灵长类帕金森病模型行为学评价优化方法
【专利摘要】本发明属于生命科学技术领域，具体涉及灵长类帕金森病模型行为学评价优化方法：建立恒河猴PD动物模型：给恒河猴肌肉注射MPTP，每天一次，根据个体敏感性差异，剂量为0.2?0.5mg/kg，直至出现典型、稳定的PD临床症状；在注射MPTP期间，每天于2个固定时间段对恒河猴进行行为学评价，将一周的评分均值作为该周的最后得分。本发明提供了一套完善的灵长类PD模型行为学评价方法，可用于新药药效评估，各新药的横向、纵向对比研究。该评价方法吸收、摒弃了各个评分量表的优缺点，并结合实践经验、自身猕猴临床表现特征，能够全方位、准确反映个体临床差异性，如个体敏感性差异、发病严重程度差异、发病先后顺序差异、个体PD特征差异。
【专利说明】
灵长类帕金森病模型行为学评价优化方法
技术领域
[0001] 本发明属于生命科学技术领域，具体设及灵长类帕金森病模型行为学评价优化方 法。
【背景技术】：
[0002] 帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种老年神经退行性疾病，发病率仅次于 阿尔茨海默病的，主要临床症状为震颤、肌肉强直、运动迟缓和姿势平衡异常，主要病理特 点为黑质多己胺(dopamine，DA)能神经元严重变性缺失和出现路易小体（lewy body, LB)。 PD主要发生于60岁W上的老龄人群，发病率达1%-2%，40岁W上人群发病率超过0.1%，呈 现一种年轻化发病趋势。随着人口平均寿命的延长和老龄化的出现，ro的发病率出现上升 趋势，预计到2030年，中国帕金森病人数将占全球一半W，运引起了各国学者的高度重视。
[0003] 目前对PD病因学和发病机理的研究都依赖于动物模型。到目前为止，已知的动物 模型有大鼠、小鼠、猫、非人灵长类模型等，但无论从遗传学、基因同源性、生理生化特点、病 理特征等方面来看，非人灵长类动物模型有着其他动物模型无法比拟的优势，能够真正模 拟人类PD发病机制及进程。至今，选用灵长类动物制作PD模型的方法多种多样，有急性偏侧 损毁模型、急性双侧损毁模型（如腹腔、肌肉注射造模试剂)和亚急性或慢性系统性损毁模 型(如肌肉注射、鼻内喷雾造模试剂)等，每种造模方式优缺点各异，动物临床表现也差距较 大。由于帕金森病及其模型的的诊断主要依靠行为学评价，但目前行为学评分标准参差不 齐，侧重点各异，如Kurlan更适合造模阶段的评价，而化nadian评分量表则更适合药效的评 价，没有一套完善的、综合的、通用的灵长类PD模型评分标准。基于此，本发明拟在建立一种 灵长类帕金森恒河猴模型基础上，将前人研究结果与自身实验相结合，归纳总结出一套完 整的PD灵长类模型综合评价标准，W期为各灵长类模型的行为学评价、药效评价提供横向、 纵向对比分析基础。
【发明内容】
[0004] 本发明的技术方案提供了一种灵长类帕金森病模型行为学评价优化方法，为建模 阶段及药效评价阶段灵长类帕金森病模型的行为学评价提供一种可靠的、灵敏的评价方 法。
[0005] 灵长类帕金森病模型行为学评价优化方法，包括W下步骤:建立恒河猴PD动物模 型:给恒河猴肌肉注射MPTP，每天一次，根据个体敏感性差异，剂量为0.2-0.5mg/kg，直至出 现典型、稳定的PD临床症状;在注射MPTP期间，每天于2个固定时间段对恒河猴进行行为学 评价，将一周的评分均值作为该周的最后得分。
[0006] 所述的行为学评价方法，包括综合行为学评分量表即化Q评分量表，见表4，通过动 态监测模型进展，结合动物发病实际情况，对比化Q评分量表，综合分析。
[0007] 所述的行为学评价方法，采用全天摄像、人工描计、人为刺激的方式。
[000引所述的在阳性药效评价期间，每天于2个固定时间段对恒河猴进行行为学评价，统 计分析每2天的行为学得分均值，连续动态评价治疗效果。
[0009] 所述的行为学评价方法，需3人在互不影响的环境下独立完成，且Ξ人评价结果吻 合度需^90%。
[0010] 本发明提供的灵长类帕金森病模型行为学评价优化方法，适用对象为:灵长类系 统性PD模型，灵长类偏侧PD模型，圈养灵长类PD模型，放养灵长类PD模型。
[0011] 本发明提供了一套完善的灵长类PD模型行为学评价方法，可用于新药药效评估， 各新药的横向、纵向对比研究。该评价方法吸收、擬弃了各个评分量表的优缺点，并结合实 践经验、自身雜猴临床表现特征，能够全方位、准确反映个体临床差异性，如个体敏感性差 异、发病严重程度差异、发病先后顺序差异、个体PD特征差异。
【附图说明】
[0012] 图1为实施例的Kurlan量表对全体动物综合结果图；
[0013] 图2为实施例的化pa量表对全体动物综合结果图；
[0014] 图3为实施例的化nadian量表对全体动物综合结果图；
[0015] 图4为实施例的化Q量表对全体动物综合结果图；
[0016] 图5为实施例的第一只动物各评分量表对比分析图；
[0017] 图6为实施例的第二只动物各评分量表对比分析图；
[0018] 图7为实施例的第Ξ只动物各评分量表对比分析图；
[0019] 图8为实施例的第四只动物各评分量表对比分析图；
[0020] 图9为实施例的第五只动物各评分量表对比分析图；
[0021 ]图10为实施例的第六只动物各评分量表对比分析图。
【具体实施方式】
[0022] 结合实施例说明本发明的【具体实施方式】。
[0023] 本发明动物模型的制备
[0024] -、材料与方法
[0025] 1.选取试验动物：
[0026] 选取健康青年恒河猴(川西雜猴亚种）10只，体重3.5-5.化g，年龄3.5-4.5岁，见表 1，并将其随机分为模型组(n = 6)和对照组(n = 4)。提前1月适应性单笼喂养，任其自由饮水 进食。动物由国家实验雜猴种源基地（四川雅安）（动物使用许可证:SCXK(川）：2013-105)提 供。实验中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部《关于善待实验动物的指导性意 见》的规定。
[0027] 表1:各试验雜猴基本资料
[002引
[0029] 2动物处理：
[0030] 模型组采取肌肉注射方式施用MPTP，根据敏感性不同，施用剂量从最小剂量 0.2mg/kg开始，逐渐加大剂量至0.5mg/kg，当动物出现活动量减少、运动迟缓、震颤之后，每 1-3天施用一次MPTP(间隔天数根据个体情况而定），直至出现稳定的临床症状，最后一周通 过经静脉注射的方法施用MPTP，W巩固临床症状。对照组给予同等剂量生理盐水。
[0031] 具体给药细节见表2。
[0032] 表2.造模具体方案
[0033]
[0034] 3.阳性药评价方案:于MPTP最后一次给药后第4周开始进行左旋多己阳性药评价 实验。餐前30min，口服(隐藏于澄汁中）饲喂左旋多己（左旋多己/卡比多己= 12/3mg/kg，卡 比多己作为外周脱簇酶抑制剂，抑制左旋多己在外周降解），每日2次，共4周。
[0035] 4.行为学观察方案:从检疫驯化期开始至处死动物前，均全天无人摄像监控动物； 每日在喂食、喂水期间人为观察并实时记录动物行为学异常情况;每日人为刺激动物，评价 神经功能受损情况:试图用纯形铁棒触摸每只动物的脸、四肢，并作好记录。建模阶段，每日 于2个固定时间段评价动物行为学表现，7天结果作为一个统计点；阳性药评价阶段，2天结 果作为一个统计点。
[0036] 模型成功的判定方法：当模型出现活动量减少、运动迟缓、震颤、肌肉强直时，判定 模型成功;当全部动物出现静止性震颤时，且其余震颤稳定时，停止施用MPTP。
[0037] 最佳行为学评价方案筛选办法:将目前常用行为学评分量表，见表3中各评价指标 的进行对比分析，并将各指标同时用于造模期、模型稳定期、治疗期的评价，挑选出能灵敏 反应动物临床表现的评价指标及评价方法，将其作为化Q量表成员之一;另外根据动物实际 表现，适当增设部分评价方法及指标，用于构成化Q量表。
[00；3 引
[0039] 表4灵长类帕金森病综合行为学评分量(SLQ评分量表）
[0040]
[0041]
[0042]
[0043] 注:可用0.25，0.5分评价，最大程度反应动物实际临床情况。
[0044] 二、结果
[0045] 2.1.建模结果顺利完成恒河猴的造模实验，全部动物经过不同剂量、不同时间注 射MPTP后，成模率为100%，均表现出震颤、行动迟缓、运动启动困难、表情减少、姿势僵硬等 典型临床症状，还表现出嗜睡、打哈欠、便秘、发声减少或不能发声等非典型症状，且运些非 典型症状与PD病人非典型临床症状一致。
[0046] 2.2.阳性药左旋多己治疗效果口服饲喂左旋多己后30-60min内，试验猴活动量明 显增多、兴奋性增强，出现自发活动增多，攀爬增多等明显好转症状。上述情况在治疗后1.5 小时，逐渐消失，2小时后几乎全部消失。
[0047] 2.3.行为学观察结果经过严密的综合对比分析，我们总结出一套完整的、准确、灵 敏反应临床实际情况的灵长类帕金森病综合评分量表，即SLQ评分量表，详细评分细则见表 4,各评分量表评价指标对比分析结果见表4。从表3,4可W看出，SLQ量表包括运动功能和生 活能力两部分，SLQ量表评价指标几乎包含了所有评分量表，各指标所占比重处于各大量表 范围内；评分等级更加明朗，更有利于区分动物间的微小差距。
[004引 2.4. SLQ量表优势分析Kurlan量表、Papa量表、Canadian量表及化Q量表单个量表 分析结果见图1~图4,单只动物各评分量表对比分析结果见图5~图10。从见图1~图4可W 看出，4种评分量表的PD得分曲线整体变化趋势基本一致，Canadian量表稍差;在造模阶段， SLQ量表所得曲线变化趋势与Kur Ian量表几乎一致，但在造模早期阶段，SLQ量表更为敏感； 在药效评价阶段，SLQ量表所得曲线变化趋势与化pa量表几乎一致，但化Q量表评分结果更 能反应动物实际情况，即动物PD症状由重到轻的顺序为:M6>M4>M1>M5>M3>M2。图5~图10显 示，SLQ量表评分曲线变化趋势与化pa量表、Canadian量表特别是Kurlan量表一致，但化pa 量表、Canadian量表无法准确反映病情稍轻动物(M5、M3、M2)的实际临床表现，即评分与正 常组无显著差异性。因此，本发明的综合评分量表不仅适用于造模阶段，特别是造模早期， 而且适用于药效评价阶段的行为学评估。
[0049]综上，本发明的综合评分体系不仅内容全面，且灵敏性、准确性强于目前已用的各 评分量表，能灵敏的评价造模各阶段、药效评价各阶段的行为学变化，能够作为一种行为学 评分标准用于灵长类PD模型研究。
【主权项】
1. 灵长类帕金森病模型行为学评价优化方法，其特征在于，包括以下步骤:建立恒河猴 ro动物模型：给恒河猴肌肉注射MPTP，每天一次，根据个体敏感性差异，剂量为0.2-0.5mg/ kg，直至出现典型、稳定的ro临床症状;在注射MPTP期间，每天于2个固定时间段对恒河猴进 行行为学评价，将一周的评分均值作为该周的最后得分。2. 根据权利要求1所述的灵长类帕金森病模型行为学评价优化方法，其特征在于，所述 的行为学评价方法，包括综合行为学评分量表即SLQ评分量表，通过动态监测模型进展，结 合动物发病实际情况，对比SLQ评分量表，综合分析。3. 根据权利要求1所述的灵长类帕金森病模型行为学评价优化方法，其特征在于，所述 的行为学评价方法，采用全天摄像、人工描计、人为刺激的方式。4. 根据权利要求1所述的灵长类帕金森病模型行为学评价优化方法，其特征在于，所述 的在阳性药效评价期间，每天于2个固定时间段对恒河猴进行行为学评价，统计分析每2天 的行为学得分均值，连续动态评价治疗效果。5. 根据权利要求1所述的灵长类帕金森病模型行为学评价优化方法，其特征在于，所述 的行为学评价方法，需3人在互不影响的环境下独立完成，且三人评价结果吻合度需^ 90% 〇
【文档编号】A61K31/4418GK105878240SQ201610214177
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月7日
【发明人】罗启慧, 史良琴, 陈正礼, 刘衡, 李立科, 黄超, 刘文涛, 方静, 唐丽, 曾文, 龚立
【申请人】四川农业大学