r>[0142] S、结果及结论
[0143] 1、化合物（n)预处理对缺血再灌注损伤肝细胞活力的影响
[0144] IR组肝细胞活力比N组明显下降（P<0.05)，表明体外模拟缺血再灌注过程成功地 造成了肝细胞的缺血再灌注损伤。给予5ng/mL化合物（n )预处理1小时，缺血再灌注损伤肝 细胞的活力较缺血再灌注组和生理盐水组增强(P<〇.05)，但未能恢复到正常组肝细胞活力 水平(P<0.05)，生理盐水组则与缺血再灌注组差异无统计学意义(P〉0.05)。而0.5ng/mL和 50ng/mL浓度的化合物（E)预处理1小时，均未能增强缺血再灌注损伤肝细胞的活力（P〉 0.05)，其肝细胞活力与生理盐水组之间差异也无统计学意义(P〉0.05)。结果见表4(a表示 与N组比较，P<0.05，差异有统计学意义;> 表示与IR组和NS组比较，P<0.05，差异有统计学意 义，下同）。
[0145] 2、化合物（n)预处理对肝细胞缺血再灌注损伤的细胞繁殖和毒性的影响
[0146] 与正常组相比，体外模拟缺血再灌注损伤使细胞死亡率>90%。给予5ng/mL化合物 (H)预处理1小时，肝细胞死亡率下降约35%，差异有统计学意义(P<0.05)，但其细胞死亡 率仍比正常组高约50%，差异有统计学意义(P<0.05);而生理盐水组肝细胞死亡率比缺血 再灌注组虽略有下降（约为8%)，但差异无统计学意义。0.5ng/mL和50ng/mL浓度的化合物 (H)预处理1小时，肝细胞死亡率比缺血再灌注组分别降低6%和13%，但差异无统计学意 义(P〉0.05);而与生理盐水组的肝细胞死亡率相近(P〉0.05)。结果见表5。
[0147] 3、化合物（n)预处理对缺血再灌注损伤肝细胞肝功能指标的影响
[0148] 与正常组比较，缺血再灌注损伤组细胞培养上清液中的ALT水平未见明显升高(P〉 0.05);而AST、LDH水平W及AST/ALT比值显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。给予5ng/ mL化合物（n )预处理1小时，肝细胞培养上清液中的AST、LDH水平W及AST/ALT比值较缺血 再灌注组和生理盐水组降低，但仍较正常组高(P<〇. 05);而ALT水平与缺血再灌注组和生理 盐水组比较，差异无统计学意义(P〉〇.〇5)。生理盐水组细胞培养上清液中的ALT、AST、LDH水 平W及AST/ALT比值与缺血再灌注组之间差异无统计学意义(P〉0.05)。0.5ng/mL和50ng/mL 化合物（n )预处理1小时，均未能使肝细胞培养上清液中的AST、LDH水平降低(P〉0.05)。结 果见表6。
[0149] 本研究显示，化合物（n)(RE2组)使肝细胞对之后经历的缺血再灌注损伤的耐受 力增强，表现为肝细胞活力增强，细胞死亡率降低。W上结果提示，化合物（H)预处理能够 减轻人肝细胞缺血再灌注损伤，起到肝细胞保护作用。
[0150] 表4 MTT法检测化合物（n )预处理对缺血再灌注损伤肝细胞活力的影响
[0153]表5 LDH释放法肝细胞繁殖与毒性定量检测细胞死亡率
[01巧]表6肝细胞培养上清液中ALT、AST、LDH水平的变化(n = 5)
[0157]~本实施例提供的一种保护肝脏的药，它由上述贝壳杉烧类二祗化合物（I)、=祗化' 合物（H)和药学上可接受的载体组成；按照总量为100%的重量百分含量计，化合物（I)为 25% .，化合物（n )为25%，其余为药学上可接受的载体即50%。运种药分别与上述单纯的 化合物（I) W及化合物（n)相比，使肝细胞对之后经历的缺血再灌注损伤的耐受力更强，具 有更好的保护肝脏作用，明显具有协同作用，并且副作用小。
[015引实施例2:
[0159] -种保护肝脏的药，它由上述贝壳杉烧类二祗化合物（I)、=祗化合物（E)和药学 上可接受的载体组成；按照总量为100%的重量百分含量计，化合物（I)为10%.，化合物 (n )为30%，其余为药学上可接受的载体即60%。
[0160] 实施例4:
[0161] -种保护肝脏的药，它由上述贝壳杉烧类二祗化合物（I)、=祗化合物（E)和药学 上可接受的载体组成；按照总量为100%的重量百分含量计，化合物（I)为28%.，化合物 (n )为12%，其余为药学上可接受的载体即60%，药学上可接受的载体具体为淀粉。
[0162] 实施例5:
[0163] -种保护肝脏的药，它由上述贝壳杉烧类二祗化合物（I)、=祗化合物（E)和药学 上可接受的载体组成；按照总量为100%的重量百分含量计，化合物（I)为30%.，化合物 (n)为30%，其余为药学上可接受的载体即40%，药学上可接受的载体具体为淀粉。
[0164] 实施例6:
[0165] -种保护肝脏的药，它由上述贝壳杉烧类二祗化合物（I)、=祗化合物（E)和药学 上可接受的载体组成；按照总量为100%的重量百分含量计，化合物（I)为25%.，化合物 (n )为25 %，其余为药学上可接受的载体即50 %，其余为葡萄糖，使用时，作为冲剂再加入3 倍体积的水，制成口服液。
[0166] 实施例7:
[0167] -种保护肝脏的药，它由上述贝壳杉烧类二祗化合物（I)、=祗化合物（E)和药学 上可接受的载体组成；按照总量为100%的重量百分含量计，化合物（I)为35%.，化合物 (n )为35 %，其余为药学上可接受的载体即30 %，其余为葡萄糖，使用时，作为冲剂再加入3 倍体积的水，制成口服液。
【主权项】
1. 一种保护肝脏的药，其特征在于：它由贝壳杉烧类二祗化合物（I)、Ξ祗化合物（π ) 和药学上可接受的载体组成； 贝壳杉烧类二祗化合物（I)具有下述结构式：Ξ祗化合物（Π )具有下述结构式：按照总量为100 %的重量百分含量计，所述贝壳杉烧类二祗化合物（I): 10-35 % ; 所述Ξ祗化合物（Π ): 10-35% ; 贝壳杉烧类二祗化合物（I)和Ξ祗化合物（Π )之和:35-70 % ; 其余为药学上可接受的载体。2. 权利要求1所述一种保护肝脏的药，其特征在于： 贝壳杉烧类二祗化合物（I): 25 % ; Ξ祗化合物（Π ):25%; 其余为药学上可接受的载体。3. 权利要求1所述一种保护肝脏的药，其特征在于:所述贝壳杉烧类二祗化合物（I)由 W下步骤制备而成： a、 小豆違的干燥成熟果实粉碎，用80%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味， 依次用石油酸、乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物 和正下醇萃取物； b、 步骤a中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，依次用15 %乙醇和75 %乙醇洗脱，收集 75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱物浸膏;所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂； C、步骤b中75 %乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、30:1、15:1 和1:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分； d、步骤C中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲 烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分； e、步骤d中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇 水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I); 所述Ξ祗化合物（Π )由W下步骤制备而成： A、 将文冠果的干燥枝粉碎，用70~80%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味， 依次用石油酸、乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物 和正下醇萃取物； B、 步骤A中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用80% 乙醇洗脱10个柱体积，收集80 %乙醇洗脱液，减压浓缩得80 %乙醇洗脱物浸膏； C、 步骤B中80%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1、45:1、25:1、15:1 和1:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分； D、 步骤C中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和8:1的二氯甲 烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分； E、 步骤D中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇 水溶液等度洗脱，收集10~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（Π )。4.权利要求3所述一种保护肝脏的药，其特征在于： 步骤A中用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为75%。
【专利摘要】本发明属于药物技术领域，具体涉及一种保护肝脏的药。一种保护肝脏的药，它由贝壳杉烷类二萜化合物(Ⅰ)、三萜化合物(Ⅱ)和药学上可接受的载体组成；所述贝壳杉烷类二萜化合物(Ⅰ)：10-35％；所述三萜化合物(Ⅱ)：10-35％；贝壳杉烷类二萜化合物(Ⅰ)和三萜化合物(Ⅱ)之和：35-70％；其余为药学上可接受的载体。体外试验证明该药物能够减轻人肝细胞缺血再灌注损伤，起到肝细胞保护作用。
【IPC分类】A61K31/366, A61P1/16, A61K31/56
【公开号】CN105534992
【申请号】CN201511004598
【发明人】王赛波
【申请人】温州统益生物医药科技有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年12月27日