两个締控碳，一个含氧次甲基)和九 个季碳(一个酬幾基，；个締控碳，一个含氧季碳）。HMBC谱中，C曲-29 (C出-30)与C-3，C-4和 C-5，W及H-2与C-I，C-4和C-IO的相关性表明环A为4，4-二甲基-2，5-二締酬部分。HMBC谱 中，此-19与C-I，C-IO，C-5，C-9和C-8，出-6与C-4，C-5，C-7，C-8和C-IO的相关性，W及CH2 (6) -C出(7)-CH(8)自旋系统，表明B环为取代的环庚烧。通过HMBC谱中C出-31与C-23，C-24和 C-25的相关性，可知C-24位连有一个甲基。此外，C曲-27与C-24，C-25和C-26的相关性表明 C-25和C-26之间存在双键。C-9(SC62.7)和C-11(SC60.9)的化学位移表明两者各连有一个 径基基团。综合氨谱，碳谱，歷BC谱和NOESY谱，W及文献关于相关类型核磁数据，可基本确 定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致（图 3)。
[0098] 单纯化合物（n)药理作用试验
[0099] 一、材料和仪器
[0100] 化7702肝细胞株由中国科学院上海生命科学研究所提供。化合物（n)自制，方法 见实施例1 ,HPLC归一化纯度大于98%。高糖DMBl培养基、高糖DMEM/F12 = 1:1培养基、胎牛 血清均购于Hy化one。抓TA购于上海试剂一厂。台吩蓝购于北京化工厂。无糖DMEM培养基购 于Gibco。膜酶、MTT、DMS0均购于AmrescoeLDH释放法检测试剂盒购于GENMDEdALT生化检测 试剂盒、AST生化检测试剂盒、LDH生化检测试剂盒均购于美国贝克曼试剂有限公司。 Western及IP细胞裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、MDA检测试剂盒均购于碧云天生 物技术研究所。
[0101] 0)2培养箱（ShekLab 2300)，电热恒溫解育箱（上海跃进医疗器械厂），缺氧培养 盒(长沙长锦科技有限公司），GasALe;rt Extreme氧气检测仪(加拿大BW TechnoLogies)，酶 标仪（美国BioTek Epoch),全自动生化仪（Beckman LX20)，离屯、机（德国Eppendorf centrifuge 541加），孔板离屯、机（德国Eppendorf centri扣ge 5430R)，电子微量天平 (METTLER TOLEDO AL104)，PH仪（Thermo ORION 3 STAR)。
[0102] 二、试验方法
[0103] 1、细胞分组
[0104] 将细胞分为6组，每组6个复孔：
[0105] (1)正常培养组(N组）：完全培养基，正常条件下培养；
[0106] (2)缺血再灌注组（IR组）：完全培养基正常条件培养化后，模拟缺氧化，再灌注地；
[0107] (3)化合物（n)组：
[0108] REl组：化合物（n )0.5ng/mL预处理化；
[0109] RE2组：化合物（n )5ng/mL预处理化；
[0110] RE3组:化合物（n )5化g/mL预处理化;模拟缺氧化，再灌注地；
[0111] (4)生理盐水组(NS组）：W与化合物（n)同等体积的生理盐水预处理化，模拟缺氧 她，再灌注地。
[0112] 2、化合物（E)的预处理
[0113] (1)化合物（E)的配制：将Img化合物（E)溶解于SOOmL生理盐水中。移液枪吸取 2.5mL于第一支离屯、管中，用生理盐水稀释至IOmL配制成浓度为5(K)ng/mL的化合物（E)溶 液。从第一支离屯、管中吸取ImL至第二支离屯、管中，用生理盐水稀释至IOmL配制成浓度为 50ng/mL的化合物（n )溶液。从第二支离屯、管中吸取ImL至第S支离屯、管中，用生理盐水稀 释至IOmL配制成浓度为5ng/mL的化合物（n )溶液。作好标记。
[0114] (2)化合物（E)预处理:正常培养组和缺血再灌注组W每孔I(K)化新鲜的完全培养 基更换。REl组每孔加入5ng/mL的化合物（n )溶液10化和新鲜的完全培养基90化，RE2组每 孔加入50ng/mL的化合物（n )溶液10化和新鲜的完全培养基90化，RE3组每孔加入50化g/mL 的化合物（n )溶液10化和新鲜的完全培养基90化。生理盐水组每孔加入生理盐水10化和新 鲜的完全培养基90iiL。轻轻摇动96孔板，使药液充分混混匀，放入C〇2培养箱中解育Ih。
[0115] 3、肝细胞体外模拟缺血再灌注损伤模型的建立：
[0116] (1)体外模拟缺血过程:预处理时间结束后，从细胞培养箱中取出第一块96孔板， 正常培养组每孔用10化L完全培养基更换，放入C〇2培养箱中继续培养化。从C〇2培养箱中取 出第二块96孔板，缺血再灌注组、化合物（n )预处理组和生理盐水组每孔用10化L无糖DMEM 培养基置换完全培养基，放入缺氧培养盒中，培养盒中放入盛有50mL灭菌水的无菌小瓶保 持饱和湿度。将缺氧培养盒放入37°C恒溫解育箱中，进气口连接94%化-5 %C02-1 %化混合 气体，出气口连接氧气检测仪。W化/min的气体流量通入混合气体，当氧气检测仪显示出气 口氧气浓度<1 %时，调节混合气体流量300mL/min维持出气口氧气浓度<1 %。W此模拟缺血 过程化。
[0117] (2)体外模拟再灌注过程:从C〇2培养箱中取出第一块96孔板，正常培养组每孔更 换I(K)化新鲜的完全培养基，放入C〇2培养箱中继续培养地。从缺氧培养盒中取出第二块96 孔板，缺血再灌注组、化合物（n )预处理组和生理盐水组每孔用10化L新鲜的完全培养基置 换无糖DMEM培养基，放入C〇2培养箱中正常条件下(37°C、5 % C〇2、95 %空气、饱和湿度)培养 地，模拟再灌注过程。
[011引3、指标检测
[0119] 3. IMTT法检测肝细胞活力
[0120] (I)MTT溶液配制：用电子微量天平称取250mg MTT，放入小烧杯中，加入50mL PBS 揽拌30min，使之充分溶解，即为浓度为5mg/mL的MlT溶液。在超净工作台中用0.22皿的微孔 滤器除菌，分装为每支ImL, 4°C避光保存备用。
[0121] (2)细胞准备：按上述方法进行细胞分组，并另设调零孔。并按上述方法进行化合 物（n)预处理和体外模拟缺血再灌注过程。
[0122] (3)呈色：终末时间点每孔加入5mg/mL的MTT溶液20化，放入37°C、5 % C〇2、95 %空 气、饱和湿度的C〇2培养箱中继续培养4h。终止培养，小屯、吸弃孔内上清液，每孔加入10化L DMSO溶液，微量振荡器上振荡1 Omin，使结晶物充分溶解。
[0123] (4)比色:选择570皿波长，在酶标仪上测定各孔光吸收度(A)，记录结果。实验重复 2次。
[0124] 3.2乳酸脱氨酶释放法细胞繁殖与毒性检测
[0125] 按GENM抓乳酸脱氨酶释放法细胞繁殖与毒性定量检测试剂盒说明书操作，重复2 次。
[0126] (1)按上述方法准备待测细胞，并另设无细胞的培养液(背景空对照孔)和未处理 的后续裂解的细胞(样品最大酶活性对照孔），作好标记。
[0127] (2)到规定的检测时间点前1小时，从C〇2培养箱中取出待测的96孔细胞培养板，加 入10化GENM抓裂解液到未处理的后续裂解的细胞孔里，同时加入10化GENM抓补充液到其 余所有检测孔里。放回CO播养箱中继续培养1小时即规定检测时间。
[012引（3)从C02培养箱取出待测96孔细胞培养板，放入孔板离屯、机离屯、lOmin，速度为 250g0
[0129] (4)分别小屯、移取SOiiL上清液到新的96孔板的相应孔里，同时作好标记。
[0130] (5)混匀GENM抓反应液，每孔分别加入50化GENM抓反应液，再分别每孔加入10化 GENM邸显色液，摇动96孔板混匀。
[0131] (6)在室溫下解育30min，避免光照。
[0132] (7)每孔分别加入10化GENM邸终止液。
[0133] (8)即刻放进酶标仪里测定光吸收度(A)，选择波长570nm。
[0134] (9)根据W下公式计算细胞死亡率：
[0135] 处理样品实际吸光读数=处理样品孔吸光读数一样品对照孔吸光读数一背景空 对照孔吸光读数
[0136] 样品细胞最大酶活性的实际吸光读数=样品最大酶活性对照孔吸光读数一样品 对照孔吸光读数一背景空对照孔吸光读数
[0137] 细胞死亡率=(处理样品实际吸光读数-样品细胞最大酶活性的实际吸光读数） X100%
[013引3.3肝细胞功能指标的测定：
[0139] 按上述方法进行细胞分组、预处理和模拟缺血再灌注损伤。到终末时间点分别将 各孔细胞培养上清液10化L收集于化管中，每管分别加入10化L完全培养基稀释至20化L，室 溫下离屯、5min，速度为1200r/min。取上清液在全自动生化仪下检测ASL、ALT和LDH水平。实 验重复2次。
[0140] 4、统计学处理
[0141] 使用SPSS 13.0软件包进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差(x±s)表示， 组间比较采用单因素方差分析，P<〇.05差异有统计学意义。