使用吸附介质诊断感染性疾病的方法
【专利说明】使用吸附介质诊断感染性疾病的方法
[0001]发明背景
[0002] 本申请要求2013年11月8日提交的美国临时专利申请第61/902,070号的优先权 益，在此出于所有目的将其全部并入作为参考。
[0003] 感染性疾病的早期检测对于控制其传播、指导治疗和改善患者预后来说是必需 的。例如，致命病原体爆发的早期准确鉴定可以防止全球大流行的发生。目前许多用于例如 病毒(包括埃博拉和相关的线状病毒)或抗药细菌导致的血流感染的诊断方法要求进行至 少24小时或更久。在本领域对于使检测个体样品中病原体的存在所需的时间最小化的方法 存在需求。目标在于当病原体仍以很低的浓度存在时对其进行检测，如果可能，在临床症状 明显之前。然后早期干预可以使感染的强度和持续时间最小化，从而降低发病率和死亡率。
[0004] 在一些情形中，样品中细胞例如血细胞(例如，红血细胞和白血细胞）的存在降低 了测定方法的特异性和灵敏度。目前，不存在用于从生物样品快速分离和收集感染性病原 体从而使得病原体可以在以很低的量存在时得以鉴定或分析的手段。此外，在本领域存在 对于可以提高检测病原体的现有诊断方法的灵敏度的技术的需求。本发明满足这些及其他 需求。
[0005] 发明概述
[0006] -方面，本发明提供用于浓缩生物样品中存在的宽范围的感染性病原体和毒素的 体外方法，上述生物样品获自怀疑被所述病原体感染的对象。该方法包括：（a)在形成包括 吸附介质和所述病原体的粘附复合物的条件下，使获自对象的生物样品与广谱吸附介质接 触；（b)在保持复合物的同时将粘附复合物与样品中没有包括在复合物中的组分分离，例 如，通过将粘附复合物用缓冲溶液洗涤;和(d)通过将洗脱缓冲液应用于复合物收集粘附复 合物的病原体，从而浓缩洗脱液中的感染性病原体。在一些实施方式中，该方法还包括检测 分离的感染性病原体。在一些情形中，检测分离的感染性病原体包括比色测定、免疫测定、 酶联免疫吸附测定(ELISA)、基于PCR的测定、任选染色的病原体生长测定或其组合。
[0007] 在一些实施方式中，洗涤缓冲液是普通盐水溶液。在一些实施方式中，洗脱缓冲液 是高离子强度或高渗盐水溶液。
[0008] 在一些实施方式中，生物样品选自全血、血清、血浆、尿、排泄物、痰、泪、唾液、支气 管灌洗液、其他体液及其组合。
[0009] 在一些实施方式中，吸附介质是其表面上具有至少一种多糖分子吸附剂的高表面 积的固体基质。在一些实施方式中，通过端点附着(end-point attachment)将至少一种多 糖吸附剂附着于固体基质的表面。在一些实施方式中，至少一种多糖吸附剂是选自肝素、硫 酸乙酰肝素、甘露糖、硫酸葡聚糖、透明质酸、水杨酸、壳聚糖及其组合的成员。在一些实施 方式中，甘露糖是D-甘露糖或D-甘露糖聚合物。在一些实施方式中，至少一种多糖吸附剂是 肝素和甘露糖。
[0010] 在一些实施方式中，固体基质包括大量刚性聚合物珠。大量刚性聚合物珠可以是 刚性聚乙烯珠。
[0011] 在一些实施方式中，病原体选自恶性疱原虫(Plasmodium falciparum)、间日疱原 虫（Plasmodium vivax)、卵形症原虫（Plasmodium ovale)、三日症原虫（Plasmodium malariae)、埃博拉病毒(EBOV)、非EBOV线状病毒(filovirus)、黄病毒科(Flaviviridae)、 金黄色葡萄球菌（Streptococcus aureus)、大肠杆菌（Escherichia coli)、碳青霉稀 (carbapenem)抗性肠杆菌科(enterobacteriaceae) (CRE)细菌、产生ESBL的病原体、万古霉 素抗性肠球菌(enterococci)(VRE)细菌、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、肺炎 克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca)、奠肠球菌 (Enterococcus faecal is)、屎肠球菌（Enterococcus faecium)、白色念珠菌（Candida albicans)、巨细胞病毒(CMV)、腺病毒、单纯性疱疹病毒1(HSV1 )、单纯性疱疹病毒2(HSV2) 及其任意组合。
[0012] 在第二方面，本发明提供用于减少或消除来自生物样品的血细胞的体外方法，上 述生物样品获自怀疑被病原体感染的对象。该方法包括：（a)在形成包括吸附介质和样品中 存在的病原体的粘附复合物的条件下，使获自对象的生物样品与任选地广谱的吸附介质接 触;和(b)在保持粘附复合物的同时将样品的血细胞和粘附复合物分离，从而减少或消除来 自样品的血细胞。在一些实施方式中，步骤(b)还包括将粘附复合物用盐水溶液洗涤。在一 些实施方式中，该方法还包括：（c)将洗脱缓冲液应用于粘附复合物;和(d)收集粘附复合物 的病原体。在一些实施方式中，该方法还包括检测分离的感染性病原体。在一些情形中，检 测分离的感染性病原体包括比色测定、免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、基于PCR的测 定、病原体生长测定或其组合。
[0013] 在一些实施方式中，洗涤缓冲液是盐水溶液。在一些实施方式中，洗脱缓冲液是高 离子强度或高渗盐水溶液。
[0014] 在一些实施方式中，生物样品选自全血、血清、血浆、尿、排泄物、痰、泪液、唾液、支 气管灌洗液、其他体液及其组合。
[0015] 在一些实施方式中，吸附介质是其表面上具有至少一种多糖吸附剂的高表面积的 固体基质。在一些实施方式中，通过端点附着将至少一种多糖吸附剂附着于固体基质的表 面。在一些实施方式中，至少一种多糖吸附剂是选自肝素、硫酸乙酰肝素、甘露糖、硫酸葡聚 糖、透明质酸、水杨酸、壳聚糖及其组合的成员。在一些情形中，甘露糖是D-甘露糖或D-甘露 糖聚合物。在一些情形中，至少一种多糖吸附剂是肝素和甘露糖。
[0016] 在一些实施方式中，固体基质包括大量刚性聚合物珠。大量刚性聚合物珠可以是 刚性聚乙烯珠。
[0017] 在一些实施方式中，病原体选自恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原 虫、埃博拉病毒(EBOV)、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、碳青霉烯抗性肠杆菌科(CRE)细菌、产 生ESBL的病原体、万古霉素抗性肠球菌(VRE)细菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷 伯菌、粪肠球菌、屎肠球菌、白色念珠菌、巨细胞病毒(CMV)、单纯性疱疹病毒I (HSVl )、单纯 性疱疹病毒2(HSV2)及其任意组合。
[0018] 在第三方面，本发明提供用于在怀疑被疟原虫感染的对象中诊断疟疾的体外方 法。该方法包括：（a)在形成包括吸附介质和被疟原虫感染的样品中存在的细胞的粘附复合 物的条件下，使获自所述对象的样品与吸附介质接触；（b)通过检测吸附介质的物理变化， 确定粘附复合物的存在;和(c)基于吸附介质相比较于已经与对照样品接触的参考吸附介 质的物理变化，预测对象具有疟疾。在一些实施方式中，该方法还包括生成已经与对照样品 接触的参考介质的物理变化的标准曲线。
[0019] 在一些实施方式中，生物样品选自全血、血清、血浆、尿、排泄物、痰、泪液、唾液、支 气管灌洗液、其他体液及其组合。在一些情形中，样品是全血。
[0020] 在一些实施方式中，对照样品是来自健康对象的样品。在一些实施方式中，对照样 品是来自具有疟疾的对象的样品。
[0021] 在一些实施方式中，物理变化是吸附介质的颜色。
[0022] 在一些实施方式中，吸附介质是其表面上具有至少一种多糖吸附剂的高表面积的 固体基质。在一些实施方式中，通过端点附着将至少一种多糖吸附剂附着于固体基质的表 面。在一些实施方式中，至少一种多糖吸附剂是选自肝素、硫酸乙酰肝素、甘露糖、硫酸葡聚 糖、透明质酸、水杨酸、壳聚糖及其组合的成员。在一些情形中，甘露糖是D-甘露糖或D-甘露 糖聚合物。在一些情形中，至少一种多糖吸附剂是肝素和甘露糖。
[0023] 在一些实施方式中，固体基质包括大量刚性聚合物珠。大量刚性聚合物珠可以是 刚性聚乙烯珠。
[0024] 在第三方面，本发明提供用于确定对象被感染性病原体感染的方法。该方法包括： (a)使获自所述对象的全血样品与吸附介质接触以形成包括吸附介质和样品中存在的病原 体的粘附复合物；（b)通过检测吸附介质的物理变化，确定粘附复合物的存在;和(C)基于吸 附介质相比较于已经与对照样品接触的参考吸附介质的物理变化，预测对象被感染性病原 体感染。在一些实施方式中，该方法还包括生成已经与对照样品接触的参考介质的物理变 化的标准曲线。
[0025]在一些实施方式中，生物样品选自全血、血清、血浆、尿、排泄物、痰、泪液、唾液、支 气管灌洗液、其他体液及其组合。在一些情形中，样品是全血。
[0026]在一些实施方式中，对照样品是来自健康对象的样品。在一些实施方式中，对照样 品是来自被感染性病原体感染的对象的样品。
[0027]在一些实施方式中，物理变化是吸附介质的颜色。
[0028] 在一些实施方式中，吸附介质是其表面上具有至少一种多糖吸附剂的高表面积的 固体基质。在一些实施方式中，通过端点附着将至少一种多糖吸附剂附着于固体基质的表 面。在一些实施方式中，至少一种多糖吸附剂是选自肝素、硫酸乙酰肝素、甘露糖、透明质 酸、水杨酸、壳聚糖及其组合的成员。在一些情形中，甘露糖是D-甘露糖或D-甘露糖聚合物。 在一些情形中，至少一种多糖吸附剂是肝素和甘露糖。
[0029] 在一些实施方式中，固体基质包括大量刚性聚合物珠。大量刚性聚合物珠可以是 刚性聚乙烯珠。
[0030] 在一些实施方式中，病原体选自恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原 虫、埃博拉病毒(EBOV)、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、碳青霉烯抗性肠杆菌科(CRE)细菌、产 生ESBL的病原体、万古霉素抗性肠球菌(VRE)细菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷 伯菌、粪肠球菌、屎肠球菌、白色念珠菌、巨细胞病毒（CMV)、腺病毒、单纯性疱疹病毒1 (HSV1)、单纯性疱疹病毒2(HSV2)及其任意组合。
[0031] 当阅读以下详述时，这些和其他方面、目标和实施方式将会更加显而易见。
[0032] 附图简述
[0033]图1显示了本发明的浓缩器的实施方式。
[0034] 发明详述
[0035] 本发明提供了用于传染病检测和诊断的方法。有利地，本发明可以用于从患者样 品中分离细菌、病毒、细胞因子和其他病原体(例如，寄生虫），其可以用于感染的早期检测。 在本发明另一方面，使用本文所述的吸附介质，可以从样品中除去可以干扰分析物检测测 定的细胞和其他非分析物。
[0036]本文还提供了用从取自人对象的样品检测循环pRBC和疟原虫属的简单发色测定 方法。该方法也可以用于在抗疟疾治疗的开始和/或完成过程中监测疟疾进展。
[0037]已经出人意料地发现，通过使感染的血液与已共价结合至吸附介质的多糖(例如， 肝素，或硫酸乙酰肝素)接触