说明中所述的方法获得的 产品。
[0010] 在第四个方面，本发明涉及所述的产品在治疗中的应用。
[0011] 在第五个方面，本发明的涉及所述产品在制备用于在人类和动物中治疗超重、促 进饱满感、减少食物摄取、减轻体重、降低血胰岛素浓度、减少诸如甘油三酯的血脂肪酸、和 降低体脂肪百分比或减少炎症的药物中的应用。
【附图说明】
[0012] 图1.类囊体的沉淀作为pH的函数。使浓度相同但pH不同的类囊体悬浮液于 容器中静置一小时。液体的高度为20cm。纵坐标显示有多少类囊体保留在上清液中（如 680nm(其中类囊体具有最大吸光度的波长）处的吸光度所测量）。这证明沉淀在pH 4-5 的范围内是有效的。通过向pH为7的悬浮液中加入HCl调节pH。
[0013] 图2.将绿叶加工成类囊体。第I部分.1.植物原料的洗涤、冷冻和保存；2.混合、 均质化和螯合步骤；3.植物残渣的稀释和分离。
[0014] I ;1. 1.洗涤、1.2.冷冻、1.3切割器、1.4包装保存、1.5保存
[0015] 2 ; 2. 1混合、2. 2均质化、2. 3螯合剂
[0016] 3 ; 3. 1稀释、3. 2用倾析器分离
[0017] 图3.将绿叶加工成类囊体。第II部分.4. A.通过分离器分离类囊体；B.通过pH 沉淀分离类囊体；5. A+B.用乙醇处理；6.干燥。
[0018] 4A ;4· L分离器、4. 2沉淀、4. 3过滤。
[0019] 4B ;4. I. pH 沉淀、4. 2. L 冷冻、4. 2. 2.倾析器、4. 3 过滤。
[0020] 5Α、Β ;5· 1.乙醇处理。
[0021] 6.干燥程序。
[0022] 图4.给予含有或不含有类囊体的饮食后人类胰岛素和葡萄糖水平。如图所示，类 囊体使胰岛素分泌显著减少（左），和葡萄糖水平没有变化（右）。
[0023] 图5.用高脂饮食（对照）或富含类囊体（类囊体）的高脂饮食喂养100天的小 鼠中类囊体对食物摄取（A)、体重（B)和体脂肪（C)的影响。在类囊体处理的小鼠中食物摄 取（A)、体重（B)和体脂肪（C)显著减少。
[0024] 发明详述
[0025] 定义
[0026] 在本申请和发明的上下文中使用下述定义：
[0027] 术语"类囊体或类囊体膜"意旨任何光合成生物，诸如植物中的光合作用膜。
[0028] 术语"叶"意旨任何源于植物的绿叶（green leaves)。
[0029] 术语"均质化"意旨任何类型的混合、研磨、切割，其减小原料（诸如叶）的尺寸以 及将光合成原料分裂、破裂、溶解成更小部分，甚至将原料（诸如植物原料）的细胞破坏。
[0030] 术语"切割器"意旨可以将新鲜的或冷冻的光合成原料切割（研磨）成更小碎片 的装置。
[0031] 术语"粉碎机"意旨可以将原料细胞，诸如叶细胞破裂或溶解的装置。
[0032] 术语"浆液"意旨将光合成原料粉碎并将其与溶剂介质混合后的产物。
[0033] 术语"倾析器"意旨可以在连续方法中从破裂光合成原料后获得的含有类囊体的 悬浮液中除去大的残渣，诸如细胞壁、细胞壁碎片、未破碎的细胞、淀粉粒的装置。
[0034] 术语"分离器"意旨在连续方法中可以通过离心从其周围液体中大规模分离并收 集类囊体的装置。
[0035] 术语"螯合剂"意旨可以通过与重金属结合将其从类囊体中除去的试剂。
[0036] 术语"试剂"意为包含上述术语螯合剂。"试剂"还可以指蛋白酶抑制剂。
[0037] 术语"大规模"意旨比实验室规模大得多的规模，例如使用100kg、500kg、1000 kg 或更多光合成原料作为制备类囊体的起始原料。光合成原料可以是植物原料。
[0038] 大规模方法
[0039] 本发明涉及从任何光合成生物，诸如叶原料中释放类囊体的大规模方法。该叶 原料可以从任何绿叶来源获得，诸如菠菜、三叶草、油菜、甜菜、羽衣甘蓝（kale)、昆诺阿藜 (quinoa)、草、耶路撒冷洋蓟（Jerusalem artichoke)、蒲公英、藜属（Chenopodium)、滨藜 属（Atriplex)。原料可以从生长于自由地带或温室中的农作物获得。
[0040] 该方法包括多个如下所述的步骤（图2、图3)。并非所有步骤都是必须的，可以依 据起始原料，诸如使用何种植物、分离的类囊体的用途以及植物已经生长的地点来纳入所 述步骤。
[0041] 叶原料的收获/收集以及快速冷冻
[0042] 叶原料可以以新鲜原料的形式被处理，或通过使叶内部存在的蛋白质降解最小化 以及抑制微生物诸如细菌和霉菌生长的方法迅速冷冻。可以在通有由常规冷冻单元（unit) 产生的冷空气（_40°C )的冷冻通道内或通过使用液氮（_196°C )进行冷冻步骤。
[0043] 作为下一个步骤，可以使用切割器，诸如常规混合器将叶原料均质化为更小的碎 片（图2)。实例是诸如锤磨机的研磨机。在保存之前将叶原料进行分份以减小冷冻原料的 体积。更进一步通过使用第一冷冻步骤使在冷冻过程中形成的冰晶刺穿叶细胞，这可以简 化处理步骤。然后可以将叶原料以冷冻稳定的形式保存以供进一步使用或立即处理。
[0044] 粉碎匀浆液/浆液并用螯合剂处理
[0045] 在均质化方法中，用液体，诸如水例如饮用水混合叶原料，诸如将1份叶原料与