以外源性线粒体为有效成份的组合物、其用途及修复细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明有关于抗老化及修复线粒体受损细胞的方法，特别指一种以外源性线粒体 为有效成份的组合物、其用途及修复细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 线粒体为细胞内负责提供细胞能量，产生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP)。线粒体会因为细胞内能量需求或细胞压力的不同，而进行动态变化，并非一直处于 单一线粒体状态。具体来说，当细胞能量需求增加时，线粒体会持续地分裂（fission)，以 快速地产生三磷酸腺苷；相反地，当细胞处于饥饿状态时，线粒体会进行融合（fusion)， 以降低能量的生产及利用，维持细胞正常生理功能。此外，线粒体在遭遇如膜电位降低、 线粒体DNA突变（mtDNA)等受损时，也会进行融合反应，通过同源性重组（homologous recombination)的方式，置换受损的线粒体DNA，而当线粒体内突变的DNA累积过多，以致 无法进行修复时，线粒体会被自嗤体（autophagosome)清除，仅留下正常的线粒体（Lamb CA et al.，2013)。是以，当细胞内同时具有过多受损的线粒体而无法被清除时，会使细胞走向 细胞凋亡（Mukhopadhyay S et al.，2014)。
[0003] 线粒体的缺损与功能不全与许多疾病相关，例如：Leber遗传性视神经萎缩 症（Leber，s hereditary optic neuropathy)类中风发作症候群（Mitochondrial Enephalomyopathy,Lactic Acidosis, and Strokelike Episodes,MELAS)、肌抽跃療痫合并 红色I监楼肌纤维症（Myoclonic Epilepsy Associated With Ragged-Red Fibers，MERRF) 等。另外，神经退化性疾病，例如亨丁顿舞蹈症、阿兹海默症、帕金森氏症等疾病也与线粒体 分裂融合的能力失调相关（Ghavami S et al.，2014)。此外，老化现象或年纪增长会使线粒 体中突变DNA增长并且累积，而导致相关疾病的产生，例如老年黄斑部病变（age-related macular degeneration, AMD) (Brennan LA et al. , 2014 ；Jarrett SG et al.，2010)与皮 肤老化等（Blatt T et al.，2005 ;Makrantonaki E et al.，2007)。
[0004] 为能延缓皮肤老化，人们会使用许多美容保养产品，例如玻尿酸、维生素 A与维生 素 C、抗氧化剂、防晒剂等，或是寻求医学美容诊所改善老化现象，例如雷射、肉毒杆菌、电波 拉皮等。但是，目前现有的美容方法皆无法自根本改善或延缓皮肤老化现象的发生。另有 研究证实，注射间质干细胞能有效地改善皮肤皱纹等老化现象，而使干细胞疗法被认为是 延缓皮肤老化的契机。然而实际上，干细胞取得不容易，大量培养须耗费过多时间与金钱， 并且，干细胞移植具有突变产生肿瘤或是产生排斥反应等风险。因此，目前仍未有一种安全 性高且能确实有效地改善皮肤老化现象的方法。
[0005] 在1989年的研究指出，给予外源性线粒体与细胞共同培养，必须通过直接注射或 膜融合后，线粒体始能进入细胞内，使带有基因缺陷的线粒体的细胞恢复正常功能（King MP et al.，1988 ;King MP et al.，1989)。许多研究也证实，单纯将细胞与线粒体共培养， 无法使线粒体进入细胞内（Chang JC et al.，2013;Spees JL et al.，1989)，因而也无法 得知直接给予外源性线粒体是否能进入细胞。而由先前技术的内容可知，不同细胞对于摄 入外来线粒体的能力可能不同，因此，在线粒体进入细胞的途径不明前，研究人员无法通过 调整实验条件，使与线粒体相关的实验加以重复实施。
[0006] 再者，虽然细胞通过吞嗤作用（phagocytosis)摄入外源物质，如细菌等，但是，经 吞嗤途径被摄入的外源物质会与溶酶体（Iysosome)形成吞嗤溶解小体（phagolysosome), 而使外源物质降解。因此，一般认为，外源线粒体无法通过吞噬作用，而保留在细胞内，并修 复内生性线粒体。而近期研究利用如美国专利第8648034号所揭细胞穿膜胜肽，或如美国 专利公开第20130022666号所揭微脂体包覆线粒体，用以帮助线粒体与细胞膜融合而易于 进入细胞内，提高细胞的氧化呼吸作用。但是，上述方法虽然可以促进线粒体送入细胞中， 但其所使用的载体，如穿膜胜肽与微脂体，可能会引起线粒体与细胞膜破裂，造成线粒体的 损伤与目标细胞的毒性。
【发明内容】
[0007] 本发明的主要目的即在于提供一种组合物，其包含有效量的外源性线粒体。
[0008] 本发明的次一目的在于提供该组合物的用途，其用以修复受损线粒体或改善细胞 老化。
[0009] 本发明的另一目的在于提供一种修复细胞的方法，其将有效量的外源性线粒体投 予至一个体中，使该外源性线粒体完整地被送至细胞内，据以达成修复受损细胞、改善或预 防细胞老化的功效。
[0010] 为能达成上述目的，本发明的一实施例所揭一种组合物，其包含有一外源性线粒 体，以及至少一药学上或美容上可接受的载体。
[0011] 较佳地，该组合物更包含有一辅剂，而该辅剂为血清、血浆、补体或至少上述二成 份的组合所组成的群。
[0012] 较佳地，所述外源性线粒体由细胞中萃取而得。
[0013] 较佳地，所述外源性线粒体通过离心纯化的方法自细胞中获得。
[0014] 在本发明的另一实施例中，上述医药组合物的用途用以改善皮肤细胞的老化现 象。
[0015] 在本发明的又一实施例中，上述组合物的用途用以修复受损细胞。
[0016] 本发明的一实施例中所揭一种修复细胞的方法，其将一有效量的外源性线粒体投 予至一个体，使所述外源性线粒体进入细胞中，取代受损或老化的线粒体。
[0017] 较佳地，所述外源性线粒体在投予至该个体前，以由血清、血浆及补体所组成的群 中至少一成分进行前处理。
[0018] 本发明的有益效果为：
[0019] 其一、使用外源性线粒体能克服已知技术中，以异体细胞移植所引发的排斥；
[0020] 其二、外源性线粒体由一般细胞株或活体取得，来源广泛，并且不会对人体健康有 所危害，例如，已知的细胞移植技术，可能会导致癌症或肿瘤的发生；
[0021] 其三、外源性线粒体能直接进入细胞，与内生性线粒体融合，取代老化细胞或受损 细胞中的受损线粒体，达到减低细胞的氧化压力以及恢复细胞正常功能的功效，并且能够 提供细胞长久直接的保护；
[0022] 其四、外源性线粒体以血清或补体处理后，能够完整地进入细胞，并且避免以如穿 膜胜肽或微脂体（liposome)处理所引起的细胞毒性；
[0023] 其五、外源性线粒体能根本性地改善皱纹及皮肤老化的现象，并且有效地促使胶 原蛋白合成增加。
[0024] 据此，本发明所揭医药组合物具有高度安全性，而通过投予有效量的医药组合物 至一个体，通过外源性线粒体进入细胞中，而能达到修复线粒体受损细胞及改善老化现象 的功能。
【附图说明】
[0025] 图1为具有红色荧光标定的线粒体与经绿色荧光Iysotracker染色的BHK细胞， 共同培养一小时后，摄入的线粒体与细胞内溶酶体（Iysosome)相对位置的结果。
[0026] 图2为具有红色荧光标定的线粒体与BHK细胞共同培养四小时后，摄入的线粒体 与细胞内溶酶体相对位置的结果。
[0027] 图3A及图3B为以扫描式电子显微镜观察外源性线粒体被细胞吞噬的情形，其中， 图3A中的方框表示，低倍率下正被吞噬的线粒体；图3B中的箭号指出，高倍率下正被细胞 伪足吞噬的线粒体。
[0028] 图4为具有红色荧光标定的线粒体与以鬼笔环肽（phalloidin)-FITC染色的BHK 细胞共同培养四小时后，观察线粒体进入BHK细胞的结果，其中，白色横条标示10 μ m。
[0029] 图5为以抗生素 actinomycin D (ActD)处理BHK细胞后，红色线粒体进入BHK细 胞的结果。白色横条标示10 μ m。
[0030] 图6为图4与图5,处理或不处理AcD的BHK细胞，具有外源性线粒体的细胞比例 的统计结果。
[0031] 图7A为未经补体处理的外源性红色线粒体与带有绿色荧光线粒体的BHK细胞共 同培养四小时后，摄入的线粒体与细胞内线粒体相对位置的结果，其中，箭头标示黄色荧 光，代表外源性与内生性线粒体在细胞内位置重叠。
[0032] 图7B为以经C3补体10 μ g/mL处理的外源性线粒体与带有绿色荧光线粒体的BHK 细胞共同培养四小时后，摄入的线粒体与细胞内线粒体相对位