藏红花素在制备预防及治疗糖尿病周围血管病变药物中的用图
【专利摘要】本发明公开了藏红花素在制备预防及治疗糖尿病周围血管病变药物中的用途，属于医药技术领域。本发明针对藏红花素具有改善糖尿病引起的血管内皮功能受损、缓解周围血管病变的潜在治疗作用进行研究，通过权威的离体血管张力检测方法观察藏红花素对糖尿病模型血管的舒张能力影响，以及在细胞水平验证其可能的作用机制，证实了藏红花素具有明显提高糖尿病血管舒张能力、保护血管内皮功能的潜在作用。本发明探索性发现藏红花素具有治疗糖尿病性周围血管病变的作用，本发明的提出为临床治疗糖尿病性周围血管病变提供了一种新的技术手段。
【专利说明】
藏红花素在制备预防及治疗糖尿病周围血管病变药物中的 用途
技术领域
[0001] 本发明涉及藏红花素的新的治疗用途，特别涉及藏红花素在制备治疗糖尿病周围 血管病变药物中的用途，本发明属于医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 糖尿病并发的周围血管病变是糖尿病的重要并发症之一，表现为闭塞性动脉硬化 引发的周围组织中氧及营养物质的缺乏，进而发展的痛性痉挛和疼痛为特征的间歇性跛 行，发病机制以高血糖引起的血管内皮功能损伤为最初的病理改变。血管内皮的生理功能 是屏障、分泌和信息传递。内皮细胞作为血流和血管壁之间屏障，有选择性通透功能，也有 合成分泌血管收缩因子、舒张因子及其它因子的功能。目前发现与内皮功能相关的血管舒 张因子有三种:N0、PGI 2和EDHF。而诸多疾病因素如高血糖、高血脂等常破坏血管内皮，异常 改变N0、PGI2和EDHF表达及活性，致使内皮功能受损，主要表现是内皮依赖性脉管舒张功能 减弱，对乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)的反应性降低，内皮通透性增加，NO合成减少等。内 皮功能受损后期常引发严重的心血管并发症，加重了疾病的发展，可以说血管内皮功能受 损是心血管疾病发生的最初环节，是糖尿病周围血管病变的关键过程。因此，在治疗高血糖 过程中有效兼顾改善血管内皮功能将会起到事半功倍的治疗效果。
[0003]藏红花是一种鸢尾科番红花种属花卉植物，含有糖类、蛋白质、维生素、类黄酮、氨 基酸、天然矿物质及树胶等多种成份，具有多种生物和药理活性，被认为是一种名贵的中药 材，其医用价值被广泛研究。藏红花的提纯物有三种:藏红花素、藏红花苦甙和藏花醛，其中 藏红花素(crocin)被Alavizadeh SH，Rajaei Z等证实具有较为明确的抗氧化和抗肿瘤作 用。另有相关报道称藏红花素也具有保护心肌缺血损伤、抗高血压、抑制动脉粥样硬化等生 物学作用。具体如下:Goyal SN等通过异丙肾上腺素诱导的心肌梗死动物模型发现，口服藏 红花素可以预防心梗发生，提高大鼠的生存能力;杜鹏等证实静脉注射藏红花素可以减小 心肌梗死面积，降低乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH)和肌酸激酶（creatine kinase，CK)的血清含量，治疗心肌缺血损伤;Sheng L等发现藏红花素可以通过抑制胰脂肪 酶的活性，降低甘油三酯（triglyceride,TG)、低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein, LDL)和胆固醇的血清含量，减少动脉粥样硬化的发生。最近Razavi BM等发现，藏红花素可 降低杀虫剂二嗪农对血管的慢性损伤作用。诸多研究初步说明藏红花素具有多种生物学作 用，但是对于藏红花素在改善或修复糖尿病引发的血管内皮功能损伤以及治疗糖尿病周围 血管病变中的应用，目前没有报道。本发明通过明确藏红花素对糖尿病血管内皮功能的调 节作用，为糖尿病血管并发症的对症治疗提供依据。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供藏红花素在制备治疗糖尿病周围血管病变药 物中的用途。本发明发现了藏红花素具有改善糖尿病性周围血管内皮功能的作用，为其将 来用于临床糖尿病周围血管病变的治疗提供一种新的技术手段。
[0005] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0006] 本发明首先确定了藏红花素对血管张力的大体作用，即舒张功能，且初步明确了 该作用与内皮有直接的依赖关系。本发明通过比较静息和收缩状态下藏红花素对血管环张 力的影响，发现藏红花素有减弱PE(苯肾上腺素）的缩血管作用，推测出藏红花素对病理因 素(糖尿病等）引起的血管缩窄有更直接的扩张作用。另外我们研究还发现，提前使用藏红 花素可抵抗PE的缩血管作用，说明藏红花素也具有降低或预防病理因素对血管破坏的风 险。其次检测藏红花素对糖尿病模型血管舒张能力的影响，发现藏红花素可提高糖尿病血 管的舒张能力，有效减弱PE的缩血管作用。最后通过培养原代血管内皮细胞，观察藏红花素 对内皮功能相关蛋白eNOS(内皮一氧化氮合酶)的影响，结果表明藏红花素可以提高eNOS的 表达水平以及磷酸化水平，eNOS表达及磷酸化水平增高导致内皮合成NO增多，最终引起血 管扩张。本发明的提出为藏红花素在临床糖尿病性周围血管病变的预防和治疗提供了新的 理论支持。
[0007] 在上述研究的基础上，本发明提出了藏红花素在制备预防及治疗糖尿病周围血管 病变药物中的用途。
[0008] 在本发明中，优选的，所述的药物具有提高糖尿病人血管舒张能力的作用。
[0009] 在本发明中，所述的藏红花素通过提高eNOS的表达水平来达到提高糖尿病人血管 的舒张能力，进而达到预防或治疗糖尿病周围血管病变的目的。
[0010] 本发明探索性发现藏红花素具有治疗糖尿病性周围血管病变的作用，本发明的提 出为临床治疗糖尿病性周围血管病变提供了新的技术手段。
【附图说明】
[0011] 图1为去内皮后，不同浓度的藏红花素对PE收缩的血管张力无影响；
[0012] T示加 PE后血管的张力，"▼"示加藏红花素后血管的张力；
[0013] 图2为在正常组和糖尿病模型组，各浓度藏红花素均可使PE收缩的血管舒张，随着 藏红花素作用浓度的增加舒张率升高，呈剂量依赖性。
[0014] 图3为藏红花素抵抗PE的血管收缩作用；
[0015]在正常组和糖尿病模型组中，用藏红花素预孵育血管环后，不同浓度PE的血管收 缩作用均明显下降；
[0016] 图4为Western blotting法检测藏红花素对eNOS表达的影响；
[0017] 藏红花素有上调总eNOS(t-eNOS)表达及提高eNOS的磷酸化水平(ρ-eNOS)的作用； [0018]图5为对图3结果的统计分析。
[0019] a图表示藏红花素促进p-eNOS表达上调，b图表示藏红花素促进t-eNOS表达上调。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应 该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修 改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0021] 实施例1藏红花素对动脉环张力的影响
[0022] 1、糖尿病大鼠模型的制备
[0023] (1)选雄性SD大鼠，体重180-220g，月龄4-6周。常规饲料、自由饮水饲养一周。
[0024] (2)禁食(不禁水)过夜，尾静脉测空腹血糖，称体重。
[0025] (3)用无菌的0 · IM柠檬酸缓冲液(PH = 4 · 2)配制1 %的STZ(即用即配），按照60mg/ kg用量一次性腹腔注射。注射后每日给予充足的食物和水，勤换垫料，保持干燥环境。
[0026] (4)注射后7天空腹血糖达16.7mmol/l为稳定模型，进入下一步实验。
[0027] 2、离体微血管张力测试
[0028] (1)模型鼠麻醉后，分离主动脉，快速置于预冷的Krebs溶液中，并持续通入混合气 体95%〇2和S^CO2t3Krebs溶液成份(mmol/L):NaCl 120;NaHC03 25;KC1 4.8;NaH2P〇4 1.2; MgS〇4 1.2;Glucose 11.0;CaCl2 1·8〇
[0029] (2)清除血管周围的结缔组织，切成2mm长的血管环，穿过两根金属丝固定于微血 管张力检测仪的Krebs溶液浴槽中，浴槽内持续通入95 % O2和5 % CO 2的混合气体，恒温于37 °C平衡20min，调节血管环静息张力，Krebs溶液平衡2h，每20min换液一次。
[0030] (3)用ΙμΜ去氧肾上腺素（PE)预收缩血管环，收缩峰值达15min后，加入乙酰胆碱 (Ach，ΙΟμΜ)使预收缩的血管环舒张超过80%，可认为血管内皮完整，可进行后续实验。
[0031] (4)ΡΕ再次预收缩血管环，用梯度乙酰胆碱(Ach，0.1nM-10yM)舒张血管环，作剂 量-舒张反应曲线。以PE诱发的最大收缩幅度为100%，计算藏红花素孵育后血管张力幅度 与PE诱发的最大收缩幅度比率，以此来反应血管张力的变化，评价藏红花素对血管内皮舒 张反应的调节作用。
[0032] 第一、实验分别检测藏红花素对动脉环静息状态下和收缩状态下张力的影响，确 定藏红花素对血管张力的大体作用。
[0033] 第二、实验中设计血管去内皮组（用特制毛刷去除血管内皮)和内皮完整组，评估 藏红花素对血管环舒张能力的影响，且证实是否为内皮依赖型的调节作用。
[0034]第三、比较正常血管和糖尿病模型血管在PE处理后Ach的扩血管作用，证实糖尿病 性血管损伤模型建立完成，为下一步实验奠定基础。
[0035]第四、检测藏红花素对血管环舒张功能的影响。正常组和糖尿病模型组动脉血管 环先用PE(l(T5m〇l/L)使其收缩张力达到平台，此后累积加入梯度浓度的藏红花素（10- 9m〇l/L-l(T5m〇l/L)，观察血管环的张力的变化，并计算舒张率。
[0036] 第五、检测藏红花素对抗PE的血管收缩作用。先给藏红花素（l(T6m〇l/L)预孵育 20min后再累积加入不同浓度梯度的PE(l0- 9mol/L-l0-5mol/L)，分析藏红花素对血管的舒 张能力的调节作用。
[0037] 3、结果
[0038] (1)藏红花素累积给药前后的终张力对静息主动脉环张力无显著影响，随着藏红 花素浓度的逐渐增大，藏红花素显示了轻微的血管舒张作用;但用PE预收缩血管后，藏红花 素可明显舒张血管，说明藏红花素对静息状态下主动脉环张力无显著性影响，但对已处于 收缩状态的血管有较好的舒张作用，推测藏红花素对病理因素(糖尿病等）引起的血管缩窄 有更直接的扩张作用。
[0039] (2)在去内皮组各个浓度的藏红花素均不能改变血管张力幅度(如图1)，而在内皮 完整组藏红花素可降低PE收缩血管的张力，说明藏红花素的扩血管作用依赖于血管内皮。 [0040] (3)正常组和糖尿病模型组预先均用PE(l(T5m 〇l/L)收缩血管，张力达到平台后，累 积加入不同浓度的藏红花素，发现各组血管张力均有下降，血管舒张率增加（如图2)，说明 藏红花素对正常血管和糖尿病血管在其收缩状态下均有舒张作用。另外，实验结果还发现 藏红花素对正常血管的舒张作用要强于糖尿病血管，这也从另一角度说明了本实验中糖尿 病确实对血管有所损伤，并影响了血管内皮依赖性的扩张作用。但在本研究中藏红花素对 糖尿病血管的舒张率可达54.44% (表1所示），这也充分证明了藏红花素的作用效果。
[0041 ] 表1藏红花素对大鼠胸主动脉环舒张效应的影响（％± s,n = 6)
[0043] (4)用藏红花素分别预处理正常组和糖尿病模型组血管20min后，各浓度PE对血管 的收缩能力下降(如图3)，说明藏红花素具有抵抗PE的血管收缩作用。
[0044] 实施例2藏红花素对HUVECs中eNOS表达的影响
[0045] 1、细胞培养
[0046] 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用含5%FBS、1%ECGS的ECM培养液培养，37°C、5%⑶2 及饱和湿度的条件下实验，所有实验过程使用中的细胞为3-10代，细胞培养过程中严格按 照无菌操作原则进行。实验过程中取用对数生长期的细胞，分别给予藏红花素(〇.1μΜ、1μΜ、 10μΜ、100μΜ 和 ΙΟΟΟμΜ)孵育 48h。
[0047] 2、western blotting分析
[0048] 提取细胞总蛋白，western blotting分析p-eN0S、t_eN0S和β-actin表达变化情 况，具体操作步骤如下：
[0049] (1)细胞总蛋白的提取：用预冷的PBS漂洗藏红花素孵育后的HUVEC细胞二次，每个 孔中加入80μ1蛋白裂解液，在冰上边裂解边摇匀30min。用细胞刮将加有蛋白裂解液的细胞 刮下，并转移至经过冷却的离心管中，于12000rpm离心5min。小心取上清即为细胞总蛋白。 上清液转移分装于离心管中，存于_80°C备用。
[0050] (2)蛋白浓度测定:依照蛋白定量试剂盒说明书进行。
[0051 ] (3)将提取的蛋白加入1 /4体积5 X电泳加样缓冲液，混匀后置入100 °C水中加热 5min，使蛋白变性，再迅速将加热的蛋白样本置于冰上。根据测定的蛋白样本浓度，上样量 经过调整，电泳槽中每孔加约IOOyg蛋白量，采用预染marker做分子参照，电泳初始电压设 为70V，待样本进入浓缩胶与分离胶交界后改电压为120V。
[0052] (4)转膜，恒定电流250mA转膜1-2h(根据分子量大小）。转膜结束后，硝酸纤维素膜 置入TBST缓冲液中短暂漂洗后，放入封闭奶粉中室温下温和振荡lh。把膜放入稀释的一抗 (见下表2)中，4°C过夜。
[0053]表2-抗、二抗的稀释浓度
[0055] (5)回收一抗，在TBST液中洗膜3次，每次lOmin，然后把硝酸纤维素膜置于稀释的 二抗(见表2)中室温下温和振荡Ih(避光），后在TBST中洗膜3次，每次lOmin。
[0056] (6)曝光、显影及定影:取ECL试剂A和试剂B适量，混合Imin后均匀滴加于硝酸纤维 素膜上，用食物保鲜膜覆盖硝酸纤维素膜后放入胶片盒，在暗室内同时放入X光胶片并作方 向标记，曝光，洗片。根据曝光的情况调整曝光时间。用底片扫描仪扫描光胶片，通过凝胶成 像系统或Quantity one 4.6.2分析软件读取目的电泳条带的密度扫描值，并分析。
[0057] 2、结果
[0058]蛋白检测发现，藏红花素可以提高eNOS的表达水平以及磷酸化水平（图4)，说明藏 红花素的血管作用与提高eNOS的磷酸化有关，eNOS表达及磷酸化水平增高，内皮合成NO增 多，最终引起血管扩张。
[0059]综上，本发明通过比较静息和收缩状态下藏红花素对血管环张力的影响，发现藏 红花素有减弱PE的缩血管作用，推测出藏红花素对病理因素(糖尿病等）引起的血管缩窄有 更直接的扩张作用。进一步的实验证实，藏红花素可明显降低PE对糖尿病血管的收缩作用， 寻其机制发现或许与其提高eNOS表达和磷酸化水平，进而改善血管内皮功能有关。另外研 究还发现，提前使用藏红花素可抵抗PE的缩血管作用，说明藏红花素也具有降低或预防病 理因素对血管破坏的风险。本发明的提出为临床糖尿病性周围血管病变的预防和治疗提供 了新的技术手段。
【主权项】
1. 藏红花素在制备预防及治疗糖尿病周围血管病变药物中的用途。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的药物具有提高糖尿病人血管舒张能力 的作用。3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于所述的藏红花素通过提高eNOS的表达水平来 达到提高糖尿病人血管舒张能力，进而达到预防或治疗糖尿病周围血管病变的目的。
【文档编号】A61P3/10GK106074477SQ201610415865
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日 公开号201610415865.3, CN 106074477 A, CN 106074477A, CN 201610415865, CN-A-106074477, CN106074477 A, CN106074477A, CN201610415865, CN201610415865.3
【发明人】杨慧科, 吕艳华, 赵玉娇, 肖建兵, 杨树才, 李雪梅, 李鑫磊, 李晓冬, 马晶, 张雅芳
【申请人】哈尔滨医科大学