02流量3ml/g生药·min,萃取时间 TOOmin，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500 片，每片重0. 35邑。
[0024] 经检测，成品中搬皮素和山奈素的含量为308μκ/片。
[0025] 实施例4 :山蜡梅叶片抑制恶性胚胎横纹肌瘤细胞RD细胞增殖的实验研究资料 1.实验材料 1. 1实验用细胞株 人恶性胚胎横纹肌瘤细胞RD细胞，山东大学实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。
[0026] 1. 2实验药物 研究药物：本发明山蜡梅叶片：按实施例1方法制备。
[0027] 药液储液：称取lOOmg山蜡梅叶片，溶于5ml无水乙醇中，0. 2化滤器过滤， 50〇μ1(1ο??·管分装，-20°C存储，同时0. 2化滤器过滤无水乙醇W备对照组之用。
[002引 1. 3实验试剂 DMEM(GIBC0公司Cat.No. 12100-061Lot.No. 758137);胎牛血清（浙江天杭生物科技 有限公司Lot.No. 100419);胞肥03(上海久亿化学试剂有限公司Cat.No. 11810-033Lot. No. 1088387) ;Τ巧psin(AMRESC0 公司）;邸TA(AMRESC0 公司）;化nicillinGSodiumSalt (AMRESCO公司l);Str巧tomycinSulfate(AMRESCO);无水乙醇（溜博亚杜兰经贸有限公 司）；MTT度iosha巧批号：0793):PBS(实验室自配）； 1. 4实验器材 莱卡倒置显微镜(德国Leica型号：DMIL);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型 号：S阳CTRAMAX190);C02培养箱（FORMA型号：3111);超净台（苏净集团安泰公司制造型号： SW-CJ-Z抑）；纯水仪(美国Spring公司型号：S/N020579);精密移液器(法国吉尔森公司型 号：P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号：BT323S);全自动高压灭菌锅（日本SANYO 公司型号：MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱（上海精密实验设备公司型号：DHG9123A);冰 箱（西口子公司型号：KG18V21TI);液氮罐（CBS型号：2001);低速离屯、机(上海安亭科学仪 器厂型号：KA-1000) ;0.2化滤器（MILLIP0RE型号：SLGP033RB) ;lcm培养皿（肥ST公司）、 96孔培养板（肥ST公司）；细胞计数板；离屯、管、移液管、Tips若干。
[002引 2.实验方法 1)畑细胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02进行常规培养（10cm培养皿)，当细胞生长至 对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0. 25%膜蛋白酶-0. 04%邸TA， 37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离屯、管中， 1000巧m离屯、5min，调整细胞悬液浓度3X104个/ml。
[0030]。将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液18〇μ1，培养板放入细胞培养箱 中（37°C，5%C02)常规培养。
[0031] 3)根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入山蜡梅叶片溶液，继续培养2地。
[0032]4)2地后加入2〇μ1MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养地。
[0033] 5)地后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入20〇μ1二甲基亚讽，置摇床 上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0034] 6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介 质、培养液、MTT、二甲基亚讽)，每组设定6个复孔。
[0035] 7)结果W药物对细胞的抑制率表示：细胞增值抑制率饼)=(对照孔0D值-给药 孔0D值)、对照孔0D值X100%。实验重复3次。
[0036] 3.统计处理 采用Microsoft Excel2007软件中的相关分析和Student t检验，数据Wmean±S.D . 表不。
[0037] 4.实验结果 Μ?Τ法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对RD细胞增殖抑制 有差异（P<〇. 05)，剂量在lOmg/ml时该差异具有显著性（P<0. 01)，当剂量达到15-20mg/ml 时有极显著性差异（P<〇. 001)。
[003引表1山蜡梅叶片对畑细胞增殖抑制影响研究狂+SD)
注：与对照组比较，冲<0. 01 ;*冲<0. 001。
[0039] 5.实验结论 本发明的山蜡梅叶片可W抑制RD细胞增殖，减少RD细胞的细胞生长数目，该作用呈剂 量依赖性。
【主权项】
1. 山蜡梅叶片在制备抑制恶性胚胎横纹肌瘤细胞RD细胞增殖药物中的应用，所述山 蜡梅叶片由山蜡梅叶1500g作为原料药制成，其特征在于，所述山蜡梅叶片的制备方法由 下列步骤组成：取山蜡梅叶，加入到〇) 2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取 溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50°C，C(V流量l-3ml/g生药·π?η， 萃取时间700-800min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥， 压片，制成500片，每片重0. 35g。2. 根据权利要求1所述的山蜡梅叶片在制备抑制恶性胚胎横纹肌瘤细胞RD细胞增殖 药物中的应用，其特征在于，所述山蜡梅叶片的制备方法由下列步骤组成：取山蜡梅叶，加 入到〇) 2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取 压力25MPa，温度40°C，C(V流量2ml/g生药·min，萃取时间750min，得超临界萃取物，将超 临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.35g。
【专利摘要】本发明属于中药技术领域，具体涉及一种山蜡梅叶片在制备抑制恶性胚胎横纹肌瘤细胞RD细胞增殖药物中的应用及山蜡梅叶片的制备方法。所述山蜡梅叶片由山蜡梅叶1500g作为原料药制成，采用超临界萃取制备而成，使得槲皮素和山柰素含量有很大提高。
【IPC分类】A61K36/185, A61K127/00, A61P35/00, A61K9/20
【公开号】CN105380970
【申请号】CN201510984158
【发明人】杨志华, 李晶
【申请人】济南新时代医药科技有限公司
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年12月24日