黄酮类化合物在制备抗hiv潜伏的治疗药物中的用图
【专利摘要】本发明属于医药领域，涉及黄酮类化合物在制备抗HIV潜伏的治疗药物中的用途。所述类化合物已被应用于临床试验(I或II期)；本发明经试验表明该类化合物具有诱导HIV潜伏细胞激活的作用，与PKC激活剂Prostratin和组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA联合使用具有协同激活作用，且有效浓度内对细胞毒性较低，可用于制备抗HIV潜伏的治疗药物，将为艾滋病的彻底治愈提供新的途径。
【专利说明】
黄酬类化合物在制备抗ΗIV潜伏的治疗药物中的用途
技术领域
[0001] 本发明属于医药领域，设及黄酬类化合物在制备抗HIV潜伏的治疗药物中的用 途。
【背景技术】
[0002] 研究公开了艾滋病即获得性免疫缺陷综合症，是一种由人体免疫缺陷病毒化uman immunodeficiency virus, HIV)引起的严重传染性疾病。病毒主要感染并破坏人体免疫 系统中最重要的CD4-+ T淋己细胞，导致免疫机能缺陷，抵抗力降低，最终由于各种机会性 感染而死亡。HIV于1981在临床诊断中被发现，随着人类对病毒及其感染过程的分子生物 学研究W及药物研发的不断创新，艾滋病的治疗已经有了突飞猛进的发展。高效抗逆转录 病毒疗法（Hi曲Active Antiretroviral Therapy, HAART)已经可W成功的将病人外周血 病毒量控制在临床检测水平W下（小于50拷贝/mL)，显著提高了病人的生存率和生存质 量（① Yeni, P. G. et al. Treatment for adult HIV infection: 2004recommendations of the International AIDS Society-USA Panel. JAMA. 2004, 292:251-65。② Blankson'J. N. et al. The challenge of viral reservoirs in HIV-1 infection. Annu Rev Med. 2002, 53:557-93)人们曾寄希望于凭借HAART完全清除体内的HIV,从而达到彻底治 愈AIDS的目的。但遗憾的是随后的实践证明，一旦停止药物治疗，病毒载量又会反弹到治 疗前水平化0, D. D. Toward HIV eradication or remission: the tasks ahead. Science， 1998. 280:1866 - 1867.)。研究显示，HIV难W在体内被完全清除的一个重要原因是病人体 内存在潜伏病毒储存库。该潜伏病毒储存库主要是由长期潜伏感染的休眠记忆CD4+T细 胞和在感染初期活化的CD4巧细胞被HIV-1感染后转化为记忆T细胞构成，潜伏细胞在未 受刺激时不表达病毒基因，因而可W逃避机体免疫系统或抗逆转录病毒药物作用（化un，T. W. and Fauci, A. S. Latent reservoirs of HIV:obstacles to the eradication of virus. Proc化tl Acad Sci U S A, 1999. 96:10958-61.)。尽管感染个体携带潜伏感染细胞数 量较少，但衰减率是如此之慢，W至于欲在个体生存期内仅靠 HAART治疗将其彻底清除， 至少在目前而言是不可能的。因此，HIV潜伏感染的静息CD4+T细胞是构成机体内病毒 储藏库（reservoir)的主要部分，同时也是目前临床治疗不能彻底清除HIV的巨大障碍 [Finzi, D. et al. Latent infection of CD4+T cells provides a mechanism for life long persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy. 化化re Med. 1999, 5, 512 - 517]。目前通过各种小分子化合物重激活潜伏的HIV-1前病毒， 同时结合HAART达到减少潜伏病毒储存库甚至清除HIV-1的疗法，被称为免疫激活疗法 (Immunoactivation therapy, IAT)，该疗法已成为治疗艾滋病的主要策略（PrinsJ.M.et al.Immuno-activation with anti-CD3and recombinant human IL-2in HlV-1-infected patients on potent antiretroviral therapy. AIDS, 1999. 13, 2405-10.)，也为病毒储存 库的清除开辟了新的思路。
[0003] 目前用于激活HIV-1潜伏库的药物大致可分为W下几种：（1)细胞因子和趋化 因子：如肿瘤坏死因子aaNF-a);似组蛋白去乙酷化酶抑制剂：如SAHA和VPA; (3)组 蛋白甲基化转移酶抑制剂：如BIX01294 ; (4)DNA甲基化转移酶抑制剂：主要是5-Aza W 及它的衍生物；（5)蛋白激酶C激活剂：如prostratin和bryostatin-1 ; (6)正向转录 延长因子激活剂：如HMBA和JQ1 (巧；（7)其它未命名的物质：如disulfiram。狂ing，S. and Siliciano,民.F. Targeting HIV latency:pharmacologic strategies toward eradication, Drug Discov Today, 2013. 18,541-51);上述诱导剂分别与高效抗逆传录病 毒疗法结合在临床上已取得了初步疗效，但仍存在着譬如激活效率不高或毒副作用等问 题，所W本领域中需要开发更加安全有效的激活药物或寻求可W协同使用的药物。 W04] 搬皮素（如ercetin)是一种从植物中提取的黄酬类化合物，化学名为 3, 3'，4'，5, 7-五径基黄酬（2- (3, 4-Dihy化oxy地enyl) -3, 5, 7-t;rihy^ox5f-4H-1-benzop yr曰n-4-one 3,3' ,4' , 5, 6-Pent曰hydroxyf 1 曰vone Quercetin-S-O-rhamnoside)，石开究 显示其具有多种药理作用，治疗毒性较易控制。目前已被美国抑A批准用于I，I I期临 床试验。(① Benefici曰 1 Effects of Quercetin in Chronic Obstructive Pulmon曰ry Disease(COPD)-Full Text View-Cl inicalTrial s. gov。②Effect of Quercetin in Prevention and Treatment of Oral Mucositis-Full Text View-Cl inicalTrials. gov)。 阳0化]葛根素（化erarin)也属于黄酬类化合物，已经被证明有多种药理作用，目 前已经应用到 II 期临床试验（①化erarin Effects on Alcohol D;rinking-Sl:udy Results-ClinicalTrials. gov。 ② The Effect of Puerarin Injection on Carotid Intima-Media Thickness in Patients With Rheumatoid Arthritis-Full Text View-ClinicalTrials. gov)。
[0006] 然而，迄今为止，尚未见有关于搬皮素（如ercetin)及葛根素任uerarin)具有抗 HIV潜伏治疗作用的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供用于抗HIV潜伏治疗的化学药物。具体设及黄酬类化合物在 制备抗HIV潜伏的治疗药物中的用途，尤其设及本发明的黄酬类化合物激活HIV潜伏感染 细胞，并最终清除所述的潜伏病毒。
[0008] 为了证实所述的化学药物是否对HIV潜伏感染细胞有使其潜伏病毒再次激活作 用，本发明的技术方案如下所述。 阳009] 本发明所用主要试剂材料如下：
[0010] 本发明选用的HIV潜伏感染细胞模型是由本实验室构建的，该细胞是用携带绿色 巧光蛋白巧GF巧报告基因的HIV-1假病毒（P化4-3-EGFP)感染人T淋己细胞化rkat株， 通过细胞分选获得表达GFP阳性和阴性细胞群，该HIV潜伏感染模型已获得中国专利授权 (朱焕章，辛清婷；刘绍辉；唐丽莎；余龙，一种筛选激活潜伏感染HIV化合物的T细胞及制 备方法，专利号：ZL200810038851.讶。该细胞模型生物学特性是整合有HIV病毒假基因，但 病毒基因并不表达（基因沉默）；绿色巧光蛋白由于可在活细胞上观察特点，因而，绿色巧 光蛋白作为该模型的报告基因，即作为潜伏感染细胞是否被激活的标记。
[0011] 本发明所采用的黄酬类化合物包括：搬皮素（quercetin)和葛根素任uerarin)， 来源于SIGMA,货号分别为Sigma Q4951和Sigma P5555,均溶于DMS0(购自SIGMA),储存浓 度 lOOmM。
[0012] 本发明中，所述的HIV潜伏感染细胞选自：人单个核细胞，人巨隧细胞，人CD4T淋 己细胞，人肥大细胞，人树突细胞，人滤泡样树突细胞，人造血祖细胞，人自然杀伤细胞、人 神经元或少突神经胶质细胞，等等。
[0013] 本发明中，黄酬类化合物药物与抗HIV药物结合具有激活清除潜伏病毒并最终清 除作用。
[0014] 本发明中，所述的黄酬类化合物具有如下化合物结构式：
[0015]
[0016] 本发明中，所述的抗HIV药物为：
[0017] (1)核巧类逆转录酶抑制剂：①齐多夫定zidovudine (AZT或ZDV);②地丹诺辛 didanosine(ddl、Videx);③扎西他滨 Zalcit油ine(ddc);④司他夫定 Stavudine(d4T);⑥ 拉米夫定1日111；[￥11(1;[]16(31'〇;@阿己卡韦油日。日￥；[1'(15921]8921日旨6]1);
[0018] (2)非核巧类逆转录酶抑制剂（NNRTI):①奈韦拉平nevirapine ;②地拉韦晚 delavird ;③依非韦伦 efavirene ;
[0019] 做蛋白酶抑制剂：①沙奎那韦saguinavir ;②巧地那韦indinavir ;③利托那韦 ritonavir ;④奈非男β韦 nelfinavirr ;⑤安普男β韦 amprenavir。
[0020] 本发明通过下述的技术方案实现：
[0021] (1)如ercetin和化erarin药物的不同浓度对HIV潜伏诱导激活效率的影响试验
[0022] 本发明化浓度为5 μ M-40 μ Μ的药物处理HIV潜伏感染细胞模型，在药物处理后的 3天，通过对报告基因绿色巧光蛋白的巧光显微镜观察和流式细胞术检测，分析HIV潜伏感 染细胞的激活效率，从而获得药物作用的剂量效应关系；
[0023] 结果显示，随着如ercetin和化erarin化合物浓度的升高，细胞模型中表达绿 色巧光的细胞数目增多；HIV潜伏感染细胞经如ercetin(20yM)处理后绿色巧光阳性的 细胞比例达高达13. 7% ;化erarin在20 μ Μ浓度时巧光阳性的细胞细胞比例达9. 7%。未 加诱导剂处理的HIV潜伏感染细胞，其巧光阳性的细胞比例仅有不到2%背景激活；结果表 明，如ercetin和化erarin化合物具有对HIV潜伏感染细胞的激活作用，其较好激活浓度 为20 μ M，且具有剂量效应关系；
[0024] 似如ercetin和化erarin药物的作用时间对HIV潜伏诱导激活效率的影响试验 阳0巧]W 20 μ Μ药物浓度处理HIV潜伏感染细胞模型，在药物处理后的1天，2天，3天， 4天时间内，通过对报告基因绿色巧光蛋白的巧光显微镜观察和流式细胞术检测，分析HIV 潜伏感染细胞的激活效率，从而获得药物作用的时间效应关系；
[00%] 结果显示，如ercetin和化erarin分别处理HIV潜伏感染细胞模型，随着时间延 伸，绿色巧光阳性的细胞数目逐渐增多，如ercetin在处理HIV潜伏感染细胞模型7化后绿 色巧光阳性的细胞比例达最高13%，而化erarin在处理HIV潜伏感染细胞模型7化后绿色 巧光阳性的细胞比例达最高10% ;表明两药物具有时间效应关系；
[0027] (3)如ercetin和化erarin对细胞的毒性作用试验
[0028] W不同浓度的药物处理HIV潜伏感染细胞，在药物处理后的72h内通过CCK-8方 法检测细胞的增殖活性，计算出药物对细胞的半数毒性浓度（CX50)，从而得到药物对细胞 的毒性作用；
[0029] 结果显示，如ercetin和化erarin药物对人正常细胞的半数毒性浓度分别为CC50 =160μΜ和CC50 = 120 μΜ，即如ercetin在浓度为160μΜ处理细胞时，有50%被处理细 胞显示毒性，Puerarin在浓度为120μM处理细胞时，有50%被处理细胞显示毒性，CC50越 高，其细胞毒性越低；因而，该结果表明如ercetin和化erarinza在有效浓度内对细胞毒性 较低，为临床应用奠定了基础；
[0030] (4)如ercetin和化erarin与PKC激活剂Prostratin和组蛋白去乙酷化酶抑制剂 valproic acid(VPA)协同激活作用试验
[0031] 基于每个HIV潜伏感染细胞状态并不完全一样，因而，HIV潜伏机制是不一样的； 为了最大化激活HIV潜伏感染细胞并减少毒性，本发明中对如ercetin和化erarin与PKC 激活剂Prostratin和VPA的协同激活作用进行检测分析；
[0032] 结果显示，每个药物或联合处理HIV潜伏感染细胞72小时后，对报告基因绿色 巧光蛋白的流式细胞术检测，其绿色巧光阳性的细胞比例分别为如ercetin(14.3%)， Prostratin (22. 6 % ),VPA(11.4 % ) ；Quercetin+Prostratin (63. 1 % ), Que;rcetin+VPA(44 % ) ;Puera;rin(10. 2 % )，化era;rin+P;rostratin(53. 8 % )， 化era;rin++VPA(34. 4% );未加药物（Mock)组（2% );结果表明，无论是如ercetin与 Prostratin或与VPA药物结合处理细胞，其激活细胞效率皆比两药处理后绿色巧光阳性细 胞比例数总和高，同样，化erarin也获得了类似结果，说明，如ercetin和化erarin与PKC 激活剂Prostratin及VPA有协同激活作用。
[0033] 本发明的实验结果和实验数据，显示出如ercetin和化erarin不仅具有高的诱 导激活作用，而且对细胞毒性较低；与PKC激活剂Prostratin和组蛋白去乙酷化酶抑制剂 VPA联合使用，具有协同诱导激活作用。因而，所述的黄酬类化合物可用于制备抗HIV潜伏 的治疗药物，所述的如ercetin和化erarin将为HIV潜伏感染病毒诱导激活和最终清除提 供一个新途径和手段。
【附图说明】
[0034] 图1为如ercetin和化erarin化合物的不通浓度对HIV潜伏诱导激活效率的影 响，其中，药物终浓度分别为5 μ M，10 μ M，20 μ M，40 μ Μ ;处理细胞72小时后进行流式细胞 术检测，分析巧光细胞所占比例。
[0035] 图2为如ercetin和化erarin化合物的作用时间对HIV潜伏诱导激活效率的影 响，其中显示了，在终浓度为20 μ Μ药物处理细胞2地，4她，72h，9化后，流式细胞术分析巧 光细胞所占比例。
[0036] 图3为如ercetin和化erarin对细胞的毒性作用，其中显示了，W终浓度为5 μ M， 10 μ Μ，20 μ Μ，40 μ Μ，80 μ Μ，160 μ Μ的如ercetin和化erarin处理HIV潜伏感染细胞模型， CCK-8方法检测细胞的活性。
[0037] 图4显示了如ercetin和化erarin与PKC激活剂Prostratin和组蛋白去乙酷化 酶抑制剂valproic acid(VPA)协同激活作用。
【具体实施方式】
[0038] 实施例1.如ercetin和化erarin化合物的作用浓度对HIV潜伏诱导激活效率的 影响
[0039] 按每孔2X10E4个细胞将C11细胞种植于96孔板，每孔加入lOOul含10 % FBS(Gibco)的1640培养基（Gibco)。24小时后，加入不同浓度的如ercetin和化erarin， 使终浓度分别为5 μ M，10 μ M，20 μ M，40 μ Μ。每个浓度至少3个复孔，每个实验重复3次，药 物处理细胞72小时后，在巧光显微镜下观察细胞GFP表达情况，并收集细胞进行流式细胞 术检测，分析巧光细胞所占比例；
[0040] 结果显示，随着如ercetin和化erarin化合物浓度的升高，细胞模型中表达绿 色巧光的细胞数目增多，且均在20 μ Μ达到最高；HIV潜伏感染细胞经如ercetin (20 μ M) 处理后绿色巧光阳性的细胞比例达高达13. 7 %;化erarin在20 μ Μ浓度时巧光阳性的细胞 细胞比例达9. 7% ;未加诱导剂处理的HIV潜伏感染细胞，其巧光阳性的细胞比例仅有不到 2%背景激活；结果提示，如ercetin和化erarin化合物皆具有对HIV潜伏感染细胞的激活 作用，其较好激活浓度范围为5-40 μ M，且具有剂量效应关系。
[0041] 实施例2.如ercetin和化erarin化合物的作用时间对HIV潜伏诱导激活效率的 影响
[0042] 按每孔2X 10E4个C11细胞种植于96孔板，每孔加入lOOul含10% FBS(Gibco) 的1640培养基（Gibco)，24小时后，加入终浓度为200nM的MGCD0103和MS275。在药物处 理细胞2地，4她，72h，9化后，在巧光显微镜下观察细胞GFP表达情况，并收集细胞进行流式 细胞术检测，分析巧光细胞所占比例，每个时相点至少3个复孔，每个实验重复3次，分析比 较诱导激活诱导激活动力学特点；
[00创结果显示，如ercetin和化erarin分别处理HIV潜伏感染细胞模型，随着时间延 伸，绿色巧光阳性的细胞数目逐渐增多，如ercetin在处理HIV潜伏感染细胞模型7化后绿 色巧光阳性的细胞比例达最高13%，而化erarin在处理HIV潜伏感染细胞模型72h后绿色 巧光阳性的细胞比例达最高10%，表明两药物具有时间效应关系。
[0044] 实施例3.如ercetin和化erarin对细胞的毒性作用 W45] 按每孔2X 10E4个C11细胞种植于96孔板，每孔加入lOOul含10% FBS(Gibco) 的1640培养基（Gibco)。24小时后，分别加入不同浓度的如ercetin和化erarin，使终浓 度分别为5 μ M，10 μ M，20 μ M，40 μ M，80 μ M，160 μ M。每个浓度至少3个复孔，每个实验重复 3次，药物处理细胞72小时后，在每孔中加入CCK-8试剂10 μ L (购自Do jindo)，细胞培养 基解育0. 5-地，于酶标仪上450皿处测0D值，计算CC50 =(实验组0D值/对照组0D值） X100% ；
[0046] 结果显示，如ercetin和化erarin药物对人正常细胞的半数毒性浓度分别为CC50 =160 μ Μ和CC50 = 120 μ M，CC50越高，其细胞毒性越低，因而，结果表明在正常有效浓度 范围内如ercetin和化erarin对细胞毒性较低，为临床应用奠定了基础。
[0047] 实施例4.如ercetin和化erarin与PKC激活剂Prostratin和组蛋白去乙酷化酶 抑制剂valproic acid(VPA)的协同激活作用 W48] 按每孔2 X 10E4个细胞将C11细胞种植于96孔板，每孔加入lOOul含10 % FBS(Gibco)的1640培养基（Gibco)，24小时后，分别加入浓度为20 μΜ的如ercetin和 化erarin，W及如ercetin和化erarin分别与200nM的Prostratin或2mM的VPA联合处 理，每个浓度至少3个复孔，每个实验重复3次，药物处理细胞72小时后，在巧光显微镜下 观察细胞GFP表达情况，并收集细胞进行流式细胞术检测，分析巧光细胞所占比例；
[0049] 结果显示，每个药物或联合处理HIV潜伏感染细胞72小时后，对报告基因绿色 巧光蛋白的流式细胞术检测，其绿色巧光阳性的细胞比例分别为：如ercetin(14. 3% )， Prostratin (22. 6 % ),VPA(11.4 % ) ；Quercetin+Prostratin (63. 1 % ), Que;rcetin+VPA(44 % ) ;Puera;rin(10. 2 % )，化era;rin+P;rostratin(53. 8 % )， 化era;rin++VPA(34. 4% );未加药物（Mock)组（2% );结果表明，无论是如ercetin与 Prostratin或与VPA药物结合处理细胞，其激活细胞效率皆比两药处理后绿色巧光阳性细 胞比例数总和高，同样，化erarin也获得了类似结果，说明，Quercetin和化erarin与PKC 激活剂Prostratin和组蛋白去乙酷化酶抑制剂VPA有协同激活作用。
【主权项】
1. 黄酮类化合物在制备抗HIV潜伏的治疗药物中的用途， 所述的的黄酮类化合物选自槲皮素（quercetin)或葛根素（Puerarin)， 所述的化合物结构式为：2. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的黄酮类化合物激活HIV潜伏感染细 胞，并最终清除所述的潜伏病毒。3. 按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的黄酮类化合物与抗HIV药物结合 激活、清除潜伏病毒。4. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的HIV潜伏感染细胞选自人单个核细 胞，人巨噬细胞，人CD4T淋巴细胞，人肥大细胞，人树突细胞，人滤泡样树突细胞，人造血祖 细胞，人自然杀伤细胞、人神经元或少突神经胶质细胞。5. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抗HIV药物选自： ⑴核苷类逆转录酶抑制剂，或⑵非核苷类逆转录酶抑制剂，或⑶蛋白酶抑制剂。6. 按权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的抗HIV药物中： (1) 核苷类逆转录酶抑制剂选自①齐多夫定zidovudine，②地丹诺辛didanosine， ③扎西他滨Zalcitabine，④司他夫定Stavudine，⑤拉米夫定Lamivudine，或⑥阿巴卡韦 abacavir ； (2) 非核苷类逆转录酶抑制剂选自①奈韦拉平nevirapine，②地拉韦啶delavird，或 ③依非韦伦efavirene ; (3) 蛋白酶抑制剂选自①沙奎那韦saguinavir，②節地那韦indinavir，③利托那韦 ritonavir，④奈_€男|3韦 nelfinavirr 或⑤安普男|3韦 amprenavir。
【文档编号】A61K45/06GK105878231SQ201510036805
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年1月26日
【发明人】朱焕章, 曲喜英, 朱豫琪, 朱晓丽, 牛姗, 刘丹, 刘一丹
【申请人】复旦大学