在化妆品、饮食补充剂和/或功能食物中掺入培养的越橘细胞的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求于2013年6月26日提交的临时申请号61/839,808的利益和优先 权，所述临时申请以引用的方式全文并入。
技术领域
[0003] 本发明涉及具有抗炎和抗氧化剂特性的越橘细胞(bilberry cell)、由这些细胞 制备的提取物和掺入细胞或提取物的组合物的产生。
【背景技术】
[0004] 存在显著未满足的天然抗炎剂的需要。健康炎症应答是运转良好的免疫系统的标 志。无论是被物理性损伤攻击、被微生物侵袭还是被外来物质污染，人体能够将杀伤细胞和 防御化合物的军队驱使(herald)至损伤部位。局限性炎症是该应答的结果，并且在急性损 伤的情况下，它是有效和适当的，只要它是短暂的。
[0005] 当炎症应答变得延长时，炎症开始具有严重不利效应。随着时间过去，发炎组织开 始分解且异常工作。这种功能丧失是如此严重，使得慢性炎症通常被视为慢性疾病的根源。 慢性或不受控制的炎症可导致广泛范围的病理状态，包括脓毒症、癌症、关节炎、神经变性 疾病、肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化。（Glass CK，Saijo K，Winner B.，Marchetto M.C·， Gage F.H.Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration·Cell·2010， I 40:9 I 8-934· ;Medzhitov R.Origin and physiological roles of inflammation.Nature 2008，454:428-435·;Grivennikov S. I.,Greten F.R.,Karin M.Immunity , inflammation , and cancer.Cell 2010，140:883_899·;Hotami siigiI G.S.Endoplasmic reticulum stress and the inflammatory basis of metabolic disease.Cell 2010,140:900-917.)考虑到该严峻的列表，明确的是能够对抗慢性炎症及 其不利效应的试剂具有潜在更大的价值。
[0006] 然而，炎症只是促成慢性疾病的一种因素；另一种偶然因素是氧化。事实上，这两 种因素是联系的，因为氧化性应激是炎症应答的主要触发剂。因此，如果不同时考虑氧化的 作用，则炎症的任何讨论均是不完全的。活性氧(ROS)的增加连同氧化还原平衡中的伴随破 坏，导致慢性炎症的状态。证据越来越多地指向氧化炎症作为老化和慢性疾病的主因的新 出现的理论。已创造术语氧化 -炎症-老化(《^：^：11^131]1111-38；[1^)，以描述该过程，并且存在 发现用于其的补救措施的渐增需求（De la Fuente M.，Miquel J.An update of the oxidation-inflammation theory of aging：the involvement of the immune system in oxi-inflamm-aging.Curr Pharm Des.2009,15(26)：3003-26)0
[0007] 越橘(欧洲越橘(Vaccinium myrtillus))是具有医学使用的长期历史的几种植物 之一。最出名的是其衆果的花青素(花青苷，anthocyanin)含量，越橘植物(特别是叶)还含 有黄酮醇、儿茶素、原花青素(procyanidin)和酸酸。
[0008] 然而，越橘难以生长且因此很少栽培。果实一般从在其有限生长季节(五月直到九 月）期间发现的野生植物收集。因此，浆果的供应是不可靠的，并且浆果以有限数量可获得。 此外，果实比相关蓝莓更柔软和多汁，使得它们必须手工收获，并且难以运输，这促成新鲜 果实的高成本。还由于成熟果实的高需求，未成熟果实和叶并非经济上可行的收集产品，从 而增强现有商业越橘衍生产品对花青素而不是未成熟材料中通常最多发现的原花青素的 聚焦。
【附图说明】
[0009]图1举例说明了在本文描述的培养的细胞的一些细胞系中以高浓度产生的化合 物；
[0010]图2显示了培养的越橘细胞的总离子质量色谱图，其举例说明了在培养的细胞中 天然产生的广泛数目的多酚化合物；
[0011]图3显示了通过就快速生长和高多酚生产选择的培养的越橘细胞系的多酚生产的 时序;和
[0012]图4举例说明了培养的越橘细胞的HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0013] I.引言
[0014] 本发明涉及掺入培养的越橘细胞或提取物的化妆品、饮食补充剂和/或功能食物， 所述培养的越橘细胞或提取物具有高水平的多酚，伴随很少的花青素或无花青素。与来自 常规越橘植物组织的多酚级分相比较，来自培养的越橘细胞的多酚级分是独特的。培养的 细胞具有高水平的天然黄酮醇、黄烷-3-醇和原花青素，但显著缺乏花青素。花青素是深色 化合物，其给予天然浆果其深色。因为本发明的培养的细胞产生很少的花青素或无花青素， 所以细胞及其提取物是淡色至无色的，同时仍产生与植物组织相比较一样多或更多的有益 多酸。已发现当掺入皮肤病学(dermatological)组合物、饮食补充剂和/或功能食物内时， 本发明的培养的全细胞和提取物是令人惊讶地有力抗氧化、抗炎和抗老化化合物。
[0015]通过培养的越橘细胞产生的抗氧化剂和抗炎剂是天然衍生的化合物，其已显示产 生合成的非类固醇抗炎药(NSAID)和皮质类固醇的利益中的许多，但没有与合成药物的长 期使用相关的有害副作用。
[0016] 除了是抗炎剂之外，培养的越橘细胞中的多酚中的许多也是有力的抗氧化剂。多 酚的特征在于一种或多种羟基苯部分的存在，并且通常来源于类苯基丙烷 (phenylpropenoid)生物合成途径。多酸作为一个类别还可再分成酸酸、苗、查耳酮、类黄 酮、花青素及其他。这个类型的许多分子具有至少一些抗氧化和/或抗炎活性，并且虽然某 些化合物已证明比其他有力得多，但广泛公认的是对多酚的暴露与慢性疾病的预防特别联 系，并且与老化过程的缓和更一般联系（Scalbert A.，Manach C.，Morand C.，R6m6sy C.， Jimenez L. Dietary polyphenols and the prevention of diseases.Crit Rev Food Sci Nutr.2005;45(4):287-306)。
[0017] 来自培养的细胞的多酚级分由酚类分子的多样化混合物组成。培养的细胞产生原 花青素包括二聚体、三聚体、四聚体等。除了广泛的B型原花青素之外，培养的越橘细胞还产 生双重连接的A型原花青素，其是对越橘(越橘属(Vaccinium))独特的一类化合物。还存在 黄酮醇，最通常以槲皮素和山柰酚苷的形式。槲皮素葡糖苷(异槲皮苷)是尤其丰富的，如二 氢山柰酚(香橙素)一样。最后，存在酚酸:香豆酸、咖啡酸和芥子酸。在本发明的培养的细胞 中天然产生的特别需要的化合物的例子可包括图1中所示的化合物的全部或一部分，包括 儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、香豆酸、异槲皮苷、原花青素 B2和原花青素 C1。
[0018] 图2显示了培养的越橘细胞的总离子质量色谱图，其举例说明了在培养的细胞中 天然产生的广泛数目的多酚化合物。
[0019] 前述多酚中的许多已知天然存在于越橘中，但浓度比本文描述的培养的细胞中发 现的更低。在本发明的一些实施例中，培养的越橘细胞含有在干重基础上的至少10 %、 15%、20%、25%多酚，和/或小于40%、35%、30%多酚，和/或在前述浓度的任意组合的范 围内。
[0020] 令人惊讶的是，这些浓度可伴随很少的花青素或无花青素而达到。花青素浓度可 在干重基础上小于1.0%、0.5、0.1 %、0.01或甚至0.001 %。值得注意的是，花青素明显不存 在于培养的细胞中。大多数越橘补充剂在颜色中是深紫色的，并且对花青素含量标准化，因 此具有含很少的花青素或无花青素的越橘产品是相当独特的。细胞中的许多是几乎白色而 不是紫色的事实在其中美学是重要的化妆品和食物中具有独特优点。
[0021] 本发明的细胞还可含有很少的绿原酸(氯原酸，chlorogenic acid)。在一些实施 例中，绿原酸可在干重基础上小于1 %、〇. 1 %或甚至〇. 01 %。尽管没有要求，但使绿原酸降 到最低对于某些人可为有用的，所述某些人可患有由于绿原酸存在的变态反应的致敏作 用。
[0022] 另外，在细胞培养物中生长的细胞不表达显著数量的叶绿素，所述叶绿素是在叶 中发现的色素，其给予叶其深绿色。令人惊讶的是，培养的细胞具有类似于叶的代谢产物 谱，即使培养的细胞非常不同于叶且不含例如叶绿素。叶绿素的量可在干重基础上小于 0.1 %、0.01 %或0.001 %，或基本上不含叶绿素。
[0023] 已显示独特的多酚谱在掺入化妆品组合物、饮食补充剂和/或功能食物内时是高 度有利的，所述多酚谱包括类似于天然叶的大量的抗炎和抗氧化化合物，同时不产生花青 素、叶绿素和/或绿原酸。包括培养的越橘细胞产品的皮肤护理制剂可应用于皮肤，以降低 肿胀、发红和刺激。组合物可抑制自由基诱导的对皮肤的氧化的有害效应。培养的越橘细胞 还可配制成具有抗炎和/或抗氧化特性的饮食补充剂或功能食物。
[0024] 本发明的培养的越橘细胞可产生多酚伴随很少的花青素或无花青素，多酚浓度通 常比已知多酚很高的其他细胞培养系（例如可可）大50%或更多。此外，这些结果可在比其 他细胞系更短的时间段内且使用更少的碳水化合物来达到。在生长期结束时，例如在小于 或等于10、9、8、7或6天内，收获的越橘细胞通常可具有与在相同的生长期内且在相同或相 似的生长条件下培养的可可细胞系三倍的多酚。虽然可通过在接近生长期结束或在生长期 结束后(例如在5-7天后)添加补充性葡萄糖，来优化可可细胞系中的多酚产生，但已发现当 产生高浓度的多酚时(例如如本文描述的），培养的越橘细胞通过就多酚生产而言的显著余 裕(例如50% )仍比培养的可可细胞表现更佳。例如，当从仍处于生长期的培养物收获时，培 养的越橘细胞可具有在干重基础上的大于30%多酚。这些结