芋螺毒素(conotoxin)肽，其医药组合物和用图
【专利说明】芋螺毒素（CONOTOXIN)肽，其医药组合物和用途
[0001] 相关申请案的夺叉引用
[0002] 本申请案要求2013年5月31日申请的美国临时专利申请案第61/829, 633号和 2013年7月5日申请的美国临时专利申请案第61/843, 135号的优先权，所述申请案的全部 内容都以引用的方式并入本文中。
[0003] 政府I持的引用
[0004]本发明在由国立卫生研究所（NationalInstitutesofHealth)，贝塞斯达 (Bethesda),马里兰（Maryland)颁发的授权号为MH53631、GM48677和NS048158的政府支 持下产生。美国政府享有本发明中的特定权利。
【背景技术】
[0005] 芋螺属的食肉性海蜗牛的毒液富含神经药理学活性肽（阿米肖（Armishaw)等 人，2005 ;王（Wang)等人，2004 ;列维特（Livett)等人，2004 ;路易斯（Lewis)，2004 ;特劳 (Terlau)等人，2004)。芋螺属中有约500个物种，并且在目前已检验的那些物种中，不变 的特征是其毒液中存在α-芋螺毒素（a-conotoxin)肽。α-芋螺毒素肽为具有C1-C3二 硫键和C2-C4二硫键的高度二硫交联的肽。
[0006] 由于α-芋螺毒素的非半胱氨酸残基的高序列变异性，α-芋螺毒素非常多样并 且每个芋螺物种具有独特的α-芋螺毒素肽补体。α-芋螺毒素肽以大型前驱体形式合成， 且成熟毒素通过对前驱体的C-末端进行蛋白酶裂解而产生。与成熟毒素的半胱氨酸间可 变序列相反，前驱体以及其编码基因在给定芋螺物种中的α-芋螺毒素肽之间和物种与物 种之间都相当保守。
[0007] α-芋螺毒素肽通常显示为烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR)拮抗剂（麦金托什 (Mcintosh)等人，1999 ;简斯（Janes), 2005 ;达顿（Dutton)等人，2001 ;阿里亚斯（Arias) 等人，2000)。nAChR为乙酰胆碱闸控离子通道的群组，所述乙酰胆碱闸控离子通道为配体 闸控离子通道超家族的部分（卡林（Karlin)，2002;戈蒂（Gotti)等人，2004)。其为环绕 中心离子传导信道的跨膜子单元的五聚物。已识别出多种不同子单元，且大多数属于两个 主要超家族（α子单元和β子单元）。子单元在受体五聚物中可用多种组合缔合，导致受 体亚型的不同家族。大多数亚型包含来自α子单元家族和β子单元家族的子单元，例如 人类成体肌肉亚型包含两个α子单元和一个β子单元（除δ子单元和ε子单元之外） 并且α3β2亚型由α3子单元和β2子单元构成。仅由α子单元构成的nAChR为α7亚 型和α9亚型（均五聚物）以及α9α10亚型（全α杂五聚物）。系统发生分析显示，α7 子单元、α9子单元和α10子单元彼此间的关系相较于与其它nAChR子单元的关系更紧密 (雷诺夫（LeNovere)等人，2002 ;斯嘉德（Sgard)等人，2002)。
[0008]a9nAChR子单元和α10nAChR子单元在不同组织中表达。在内耳中，α9α10 nAChR介导传出橄榄耳蜗纤维与耳蜗毛细胞之间的突触传输（斯嘉德等人，2002 ;爱高恒 (Elgoyhen)等人，1994 ;爱高恒等人，2001)。α9子单元和α10子单元还发现于背根神 经节神经元（哈伯格（Harberger)等人，2004 ;利普斯（Lips)等人，2002)、淋巴细胞（彭 (Peng)等人，2004)、皮肤角质细胞（阿雷东多（Arredondo)等人，2002;阮（Nguyen)等 人，2000 ;库尔森（Kurzen)等人，2004)以及垂体结节部（斯嘉德等人，2002 ;爱高恒等 人，1994;爱高恒等人，2001)。此外，a9nAChR子单元在乳癌中活跃（李（Lee)等人，2010a; 李等人，2010b;林诺拉（Linnoila), 2010)。α-芋螺毒素肽RgIA(RgIA;GCCSDPRCRYRCR; SEQIDN0:1)已显示阻断α9α1〇nAChR(艾里森（Ellison)等人，2006)。RglA的某 些类似物也已经显示阻断α9α10nAChR(US2009/0203616、US2012/0220539 以及TO 2008/011006)。
【发明内容】
[0009] 本发明涉及α-芋螺毒素肽RglA的类似物（本文的芋螺毒素肽类似物）。这些芋 螺毒素肽类似物阻断烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR)的α9α10亚型，并且可用于治疗疼痛、 炎症性病况、炎症和/或癌症。
【附图说明】
[0010] 图1Α和1Β展示苏氨酸（Thr或Τ) 56/异亮氨酸（lie或I)造成大鼠对比人类的 RglA抑制效能差异。大鼠α9子单元中Thr56突变为lie，导致对大鼠受体的RglA效能降 低到人类受体发现的水平（图1A)。将人类α9受体中的Ile56置换为Thr导致对人类受 体的RglA效能增加到大鼠体内所发现的水平（图1B)。各值为由至少三个卵母细胞的平均 值土平均值标准误差（standarderrorofthemean;SEM)，所述卵母细胞中注射有比率 为1:1的来自α9子单元基因的cRNA和α10子单元基因的CRNA。
[0011] 图2展示类似物2(表1;SEQIDN0:4)选择性阻断α9α10nAChR对于a7nAChR。 类似物2施用于表达人类α9α10nAChR或人类α7nAChR的爪蟾（Xenopus)卵母细胞。 10nM的类似物2阻断α9α1〇nAChR的Ach-诱发反应的75±2.8%。高一千倍的浓度 (10μΜ肽）没有能阻断a7nAChR。（η= 5)。展示个别卵母细胞的代表性迹线。
[0012] 图3展示神经损伤后的物质Ρ表达。其为热损伤24小时和一周后，脊髓背角中提 高的物质Ρ表达的显微照片。
[0013] 图4Α到4J展示芋螺毒素肽在化学疗法诱发的神经痛中的功效。每天投予RglA 在第14天和第21天产生显著镇痛效果（图4A、4B、4E、4F以及41)。图4C、4D、4G、4H以及 4J展示表明此预防性治疗范例中CSP-4的镇痛效果的数据。
[0014] 图5A和5B展示RglA(图5A)和CSP-7(图5B)显著降低烧伤引发的热痛觉过敏， 如通过哈格雷夫斯（Hargraves)方法以全部三个测试剂量（4mcg/Kg、20mcg/Kg和lOOrncg/ Kg)测量。
【具体实施方式】
[0015] 本发明涉及芋螺毒素肽，所述芋螺毒素肽为α-芋螺毒素肽RglA的类似物（本文 中的芋螺毒素肽类似物），以及其变异体、d取代类似物、修饰物以及衍生物（本文中统称 "芋螺毒素肽")。这些芋螺毒素肽阻断烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR)的α9α10亚型，并且 可用于治疗疼痛、炎症性病况、炎症和/或癌症。芋螺毒素肽还可用于本文所述的进一步药 物开发。
[0016] Ι·α-芋螺毒素肽RglA的类似物
[0017] 来自无急性或慢性毒性存在的动物疼痛模型的数据表明α-芋螺毒素肽为药物 开发提供有前景的引导。支持这一结论的是，来自维多利亚芋螺（Conusvictoriae)的相 关肽（Vcl. 1)已进行到第2期临床试验才发现其对于人类α9α10nAChR的效用显著低 于对大鼠α9α10nAChR(列维特等人，2006)。同样地，对RglA的研究已证实这一肽对人 类受体的效用比对大鼠受体的效用小约170倍（阿扎姆（Azam)等人，2012)。通过使用定 点突变诱发，已识别出α9子单元中的单一残基（Thr/Ile56)为导致大鼠α9α10和人类 α9α10与RglA之间大部分相互作用差异的原因（图1Α)。将人类α9从Ile56改变为大 鼠体内发现的Thr导致对人类受体的RglA效能增大2的对数（图1B)。
[0018] 使用受体-配体动力学以及RglA的核磁共振（nuclearmagneticresonance; NMR)结构的知识，设计出对人类受体和对大鼠受体大致等效的RglA的结构类似物。识别出 RglA中提高人类α9α10结合的四个突变。精氨酸（Arg或R) 9到瓜氨酸或ω-硝基-Arg 的单一取代，以及酪氨酸（Tyr或Y)10到单碘-Tyr(后者为SEQIDN0:21)的单一取代各对 大鼠受体导致小效能提高，但对人类受体导致4倍到8倍的效能提高。丝氨酸（Ser或S)4 改变为Thr，或Argl1改变为谷氨酸（Gin或Q)各自也导致对人类受体的3倍到4倍效能提 高。在单个肽（类似物2;SEQIDN0:19)中组合这些四个改变导致IC50约为8nM时对人 类受体的效能提高>100倍（表2)。
[0019] 类似物2的进一步优化显示可通过进一步向肽末端添加两个Arg残基（类似物4 ; SEQIDN0:4)和/或通过将Argl3修饰为Tyr(类似物3;SEQIDN0:3)实现对人类受体的 效能提高。除这些取代之外，半胱氨酸（Cys或C)残基（Cys2和Cys3)中的两者也修饰为 硒代半胱氨酸以提高肽的稳定性和再折叠效率（SEQIDN0:20)。双重硒代半胱氨酸突变体 对人类受体的效能相对于未修饰的RglA显示出10倍提高。RglA的上述改变单独或组合用 于构造对人类通道具有提高效能的类似物，解决先前临床候选物Vcl. 1的关键开发问题。
[0020] 在多个实施例中，本文所披露的芋螺毒素肽类似物具有式 GX6X7X3DPRX8X1X2X4X9X5(SEQIDN0:22)，其中Π为Arg、瓜氨酸或ω-硝基-Arg;X2 为 Tyr或单碘-Tyr;X3 为Ser或Thr;X4 为Arg、Gln或Glu;X5 为Arg、Tyr、苯丙氨酸（Phe或 F)、色氨酸（Trp或W)、Tyr-Tyr、Ty;r-Arg、Arg-Arg-Arg、Arg-Arg-Ty;r或Tyr-Arg-Arg;X6 为 Cys或硒代半胱氨酸；X7为Cys或硒代半胱氨酸；X8为Cys或硒代半胱氨酸；且X9为Cys 或硒代半胱氨酸。在一个实施例中，XI为Arg。在一个实施例中，XI为瓜氨酸。在一个实 施例中，XI为ω-硝基-Arg。在一个实施例中，X3为Ser。在一个实施例中，X3为Thr。在 一个实施例中，X4为Arg。在一个实施例中，X4为Gin。在一个实施例中，X4为Glu。在一 个实施例中，X5为Arg。在一个实施例中，X5为Tyr。在一个实施例中，X5为Phe。在一个 实施例中，X5为Trp。在一个实施例中，X5为Tyr-Tyr。在一个实施例中，X5为Tyr-Arg。 在一个实施例中，X5为Arg-Arg-Arg。在一个实施例中，X5为Arg-Arg-Tyr。在一个实施 例中，X5为Tyr-Arg-Arg。在一个实施例中，X6为Cys。在一个实施例中，X6为硒代半胱氨 酸。在一个实施例中，X7为Cys。在一个实施例中，X7为硒代半胱氨酸。在一个实施例中， X8为Cys。在一个实施例中，X8为硒代半胱氨酸。在一个实施例中，X9为Cys。在一个实 施例中，X9为硒代半胱氨酸。
[0021] 在多个实施例中，本文所披露的芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCX3(SEQ IDN0:2)，其中Π为Arg或瓜氨酸；X2 为单碘-Tyr;且X3 为Tyr、Phe、Trp、Tyr-Tyr、Tyr-Arg、Arg-Arg-Arg、Arg-Arg_Tyr或Tyr-Arg-Arg。在一个实施例中，XI为Arg。在另一 实施例中，XI为瓜氨酸。在一个实施例中，X3为Tyr。在另一实施例中，X3为Phe。在另一 实施例中，X3为Trp。在另一实施例中，X3为Tyr-Tyr。在另一实施例中，X3为Tyr-Arg。 在另一实施例中，X3为Arg-Arg-Arg。在另一实施例中，X3为Arg-Arg-Tyr。在另一实施例 中，X3 为Tyr-Arg-Arg。
[0022] 在一个实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCY(SEQIDNO:3 ;本文 中也称为类似物3)，其中XI为瓜氨酸且X2为单碘-Tyr。在另一实施例中，芋螺毒素肽类 似物具有式GCCTDPRCX1X2QCRRR(SEQIDN0:4;本文中也称为类似物4)，其中XI为瓜氨酸 且X2为单碘-Tyr。在额外实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCYRR(SEQ IDN0:5;本文中也称为类似物5)，其中XI为瓜氨酸且X2为单碘-Tyr。在又一实施 例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCRRY(SEQIDN0:6;本文中也称为类似 物6)，其中XI为瓜氨酸且X2为单碘-Tyr。在另一实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式 GCCTDPRCX1X2QCF(SEQIDN0:7;本文中也称为类似物7)，其中XI为瓜氨酸且X2为单 碘-Tyr。在额外实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCW(SEQIDN0:8 ;本文 中也称为类似物8)，其中XI为瓜氨酸且X2为单碘-Tyr。在又一实施例中，芋螺毒素肽类 似物具有式GCCTDPRCX1X2QCYY(SEQIDN0:9 ;本文中也称为类似物9)，其中XI为瓜氨酸 且X2为单碘-Tyr。在又一实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCYR(SEQID NO: 10 ;本文中也称为类似物10)，其中XI为瓜氨酸且X2为单碘-Tyr。
[0023] 在一个实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCRX2QCY(SEQIDN0:11 ;本 文中也称为类似物11)，其中X2为单碘-Tyr。在另一实施例中，芋螺毒素肽类似物具有 式GCCTDPRCRX2QCRRR(SEQID勵：12;本文中也称为类似物12)，其中乂2为单碘-了7『。 在额外实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCRX2QCYRR(SEQIDNO: 13 ;本文中 也称为类似物13)，其中X2为单碘-Tyr。在又一实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式 GCCTDPRCRX2QCRRY(SEQIDN0:14 ;本文中也称为类似物14)，其中X2为单碘-Tyr。在另一 实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCRX2QCF(SEQIDN0:15 ;本文中也称为类似物 15)，其中X2为单碘-Tyr。在额外实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCRX2QCW(SEQ IDN0:16;本文中也称为类似物16)，其中X2为单碘-Tyr。在又一实施例中，芋螺毒素肽 类似物具有式GCCTDPRCRX2QCYY(SEQIDN0:17 ;本文中也称为类似物17)，其中X2为单 碘-Tyr。在另一实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCRX2QCYR(SEQIDN0:18;本 文中也称为类似物18)，其中X2为单碘-Tyr。
[0024] 本文所披露的芋螺毒素肽类似物的"变异体"包括相较于本文所披露的芋螺毒素 肽类似物具有一或多个氨基酸添加、氨基酸缺失、氨基酸终止位置或氨基酸取代的肽。
[0025]氨基酸取代可为保守取代或非保守取代。本文所披露的芋螺毒素肽类似物的变 异体可包括具有一或多个保守氨基酸取代的那些变异体。如本文所使用，"保守取代"涉及 以下保守取代群组中的一者中出现的取代：第1组：丙氨酸（Ala或A)、甘氨酸（Gly或G)、 Ser、Thr;第2组：天冬氨酸（Asp或D)、Glu;第3组：天冬酰氨酸（Asn或N)、谷氨酸（Gin 或Q);第4组：Arg、赖氨酸（Lys或K)、组氨酸（His或Η);第5组：Ile、亮氨酸（Leu或L)、 甲硫氨酸（Met或M)、结|氨酸（Val或V);以及第6组：Phe、Tyr、Trp。
[0026] 此外，氨基酸可以按相似的功能、化学结构或组成（例如酸性、碱性、脂肪族、芳香 族、含硫）分组成保守取代组。举例来说，脂肪族组可包括（出于取代目的）Gly、Ala、Val、 Leu以及lie。彼此视为保守取代的含有氨基酸的其它群组包括：含硫：Met和Cys;酸性： Asp、Glu、Asn以及Gin;小分子脂肪族非极性或微极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro以及Gly; 极性带负电残基以及其酰胺：Asp、Asn、Glu以及Gin;极性带正电残基：His、Arg以及Lys; 大分子脂肪族非极性残基：Met、Leu、lie、Val以及Cys;以及大分子芳香族残基：Phe、Tyr 以及Trp。额外信息发现于克赖顿（Creighton)(1984)蛋白质（Proteins)，W.Η.费里曼公 司(ff.H.FreemanandCompany)中。
[0027] 本文所披露或所提到的芋螺毒素肽类似物序列的变异体还包括相对于本文所披 露或所提到的肽序列具有至少70%的序列一致性、至少80%的序列一致性、至少85%的序 列、至少90 %的序列一致性、至少95 %的序列一致性、至少96 %的序列一致性、至少97 %的 序列一致性、至少98 %的序列一致性或至少99 %的序列一致性的序列。更特定来说，本文 所披露的芋螺毒素肽类似物的变异体包括以下肽，所述肽具有：与SEQIDN0:1-22中的任 一者的70 %的序列一致性；与SEQIDNO:1-22中的任一者的80 %的序列一致性；与SEQ IDN0:1-22中的任一者的81%的序列一致性；与SEQIDN0:1-22中的任一者的82%的序 列一致性；与SEQIDN0:1-22中的任一者的83%的序列一致性；与SEQIDN0:1-22中的 任一者的84%的序列一致性；与SEQIDNO: 1-22中的任一者的85%的序列一致性；与SEQ IDNO: 1-22中的任一者的86%的序列一致性；与SEQIDNO: 1-22中的任一者的87%的序 列一致性；与SEQIDN0:1-22中的任一者的88%的序列一致性；与SEQIDN0:1-22中的 任一者的89%的序列一致性；与SEQIDNO: 1-22中的任一者的90%的序列一致性；与SEQ IDNO: 1-22中的任一者的91%的序列一致性；与SEQIDNO: 1-22中的任一者的92%的序 列一致性；与SEQIDN0:1-22中的任一者的93%的序列一致性；与SEQID