用于处理含有焦脱镁叶绿素的组合物的方法

专利名称：用于处理含有焦脱镁叶绿素的组合物的方法
技术领域：
本发明涉及用于处理包含焦脱镁叶绿素的组合物的方法、用途、装置及相关产品。一方面，本发明特别适用于植物源性食品和饲料产品、例如植物油的工业处理。本发明可用于减轻或消除所述产品中的焦脱镁叶绿素污染。
背景技术：
叶绿素是广泛存在于植物界的绿色色素。叶绿素是光合作用所必需的，是存在于地球上的最丰富的有机金属化合物之一。因此，许多源自植物的产品、包括食品和饲料均含有大量的叶绿素。例如，源自油料种子(例如大豆、棕榈或油菜籽(canola)、棉籽以及花生油)的植物油通常含有一些叶绿素。然而，植物油中高水平叶绿素色素的存在通常是不合乎需要的。这是因为叶绿素产生不合乎需要的绿色，并且可在储存过程中诱导油氧化，导致油变质。已经应用多种方法以从植物油中去除叶绿素。可在油产品加工的许多阶段去除叶绿素，包括种子压榨、油萃取、脱胶、碱处理以及漂白步骤。然而，对于将叶绿素残留物去除至可接受水平，漂白步骤通常是最重要的。在漂白过程中，加热油并使其通过吸附剂，以去除叶绿素和影响精制油外观和/或稳定性的其他带颜色的化合物。漂白步骤中使用的吸附剂通常是粘土。在食用油加工业中，这些步骤的应用通常将所加工的油中的叶绿素水平降低至0.02至0.05 !11之间。然而，由于漂白粘土中的雾沫夹带，漂白步骤增加了加工成本并降低了油产率。另外，粘土的使用昂贵，这特别归因于对于使用过的粘土(即废料)的处理困难、危险并且代价高昂。因此，已经尝试通过其他方法从油中去除叶绿素，例如使用叶绿素酶。在植物中，叶绿素酶(chlase)被认为参与叶绿素降解和催化叶绿素中酯键的水解，以产生脱植基叶绿素(chlorophyllide)和叶绿醇。WO 2006009676描述了通过使用叶绿素酶处理可降低诸如植物油之类的组合物中的叶绿素污染的工业工艺。该工艺中产生的水溶性脱植基叶绿素也是绿色的，但可通过水萃取或二氧化硅处理而去除。叶绿素通常在用于油生产的种子中以及从种子萃取油的过程中部分降解。一种常用的改良是从卟啉(二氢卟酚)环中去除镁离子，以形成称为脱镁叶绿素的衍生物(见图26)。从卟啉环去除高极性镁离子导致脱镁叶绿素与叶绿素的理化性质显著不同。在加工过程中，油中的脱镁叶绿素通常要比叶绿素更丰富。脱镁叶绿素呈绿色，可通过与用于叶绿素的类似工艺而从油中去除，例如WO 2006009676中所述通过具有脱镁叶绿素酶活性的酶催化的酯酶反应。在某些条件下，某些叶绿素酶能够水解脱镁叶绿素以及叶绿素，由此适于去除这两种污染物。脱镁叶绿素的水解产物是红色/褐色的脱镁叶绿酸(pheophorbide)和叶绿醇。值得关注的是，脱镁叶绿酸也可通过从脱植基叶绿素去除镁而产生，即在叶绿素水解之后进行(见图26)。WO 2006009676教导了通过类似于用于脱植基叶绿素的方法去除脱镁叶绿酸，例如通过水萃取或二氧化硅吸附。然而，值得注意的是，脱镁叶绿酸的水溶性低于脱植基叶绿素，因此不能使用水萃取(特别是使用水)容易地洗除。脱镁叶绿素可在油料种子的收获和储存过程中通过植物酶活性或通过在油精制过程中通过加工条件(例如热)而进一步降解为焦脱镁叶绿素(见,“Behaviour ofchlorophyl Derivatives in Canola Oil Processing”，JAOCS,第 9 卷(Sept. 1993)，第837-841页)。一种可能的机制是脱镁叶绿素同素环的甲基酯键的酶促水解，及随后不稳定中间物至焦脱镁叶绿素的非酶促转化。据报道，一种称为脱镁叶绿酸酶的来自藜(Chenopodium album)的28_29kDa酶能够催化脱镁叶绿酸的类似反应,从而产生称为焦脱镁叶绿酸(pyropheophorbide)的焦脱镁叶绿素的无叶绿醇衍生物(见图26)。焦脱镁叶绿酸的极性低于脱镁叶绿酸，导致与脱镁叶绿酸相比，焦脱镁叶绿酸的水溶性降低且油溶性增加。加工过程中，植物油中的焦脱镁叶绿素要比脱镁叶绿素和叶绿素二者更丰富(见Bailey，s Industrial Oil and Fat Products (2005),卷 2. 2,表 9,第 6 版，FereidoonShahidi编辑，John Wiley & Sons)。这部分归因于在植物原料收获和储存期间叶绿素中镁的丧失。还通过在加工和萃取前加热油料种子，以及精制工艺过程中油脱胶和碱处理来降低叶绿素水平。因此，在许多植物油中，与焦脱镁叶绿素(和脱镁叶绿素)相比，叶绿素是相对次要的污染物。焦脱镁叶绿素呈绿色且鉴于其对于颜色和稳定性的不良影响，焦脱镁叶绿素是油中主要的不良污染物。尽管对叶绿素和(较低程度上)脱镁叶绿素去除的方面给予了关注，仍旧需要从诸如植物油之类的组合物中去除焦脱镁叶绿素及其衍生物(例如焦脱镁叶绿酸)的合适方法。特别地，现有技术中描述的叶绿素酶通常几乎没有或完全没有焦脱镁叶绿素酶活性，由此不能去除焦脱镁叶绿素污染。

发明内容
一方面，本发明提供了用于处理含有焦脱镁叶绿素的组合物的方法，该方法包括使所述组合物与能够水解焦脱镁叶绿素的酶接触。优选地，所述组合物源自植物、藻类或细菌。在一种实施方式中，所述组合物包括植物源性油，例如植物油。优选地，所述组合物包括选自米糠油、大豆油、菜籽(rape seed)油、棕榈油、橄榄油、棉籽油、玉米油、棕榈仁油、椰子油、花生油、芝麻油或向日葵油的油。在一种实施方式中，所述酶包括脱镁叶绿素酶或脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶。所述酶可源自例如选自下述属的物种拟南芥属(Arabidopsis)、杨属(Populus)、葡萄属(Vitis)、稻属(Oryza)、玉米属(Zea)、烟草属(Nicotiana)、藻属(Ostreococcus)、藻属、小立碗藓属(Physcomitrella)、褐指藻属(Phaeodactylum)、衣藻属(Chlamydomonas)或微胞藻属(Micromonas)，或所述酶可源自例如选自下述物种拟南芥(Arabidopsisthaliana)、毛果杨(Populus trichocarpa)> 葡萄(Vitis vinifera)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zea mays)、烟草(Nicotiana tabacum)、绿色鞭毛藻(OstreococcusIucimarinus)、青绿藻(Ostreococcus taurii)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)或微胞藻(Micromonas sp.)RCC299。优选地，所述酶包含选自下述的氨基酸序列LPGFGVG(SEQ ID NO :13)、DFLGQG (SEQ ID NO : 14)、GNSLGG (SEQ ID NO 15), LVKGVTLLNATPFff (SEQ ID NO :16)、HPAA (SEQ ID NO :17)、EDPW (SEQ ID NO :18)以及 SPAGHCPH(SEQ ID NO :19)。在一种实施方式中，所述酶包含SEQ ID NO: I、或SEQ ID NO :4至12任一者或SEQID NO :21、23或25任一者所限定的多肽序列，或其功能性片段或变体，例如，所述酶包含在至少20个、至少50个、至少100个或至少500个氨基酸残基或在序列的全长上与SEQ IDNO :1、或SEQ ID NO :4至12任一者或SEQ ID NO :21、23或25任一者具有至少50%、至少75 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %或至少99 %序列同一性的多肽序列。在一种实施方式中，所述酶具有小于80的脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶活性比。 所述酶可水解所述组合物中的焦脱镁叶绿素而生成焦脱镁叶绿酸。在一些实施方式中，所述方法还包括从所述组合物去除焦脱镁叶绿酸的步骤。例如，可通过脱臭步骤或二氧化硅处理步骤、优选通过脱臭步骤和二氧化硅处理步骤二者去除焦脱镁叶绿酸。优选地，所述方法包括两个或多个二氧化硅处理步骤。在一种实施方式中，所述二氧化硅处理在高温下进行,例如在约50至150°C、在70至110°C或在约90°C。在一种实施方式中，在固体支持体上固定能够水解焦脱镁叶绿素的酶。所述方法还可包括使所述组合物与具有叶绿素酶活性的酶接触的步骤，任选地，还可将所述叶绿素酶固定于固体支持体上。优选地，所述方法还包括使所述组合物与酰基转移酶接触的步骤。优选地，相对于处理前存在于所述组合物中的焦脱镁叶绿素浓度，所述组合物中的焦脱镁叶绿素浓度降低至少10%、至少50%、至少75%或至少90%。另一方面，本发明提供了用于精制植物(例如蔬菜)油的工艺，该工艺包括使用焦脱镁叶绿素酶处理含有焦脱镁叶绿素的植物油。所述工艺可在工业规模进行，可包括如上所述的多个方法步骤。所述工艺还可包括通常用于植物油加工的步骤，例如己烷萃取和/或脱胶步骤。在又一方面，本发明提供了具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽用于从组合物去除焦脱镁叶绿素污染的用途。该用途可应用如上所述的多个方法步骤而实施。在又一方面，本发明提供了用于对含有焦脱镁叶绿素的组合物进行酶处理的装置，该装置包括(a)植物油精制装置；和(b)可操作地并入所述植物油精制装置中的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽，从而使所述多肽能够在精制所述组合物的过程中水解所述组合物中的焦脱镁叶绿素。所述装置可包含用于实施如上所述的方法或工艺的相应装置特征。另一方面，本发明提供了包含固定于二氧化硅上，具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的组合物。所述多肽可为在上文所述方法的优选实施方式中所述的酶。另一方面，本发明提供了具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO 3所示的核酸序列编码的多肽，或具有焦脱镁叶绿素酶活性的其功能性变体或片段。例如，所述变体和/或片段可在至少100、至少200或至少300个氨基酸残基或全长序列上显示与SEQ ID NO: 4至少90 %、至少95%或至少99%的序列同一性。又一方面，本发明提供了 SEQ ID NO :3所示的核酸序列，或编码功能性焦脱镁叶绿素酶的其变体或片段。例如，所述变体和/或片段可在至少300、至少500或至少1000个核苷酸残基或全长序列上显示与SEQ ID NO :3至少90%、至少95%或至少99%的序列同一性。在其他方面，本发明提供了一种包含SEQ ID NO :3所示核酸序列的表达载体(例如，图13所示的表达载体)和包含所述表达载体的转化(宿主)细胞。又一方面，本发明提供了具有SEQ ID NO :25所示的氨基酸序列的多肽，或具有焦脱镁叶绿素酶活性的其功能性变体或片段。例如，所述变体和/或片段可在至少100、至少200或至少300个氨基酸残基或全长序列上显示与SEQ ID NO :25的至少90%、至少95%或至少99%的序列同一性。又一方面，本发明提供了可通过如上所述的工艺或方法获得的组合物。例如，所述组合物可为植物、藻类或细菌产品，特别是精制植物油， 例如精制蔬菜油。已经惊讶地发现某些植物酶具有焦脱镁叶绿素酶活性，例如，能够水解焦脱镁叶绿素中的酯键以生成焦脱镁叶绿酸和叶绿醇。另外，所述焦脱镁叶绿素酶特别可用于去除植物源性产品，例如植物油中的焦脱镁叶绿素污染物。


图I显示了使用吸光度检测(430nm)的HPLC色谱图，表示如下编号的峰1 =脱植基叶绿素b ；2 =脱植基叶绿素a ；3 =新叶黄素；3’ =新叶黄素异构体；4 =新色素；5=堇黄质；6 =黄体呋喃素(Iueoxanthin) ；7 =异堇黄质；8 =花药黄质(anteraxanthin)；8’ =花药黄质异构体；9 =玉米黄质；10 =叶黄素；10’ =叶黄素异构体；10” =叶黄素异构体；11 =脱镁叶绿酸b ; 12 =脱镁叶绿酸a ; 13 =叶绿素b ; 13’ =叶绿素b’ ； 14=叶绿素a;14’ =叶绿素a’；15 =脱镁叶绿素b ;15’ =脱镁叶绿素b’；16= β-胡萝卜素；17=脱镁叶绿素a ;17’ =脱镁叶绿素a’ ；18 =焦脱镁叶绿素b ；19 =焦脱镁叶绿素a。图2显示了表5中所示的样品I (对照)在脱臭之前的HPLC分析结果。图3显示了表5中所示的样品I (对照)在脱臭之后的HPLC分析结果。图4显示了表5中所示的样品2(包含脱镁叶绿酸)在脱臭之前的HPLC分析结果O图5显示了表5中所示的样品2 (包含脱镁叶绿酸)在脱臭之后的HPLC分析结
果O图6显示了表5中所示的样品3 (包含焦脱镁叶绿酸)在脱臭之前的HPLC分析结
果O图7显示了表5中所示的样品3 (包含焦脱镁叶绿酸)在脱臭之后的HPLC分析结
果O图8显示了表5中所示的样品4(包含脱镁叶绿素)在脱臭之前的HPLC分析结
果O图9显示了表5中所示的样品4(包含脱镁叶绿素)在脱臭之后的HPLC分析结
果O图10显示了来自拟南芥的脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(PPH)的氨基酸序列(SEQ ID N0l)o叶绿体转运肽以粗体表示。图11显示了来自拟南芥的编码脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶的核苷酸序列(SEQID NO 2)。SEQ ID NO 1 的 PPH 由 SEQ ID NO 2 的 173 至 1627 位残基编码。
图12显示了编码脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(脱镁叶绿素酶)的合成基因，该基因具有设计用于在丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)中表达的密码子(核苷酸序列SEQ ID NO :3，氨基酸序列SEQ ID NO 4)。图13显示了含有通过kexin辛肽连接子与cbhl的催化核心融合的脱镁叶绿素酶(PPH)合成基因的表达构建体。图14显示了在培养上清中表达作为分泌蛋白的PPH的里氏木霉转化体的SDS-PAGE。图15显示了毛果杨PPH的多肽序列(SEQ ID NO :5)。
图16显示了葡萄PPH的多肽序列(SEQ ID NO 6)。图17 显不了蓖麻(Ricinus communis)PPH 的多妝序列(SEQ ID NO :7)。图18显示了水稻(日本栽培群)PPH的多肽序列(SEQ ID NO 8)。图19显示了玉米PPH的多肽序列(SEQ ID NO 9)。图20显示了烟草PPH的多肽序列(SEQ ID NO 10)。图21显示了水稻日本栽培群PPH的多肽序列(SEQ ID NO : 11)。图22显示了(a)小立碗藓小立碗亚种PPH的多肽序列(SEQ ID NO 12)和(b)拟南芥叶绿素酶的多肽序列(SEQ ID NO 20)。图23显示了拟南芥PPH蛋白与推定PPH的氨基酸序列比对。发现了如下所示氨基酸序列的保守区LPGFGVG (SEQ ID NO : 13)、DFLGQG (SEQ ID NO : 14)、GNSLGG (SEQ IDNO 15)、LVKGVTLLNATPFff (SEQ ID NO 16)、HPAA (SEQ ID NO 17)、EDPff (SEQ ID NO 18)及SPAGHCPH(SEQ ID NO :19)。图24是本发明的油精制工艺的图示。图25是本发明的植物油精制工艺和装置的图示。图26显示了涉及叶绿素及其衍生物的反应和本发明中使用的酶。图27显示了普通小麦(Triticum aestivum)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO 21)。图28显示了编码小麦叶绿素酶的核苷酸序列(SEQ ID NO 22)。图29显示了莱茵衣藻叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO 23)。图30显示了编码莱茵衣藻叶绿素酶的核苷酸序列(SEQ ID NO 24)。图31显示了普通小麦叶绿素酶基因与aprE信号序列的融合体的示意图。图32显示了含有小麦(普通小麦)叶绿素酶基因的质粒pBN_TRI_CHL的示意图。图33显示了莱茵衣藻叶绿素酶基因与aprE信号序列的融合体的示意图。图34显示了含有莱茵衣藻叶绿素酶基因的质粒pBN_CHL_CHL的示意图。图35显示了与野生型酶相比缺乏N末端16个氨基酸的普通小麦叶绿素酶变体(小麦Ndl-16)的氨基酸序列(SEQ ID NO 25)。图36显示了编码与野生型酶相比缺乏N末端16个氨基酸的普通小麦叶绿素酶的变体(小麦Ndl-16)的核苷酸序列(SEQ ID NO :26)。
具体实施例方式一方面，本发明涉及一种用于处理含有焦脱镁叶绿素酶的组合物的方法。通常，实施所述方法以从所述组合物去除焦脱镁叶绿素，或降低所述组合物中的焦脱镁叶绿素水平，例如在焦脱镁叶绿素作为污染物存在的情况。焦脱镁叶绿素呈绿色，衍生自存在于分子中的卟啉(二氢卟酚)环。因此，组合物(例如植物油)中焦脱镁叶绿素的存在可赋予所述组合物不合乎需要的绿色或淡绿色。在一种实施方式中，可实施本发明的方法以去除或降低组合物中存在的绿色。因此，本发明的方法可称为漂白或脱色工艺。焦脱镁叶绿素水解产生叶绿醇和焦脱镁叶绿酸(见图26)。焦脱镁叶绿酸含有带颜色的卟啉环，但叶绿醇链的丧失意味着焦脱镁叶绿酸呈赤褐色，而非绿色。在某些实施方式中，还需要去除组合物中的焦脱镁叶绿酸并降低 红色/褐色。因此，在本发明的一种实施方式中，所述方法还可包括去除或降低组合物中的焦脱镁叶绿酸水平的步骤。本发明的方法可涉及漂白或脱色以去除所述组合物中的绿色和/或红色/褐色。在一种实施方式中，本发明涉及筛选、表达以及应用对于叶绿素的无镁降解产物(特别地，至少焦脱镁叶绿素，例如脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素)具有活性而对叶绿素具有低活性或无活性的酶。优选地，本发明的酶对叶绿素无镁降解产物(优选对焦脱镁叶绿素)比对叶绿素的活性高80%，更优选地，本发明的酶对叶绿素无镁降解产物(优选对焦脱镁叶绿素)比对叶绿素的活性高90%。更优选地，本发明的酶对叶绿素无镁降解产物(优选对焦脱镁叶绿素)比对叶绿素的活性高95%。组合物根据本发明的方法，可对于任何包含焦脱镁叶绿素的组合物进行处理，以去除不合乎需要的焦脱镁叶绿素污染。优选地，所述组合物是植物源性制品、藻类制品或细菌源性制品，例如，所述组合物是源自任何种类的植物、藻类或细菌(例如蓝细菌)的产品。在一种实施方式中，所述组合物包含植物原料、植物油或植物萃取物。术语“植物”包括完整植株、植株部分(例如，叶、茎、花、根等)、植物原生质体、种子以及植物细胞及其子代。可在本发明的方法中处理的产品所源自的植物种类包括高级植物，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)以及裸子植物。其包括具有多种倍性水平的植物，包括多倍体、二倍体、单倍体以及半合子状态。在优选的实施方式中，所述组合物可包含植物油，例如蔬菜油，包括由油料种子或油料果实(例如，诸如油菜籽(rapeseed)油之类的种子油和诸如棕榈之类的果实油)加工的油。合适的油的实例包括米糠油、大豆油、油菜籽油、棕榈油、橄榄油、棉籽油、玉米油、棕榈仁油、椰子油、花生油、芝麻油或向日葵油。本发明的方法可以与用于加工香精油(essential oil)、例如来自果实种子油(例如葡萄籽、杏、琉璃苣等的那些油)的方法联合使用。可选地，所述组合物可包含藻类制品；织物、线或纤维或布；或木制品或纸产品或副产品，例如木浆、纸浆、牛皮纸(Kraft)浆或非木纸产品或副产品，例如米纸。在所述方法的其他方面，所述组合物可包含药物制剂或化妆品制剂(例如用于药物和化妆品的脂质体)、生物柴油、食品、食用油、饲料或食品添加剂。本发明的方法可用于处理源自植物(例如蔬菜或藻类)来源或可选来自合成来源的粗制油或精制油。本发明的方法可用于处理油浓度较高的粗制油或精制油，或在一方面用于处理非精制油和非稀释粗制油。本发明的方法可以与用于处理高磷油(例如，大豆油)的方法联合使用。焦脱镁叶绿素去除焦脱镁叶绿素可作为污染物天然存在于所述组合物(例如，制剂、饲料、食品或油)中，或作为不合乎需要的组分存在于经加工的产品中。焦脱镁叶绿素可以以任何水平存在于所述组合物中。通常，焦脱镁叶绿素可作为天然污染物，以基于所述组合物(例如，植物油)的总重量O. 001至1000mg/kg(0. 001至IOOOppm, I(T7至IO^wt % )的浓度存在于所述组合物中。在其他实施方式中，焦脱镁叶绿素可以以基于所述组合物的总重量O. I至100mg/kg、0. 5 至 50mg/kg、I 至 50mg/kg、I 至 30mg/kg 或 I 至 10mg/kg 的浓度存在于所述组合物中。本发明的方法通常降低所述组合物中焦脱镁叶绿素的水平。例如，与处理前存在于总组合物中的焦脱镁叶绿素浓度(按重量)相比，所述方法可将焦脱镁叶绿素的浓度降低至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%。因此，在具体实施方式
中，基于所述组合物(例如蔬菜油)的总重量，处理之后所述组合物(例如蔬菜油)中的焦脱镁叶绿素浓度可为小于 100mg/kg、小于 50mg/kg、小于 30mg/kg、小于 10mg/kg、小于 5mg/kg、小于 lmg/kg、小于
O.5mg/kg、小于 O. lmg/kg 或小于 O. 02mg/kg。焦脱镁叶绿酸去除本发明的方法可任选包括去除焦脱镁叶绿酸的步骤。由于焦脱镁叶绿素被本发明的酶水解，焦脱镁叶绿酸可存在于所述组合物中，或可作为污染物天然存在，或作为不合乎需要的组分存在于经加工的产品中。焦脱镁叶绿酸还可由于脱镁叶绿酸降解而存在于所述组合物中，脱镁叶绿酸自身可通过具有脱镁叶绿素酶活性的酶对于脱镁叶绿素的活性而产生，或者脱镁叶绿酸可在叶绿素酶对于叶绿素作用之后而由脱植基叶绿素生成(见图26)。用于油精制的加工条件，特别是热或在所述工艺中使用诸如脱镁叶绿酸酶、叶绿素酶和/或脱镁叶绿素酶均可有助于焦脱镁叶绿酸生成中的多个步骤。焦脱镁叶绿酸可以以任何水平存在于所述组合物中。通常，在根据本发明的方法使用焦脱镁叶绿素酶处理之前或之后，焦脱镁叶绿酸可以以基于所述组合物(例如植物油)的总重量O. 001至1000mg/kg(0. 001至IOOOppm, 1(Γ7至KT1Wt % )的浓度存在于所述组合物(例如植物油)中。在其他实施方式中，焦脱镁叶绿酸可以以基于所述组合物的总重量 O. I 至 100mg/kg、0. 5 至 50mg/kg、l 至 50mg/kg、l 至 30mg/kg 或 I 至 10mg/kg 的浓度存在于所述组合物中。在一种实施方式中，相对于焦脱镁叶绿素酶处理之前和/或之后的水平，本发明的方法降低所述组合物中的焦脱镁叶绿酸水平。因此，在一些实施方式中，焦脱镁叶绿酸的浓度可在焦脱镁叶绿素酶处理之后增加。通常，所述方法包括去除焦脱镁叶绿酸的步骤，使得焦脱镁叶绿酸浓度低于焦脱镁叶绿素酶处理之后的浓度。优选地，由该酶促步骤产生的焦脱镁叶绿酸从所述组合物去除，使得所述组合物中的焦脱镁叶绿酸的终水平低于焦脱镁叶绿素酶处理前的水平。例如，相对于焦脱镁叶绿酸去除步骤之前(例如焦脱镁叶绿素酶处理之前或之后)存在于总组合物中的焦脱镁叶绿酸浓度(按重量)，所述方法可降低焦脱镁叶绿酸的浓度至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%。因此，在具体实施方式
中，在焦脱镁叶绿酸去除步骤之后，所述组合物(例如植物油)中的焦脱镁叶绿酸浓度可以为基于所述组合物(例如植物油)的总重量小于100mg/kg、小于50mg/kg、小于30mg/kg、小于10mg/kg、小于5mg/kg、小于 lmg/kg、小于 O. 5mg/kg、小于 O. lmg/kg 或小于 O. 02mg/kg。焦脱镁叶绿素酶本发明的方法包括使含有焦脱镁叶绿素 的组合物与具有焦脱镁叶绿素酶活性的酶接触的步骤。任何具有能够修饰焦脱镁叶绿素的活性的多肽均可用作本发明方法中的酶。对于“焦脱镁叶绿素酶活性”，优选是指该酶可水解焦脱镁叶绿素中的酯键以产生叶绿醇和焦脱镁叶绿酸。因此，所述酶通常具有酯酶或水解酶活性。优选地，所述酶能够在油相中、任选还在水相中具有焦脱镁叶绿素酶活性。可使用任何合适的测定技术来检测焦脱镁叶绿素酶活性，例如，使用焦脱镁叶绿素作为底物基于下文实施例中所述的酶活性(脱镁叶绿素酶和焦脱镁叶绿素酶活性)测定的技术。例如，可使用基于荧光的技术来检测焦脱镁叶绿素酶活性，例如，如下文实施例5所述通过监测焦脱镁叶绿酸来检测。在一种合适的测定中，在焦脱镁叶绿素存在下温育待检测焦脱镁叶绿素酶活性的多肽，并通过荧光检测来监测焦脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿酸和/或叶绿醇水平。可选地，焦脱镁叶绿素酶测定可基于添加推定酶之后对于焦脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿酸和/或叶绿醇水平的HPLC检测和定量，例如基于具体参考下文实施例5的实例中所述的技术。可使用例如Ali Khamessan 等(1994), Journal of Chemical Technology& Biotechnology, 60 (I),第 73-81 页；Klein 和 Vishniac (1961), J. Biol. Chem. 236 2544-2547 ;以及 Kiani 等(2006) ,Analytical Biochemistry 353 :93-98 中所揭示的那些方法来检测焦脱镁叶绿素酶活性。在合适的情况下，可使用焦脱镁叶绿素代替叶绿素作为底物。可选地，合适的测定可基于添加推定的酶之后对于焦脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿酸水平的HPLC检测和定量，例如，基于下文所述的技术。在一种实施方式中，所述测定可基于Homero-Mendez 等(2005), Food Research International 38(8-9) :1067-1072 中所述的方法。在另一种实施方式中，可使用下列测定。向170 μ I mM HEPES (pH 7. 0)中添加20 μ I 0. 3mM溶于丙酮的焦脱镁叶绿素。将酶溶于50mM HEPES (pH 7. 0)。将10 μ I酶溶液添加至190 μ I底物溶液，以启动反应，并在40°C温育多个时间段。通过添加350 μ I丙酮来终止反应。在离心(18，000g, 2分钟)之后，通过HPLC分析上清，并检测焦脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿酸的量。I单位的焦脱镁叶绿素酶活性被定义为在40°C下，例如在本文所述的测定方法中每分钟水解I微摩尔焦脱镁叶绿素的酶量。在优选的实施方式中，例如通过本文所述的测定方法所检测，基于每g纯化酶的活性单位，本发明方法中使用的酶具有至少100U/g、至少250U/g或至少500U/g的焦脱镁叶绿素酶活性。在一些实施方式中，除了焦脱镁叶绿素酶活性之外，所述酶还可具有其他活性，例如脱镁叶绿素酶活性和/或叶绿素酶活性。因此，所述酶无需对于焦脱镁叶绿素具有选择性，并且除了焦脱镁叶绿素之外，还能够利用脱镁叶绿素和/或叶绿素作为底物，只要所述酶对于焦脱镁叶绿素显示显著活性。对于“酶”，意图包括具有焦脱镁叶绿素酶活性的任何多肽，包括例如催化抗体、酶片段等。任何分离、重组、合成或嵌合(或合成与重组的组合)多肽(例如，酶或催化抗体)均可以使用。因此，本发明使用的术语“焦脱镁叶绿素酶”包括能够水解焦脱镁叶绿素的任何多肽。脱镁叶绿素酶和叶绿素酶活性可通过与上文所述用于焦脱镁叶绿素酶的那些方法类似的方法来测定，在合适的情况下，使用脱镁叶绿素或叶绿素代替焦脱镁叶绿素作为底物。在一种实施方式中，所述酶能够水解脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。更优选地，所述酶能够水解脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素，但不能水解叶绿素。例如，所述酶可以是脱镁叶绿素酶或脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(PPH)，例如Schelbert等，The Plant Cell 21 767-785(2009)中所述的酶。 在另一种实施方式中,优选地,所述酶具有小于80、小于70、小于60、小于50、小于40或小于30的脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶活性比。例如，所述酶具有O. I至70、1至50或10至30的脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶活性比。脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶活性比可通过使用上文所述方法检测脱镁叶绿素酶活性和焦脱镁叶绿素酶活性，并通过由脱镁叶绿素酶活性除以焦脱镁叶绿素酶活性来计算。特别优选的具有低脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶活性比的酶源自下文所述的小麦或衣藻。在一种实施方式中，所述酶源自小麦，例如来自小麦属，特别是来自普通小麦Triticum aestivum。例如,所述酶可为包含SEQ ID NO :21的序列的多肽(见图27),或可由SEQ ID NO 22的核苷酸序列编码(见图28)。在另一种实施方式中，所述酶源自衣藻属，特别是来自莱茵衣藻。例如，所述酶可为包含SEQ ID NO 23的序列的多肽(见图29)，或可由SEQ ID NO 24的核苷酸序列编码(见图30)。在一种实施方式中，所述酶为叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶的N末端截短变体，例如，SEQ ID NO USEQ ID NO :4至12任一者、或SEQ ID NO :21或23的N末端截短变体。在具体的实施方式中，与母序列相比，这样的N末端截短变体在N末端可缺少至少I、2、5、10或15个氨基酸(例如，I至30或5至20个氨基酸)。在一种实施方式中，所述酶包含SEQID NO 25的序列(见图35)，即SEQ ID NO 21的N末端截短变体。令人惊讶地，发现来自小麦和衣藻的叶绿素酶具有焦脱镁叶绿素酶活性，和较低的脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶活性比。另外，与野生型酶相比，小麦叶绿素酶的N末端截短变体具有降低的脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶活性比。脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶令人惊讶地发现，除了脱镁叶绿素，PPH和相关酶还能够水解焦脱镁叶绿素。然而，PPH对叶绿素没有活性。如Schelbert等人所述的，PPH直向同源物通常存在于真核光合作用生物中。PPH表现为在种系发生上不同于叶绿素酶的α/β水解酶亚组，这两组在序列同源性和底物上存在区别。在本发明的具体实施方式
中，所述酶可为源自任何物种的任何已知ΡΡΗ，或其功能性变体或片段，或可衍生自任何已知的PPH酶。例如，在一种实施方式中，所述酶为来自拟南芥的ΡΡΗ，例如包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的多肽，或由SEQ ID NO :2核苷酸序列编码的多肽(NCBI登录号NP_196884，GenBank ID No. 15240707)，或它们的功能性变体或片段。在另一种实施方式中，所述酶包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列，或由SEQ ID NO :3的核苷酸序列编码的多肽，或其功能性变体或片段。在其他实施方式中，所述酶可为源自任何下列物种的PPH:拟南芥、毛果杨、葡萄、水稻、玉米、烟草、绿色鞭毛藻、青绿藻、小立碗藓、三角褐指藻、莱茵衣藻或微胞藻RCC299。例如，所述酶可为包含表I中所示的下列数据库条目中任一所列的氨基酸序列或由其中所列的核苷酸序列编码的多肽，或其功能性片段或变体。表I生物登录号GenbankID
拟南芥NP_19688415240707
毛果杨XP_002314066224106163
葡萄CA040741157350650
水稻(日本栽培群)NP—001057593115467988
玉米ACF87407194706646
烟草CA099125156763846
绿色鞭毛藻XP_001415589145340970
青绿藻CAL50341116000661
小立碗藓XP_001761725168018382
三角褐指藻XP_002181821219122997
莱茵衣藻XP—001702982159490010
微胞藻 RCC299AC062405226516410例如，所述酶可为SEQ ID NO :5至12任一者所示的多肽，或其功能性片段或变体。变体和片段已知的焦脱镁叶绿素酶(例如PPH)序列的功能性变体和片段也可用于本发明。对于“功能性”，是指所述片段或变体保留可检测的焦脱镁叶绿素酶活性。通常，所述变体和片段在至少约10、20、30、50、100、200、300、500或1000或更多残基或全长序列上显示与已知的焦脱镁叶绿素酶(例如PPH)序列具有同源性，例如，与已知的焦脱镁叶绿素酶(例如PPH)氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO :1、或与SEQ ID NO :4至12任一者或表I中所示的序列，或与 SEQ ID N0:21、23 或 25)至少约 50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同源性。序列同一性百分数可通过使用序列比对算法分析或通过目测来确定。一方面，序列比对算法是BLAST算法，例如BLAST 2. 2. 2版算法。其他适用于本发明方法的具有焦脱镁叶绿素酶活性的酶可通过确定存在于例如已知PPH序列中的保守序列基序的存在来鉴定。保守序列基序包括下列基序LPGFGVG(SEQID NO :13)、DFLGQG(SEQ ID NO : 14)、GNSLGG(SEQ ID NO 15),LVKGVTLLNATPFff(SEQ ID NO:16) ,HPAA(SEQ ID NO :17)、EDPW(SEQ ID NO :18)以及 SPAGHCPH(SEQ ID NO :19)。因此，用于本发明的优选焦脱镁叶绿素酶包含这些序列中的一种或多种。GNSLGG (SEQ ID NO :15)基序含有活性位点丝氨酸残基。特别优选的是，用于本发明的方法的酶包含GNSLGG序列。可通过搜索基因组数据库、例如微生物组宏基因组数据库(JGI-DOE，USA)确定这些基序的存在来鉴定具有合适的焦脱镁叶绿素酶活性的多肽序列。焦脱镁叶绿素酶的分离和制备用于本发明的酶可从它们的天然来源分离或可例如使用重组DNA技术制备。可分离或构建编码具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的核苷酸序列并将其用于制备相应的多肽。例如，可使用来自产生所述多肽的生物的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果已知多肽的氨基酸序列，可合成标记的寡核苷酸探针并将其用于从由所述生物制备的基因组文库中鉴定编码多肽的克隆。可选地，也可使用含有与另一已知多肽基因同源的序列的标记寡核苷酸探针来鉴定编码多肽的克隆。在后一种情况中，可使用严谨性较低的杂交和洗涤条件。 可选地，可通过如下方法来鉴定编码多肽的克隆将基因组DNA的片段插入表达载体(例如质粒)、使用所产生的基因组DNA文库转化酶阴性细菌、然后将所转化的细菌铺板至含有被所述多肽抑制的酶的琼脂上，由此得以鉴定表达所述多肽的克隆。再者，也可以通过成熟的标准方法通过合成来制备编码所述多肽的核苷酸序列，如 Beucage S. L.等(1981) Tetrahedron Letters 22,第 1859-1869 页描述的亚憐酸胺法，或Matthes等(1984) EMBO J. 3，第801-805页描述的方法。在亚磷酰胺法中，在如自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，然后将其纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。所述核苷酸序列可以是源自混合的基因组和合成来源、混合的合成和cDNA来源、或混合的基因组和cDNA来源，其根据标准技术通过连接源自合成、基因组或cDNA来源(根据需要)的片段而制得。每个连接的片段对应于整个核苷酸序列的不同部分。所述DNA序列也可以使用特定引物通过聚合酶链式反应(PCR)来制备，如US 4，683，202或Saiki R K等(Science (1988) 239，第 487-491 页)中所述。本文所用的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变体、同源物、片段和衍生物(例如其部分)。所述核苷酸序列可以是源自基因组或合成或重组的来源，其可以是双链的或单链的(无论其代表正义链还是反义链)。通常，使用重组DNA技术制备编码具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的核苷酸序列。然而，在本发明的另一种可选实施方式中，可以使用本领域已知的化学方法来合成全部或部分核苷酸序列(见 Caruthers MH 等(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 和 HornT 等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。酶序列的修饰一旦分离出编码酶的核苷酸序列或鉴定出编码推定的酶的核苷酸序列后，可能需要对所选择的核苷酸序列进行修饰，例如可能需要对所述序列进行突变以制备本发明的酶。可以使用合成的寡核苷酸来引入突变。这些寡核苷酸包含位于所需突变位点侧翼的核苷酸序列。Morinaga等(Biotechnology (1984) 2,第646-649页)中公开了适合的方法。Nelson 和 Long (Analytical Biochemistry (1989), 180,第 147-151 页)中描述了向编码酶的核苷酸序列中弓I入突变的另一种方法。可以随机引入突变以代替如上文所述的定点诱变，如使用可商购的试剂盒，如来自 Stratagene 的 GeneMorph PCR 诱变试剂盒,或来自 Clontech 的 Diversify PCR 随机诱变试剂盒。EP O 583 265涉及用于优化基于PCR的诱变的方法，其也可以与诸如EP O 866796中所述的那些DNA突变类似物结合使用。易错PCR技术也适用于制备具有优选性质的焦脱镁叶绿素酶变体。W00206457提到了脂酶的分子进化。获得新型序列的第三种方法是使用任何数量的限制性酶或如Dnase I的酶将不同的核苷酸序列片段化，并重新组装成编码功能性蛋白的全长核苷酸序列。或者，可以使用一个或多个不同的核苷酸序列，并在重新组装全长核苷酸序列时引入突变。DNA改组(shuffling)和家族改组技术适用于制备具有优选性质的焦脱镁叶绿素酶变体。适合进行“改组”的方法可以见EP0752008、EP1138763、EP1103606。改组也可以与如US 6，180，406和TO 01/34835中所述的其他形式的DNA诱变相结合。因此，有可能在体内或体外在核苷酸序列中产生大 量定点突变或随机突变，并随后通过多种手段筛选功能性得到改进的编码多肽。可以使用例如计算机分析(insilico)和外切酶介导(exo-mediated)的重组方法(见 WO 00/58517、US 6，344，328、US6，361，974)进行分子进化，其中所产生的变体保留了与已知酶或蛋白的很低的同源性。由此获得的所述变体可与已知的脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶具有显著的结构类似性，但具有很低的氨基酸序列同源性。此外，如在非限定性实例中，多核苷酸序列的突变体或天然变体也可以与野生型或其他突变体或天然变体重组以生产新的变体。也可以筛选所述新的变体以获得功能性得到改进的编码多肽。应用上述以及类似的分子进化方法能够在没有关于蛋白结构或功能的任何现有知识的情况下，鉴定和选择具有优选特性的本发明的酶的变体，并能够产生不可预测但有益的突变体或变体。在本领域中应用分子进化来优化或改变酶活性的实例有很多，所述实例包括但不限于以下的一种或多种优化在宿主细胞或体外的表达和/或活性、增加酶活性、改变底物和/或产物特异性、增加或降低酶稳定性或结构稳定性、改变在优选环境条件(如温度、pH、底物)中酶的活性/特异性。使用分子进化工具可以改变酶以提高该酶的功能性，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。适合地，用于本发明的编码焦脱镁叶绿素酶(例如PPH)的核苷酸序列可以编码焦脱镁叶绿素酶变体(例如PPH变体)，即当与亲本酶比较时，所述焦脱镁叶绿素酶(例如PPH)可以包含至少一个氨基酸的取代、缺失或添加。变体酶保持与亲本酶至少1%、2%,3%,5% ,10% ,15%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,97%,99%的同源性。适合的亲本酶可以包括具有焦脱镁叶绿素酶活性的任何酶。焦脱镁叶绿素酶多肽序列本发明还涵盖由编码焦脱镁叶绿素酶的核苷酸序列所编码的氨基酸序列在本发明任一方法和/或用途中的用途。本文所使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。所述氨基酸序列可以从适合的来源制备/分离，或其可以通过合成制备、或其可以使用重组DNA技术制备。适合地，所述氨基酸序列可以通过标准技术从本文教导的分离多肽获得。一种适合测定分离多肽的氨基酸序列的方法如下可以将纯化的多肽冻干，并将100 μ g的冻干原料溶解于8M尿素和O. 4M碳酸氢铵的50 μ I混合物(pH 8. 4)中。在覆盖氮气并添加5μ I 45mM 二硫苏糖醇后，可以将溶解的蛋白在50°C变性并还原15分钟。冷却至室温后，可以添加5μ I IOOmM碘乙酰胺，从而使半胱氨酸残基在室温、避光和氮气下衍生15分钟。可以向以上反应混合物中添加135 μ I水和含5 μ g内切蛋白酶Lys_C的5 μ I水溶液，并在37°C氮气保护下消化24小时。可以使用溶剂A(0. 1% TFA的水溶液)和溶剂B (O. I % TFA 的乙臆溶液)在 VYDAC C18 柱(O. 46 X 15cm ; 10 μ m ;The Separation Group,California, USA)上通过反相HPLC分离所得到的肽。在N-末端测序前，可以使用相同的溶剂体系在Develosil C18柱上对所选择的肽进行重新色谱分析。可以使用AppliedBiosystems 476A 测序仪,根据制造商的说明书(Applied Biosystems, California, USA)使用脉冲液态快速循环来完成测序。 序列比对在此，术语“同源物”是指与目标氨基酸序列和目标核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可以等同于“同一性”。所述同源氨基酸序列和/或核苷酸序列可以提供和/或编码保留所述酶的功能活性和/或增强所述酶的活性的多肽。在本文中，认为同源序列包括可以与目标序列有至少75%、85%或90%同一性，优选为至少95%或98%同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包含与目标氨基酸序列相同的活性位点等。虽然同源性也可以被视为相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，但是在本发明的内容中，优选地，以序列同一性表示同源性。在本文中，认为同源序列包括可以与编码本发明多肽的核苷酸序列(目标序列)有至少75 %、85 %或90 %同一性的核苷酸序列，优选为至少95 %或98 %同一性的核苷酸序列。通常，同源物将包括与目标序列相同的活性位点编码序列等。虽然同源性也可以被视为相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，但是在本发明的内容中，优选地，以序列同一性表示同源性。可以通过目测进行同源性比较，或者更通常是借助易于获得的序列比较程序进行同源性比较。这些商业性计算机程序可以计算两个或多个序列间的同源性％。可以在连续的序列中计算同源性％，即一个序列与其他序列比对，且将一个序列中的每个氨基酸与其他序列中的相应氨基酸直接比较，每次比较一个残基。这被称为“无缺口”比对。通常所述无缺口比对仅在数量相对少的残基中进行。虽然这是非常简单且稳定的方法，但是其未能考虑到如在其他方面相同的成对序列中，一个插入或缺失将引起随后的氨基酸残基无法比对，因此可能导致在进行整体比对时的同源性％大大降低。因此，大部分序列比对方法被设计成产生考虑了可能的插入和缺失而不过度地惩罚整体同源性得分的最佳比对。这可以通过在比对序列中插入“缺口”以试图使局部同源性最大化而实现。然而，这些更加复杂的方法给比对中出现的每个缺口赋予“缺口罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽量少缺口的序列比对(反映了两个比较的序列间更高的相关性)将比具有更多缺口的序列比对得到更高的得分。通常使用“仿射缺口罚分”(Affinegap cost),即对缺口的存在处以较高罚分,而对缺口中的每个后续残基处以较小罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分无疑将产生具有更少缺口的优化比对。大多数比对程序允许修正缺口罚分。然而，当使用所述软件进行序列比较时，优选使用默认值。
因此，最大同源性％的计算首先需要在考虑缺口罚分下产生最佳的比对。适合用于进行所述比对的计算机程序为Vector NTI Advance 11 (Invitrogen Corp.) 可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(见Ausubel等1999 ShortProtocols in Molecular Biology,第 4 版，第 18 章)和 FASTA (Altschul 等 1990 J. Mol.Biol. 403-410)。BLAST和FASTA均可进行离线和在线搜索(见Ausubel等1999，第7-58至7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用Vector NTI Advance 11程序。也可以将称为BLAST 2 Sequences的新型工具用于比较蛋白和核苷酸序列(见FEMS Microbiol Lett1999 174(2) :247-50 ;和 FEMS Microbiol Lett 1999 177(1) :187-8)。虽然可以根据同一性来测定最终的同源性％ ，但是比对方法本身通常不是基于全是或全非的成对比较。作为代替，通常使用尺度相似性评分矩阵(scaled similarityscore matrix)，基于化学相似性或进化距离对每对比较评分。通常所用的此矩阵的实例为BL0SUM62矩阵(BLAST程序套装的默认矩阵)。Vector NTI程序通常使用公开的默认值，或者也可能使用所提供的自定义符号比较表(更多细节详见用户手册)。对于一些应用，优选使用Vector NTI Advance 11软件包的默认值。或者，也可以使用基于与CLUSTAL(Higgins DG 和 Sharp PM(1988), Gene 73(1)，237-244)类似的算法的 Vector NTI Advance 11 (Invitrogen Corp.)中的多重比对特征来计算同源性％。一旦软件生成了最佳比对，就可以计算同源性％，优选为序列同一性％。软件通常将其作为序列比较的一部分来执行，并生成数值结果。如果在测定序列同一性时使用缺口罚分，则优选使用程序的默认参数进行成对比对。例如，下列参数是目前用于BLAST 2成对比对的默认参数
_BLAST 2__DNA__蛋白质_
_期望阈值__1 ____10_
_^__11__3_
_评分参数___
_匹酉己/错配得分__2、-3__n/a _
___n/a__BLOSUM62_
缺口评分开口 5 开口 11__延伸2__延伸I_在一种实施方式中，优选地，核苷酸序列和/或氨基酸序列的序列同一性可使用BLAST2 (blastn)和如上所列的评分参数来确定。出于本发明的目的，同一性的程度基于相同的序列元件的数量来确定。本发明氨基酸序列的同一性程度可以通过本领域已知的计算机程序的方法,如Vector NTIAdvance 11 (Invitrogen Corp.)来适当地测定。对于成对比对,所用的评分参数优选为缺口开口罚分为11且缺口延伸罚分为I的BL0SUM62。适合地，在至少20个连续的核苷酸中、优选在至少30个连续的核苷酸中、优选在至少40个连续的核苷酸中、优选在至少50个连续的核苷酸中、优选在至少60个连续的核苷酸中、优选在至少100个连续的核苷酸中测定核苷酸序列的同一性程度。适合地，可在全长序列上测定核苷酸序列的同一性程度。氨基酸突变所述序列也可以具有产生沉默改变和产生功能等价物的氨基酸残基的缺失、插入或取代。可以根据残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质上的相似性来进行谨慎的氨基酸取代，只要该物质的二级结合活性被保持即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。例如可以根据下表进行保守取代。在第二列中相同栏中的氨基酸，优选在第三列中相同行中的氨基酸可以相互取代
权利要求
1.一种用于处理含有焦脱镁叶绿素的组合物的方法，其包括使所述组合物与能够水解焦脱镁叶绿素的酶接触。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述组合物包括植物源性油。
3.根据权利要求I或权利要求2所述的方法，其中所述酶包括脱镁叶绿素酶或脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶。
4.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述酶源自拟南芥(Arabidopsisthaliana)、毛果杨(Populus trichocarpa)> 葡萄(Vitis vinifera)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zea mays)、烟草(Nicotiana tabacum)、绿色鞭毛藻(OstreococcusIucimarinus)、青绿藻(Ostreococcus taurii)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、普通小麦(triticum aestivum)或微胞藻(Micromonas sp.)RCC299。
5.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述酶包含选自下列的氨基酸序列LPGFGVG (SEQ ID NO : 13)、DFLGQG (SEQ ID NO : 14)、GNSLGG (SEQ ID NO :15)、LVKGVTLLNATPFff (SEQ ID NO : 16)、HPAA (SEQ ID NO : 17)、EDPW (SEQ ID NO :18)以及SPAGHCPH(SEQ ID NO :19)。
6.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述酶包含SEQID NO=USEQ ID N0:4至12任一者或SEQ ID NO :21、23或25任一者所示的多肽序列或其功能性片段或变体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述酶包含在至少50个氨基酸残基上与SEQIDNO USEQ ID NO :4至12任一者或SEQ ID NO :21、23或25任一者具有至少75%序列同一性的多肽序列。
8.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述组合物中的焦脱镁叶绿素被水解生成焦脱镁叶绿酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其还包括从所述组合物中去除焦脱镁叶绿酸的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法包括脱臭步骤。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述方法包括二氧化硅处理的步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法包括两个或多个二氧化硅处理步骤。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述二氧化硅处理在约70至110°C下进行。
14.根据前述任一权利要求所述的方法，其中将所述能够水解焦脱镁叶绿素的酶固定于固体支持体上。
15.根据前述任一权利要求所述的方法，其还包括使所述组合物与具有叶绿素酶活性的酶接触。
16.根据权利要求15所述的方法，其中将所述具有叶绿素酶活性的酶固定于固体支持体上。
17.根据权利要求2至16任一项所述的方法，其中所述组合物包括选自米糠油、大豆油、油菜籽油、棕榈油、橄榄油、棉籽油、玉米油、棕榈仁油、椰子油、花生油、芝麻油或向日葵油的油。
18.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，与处理前存在于所述组合物中的焦脱镁叶绿素的浓度相比，所述组合物中焦脱镁叶绿素的浓度降低至少10 %。
19.一种用于精制植物油的工艺，其包括前述任一权利要求所述的方法。
20.根据权利要求19所述的工艺，其还包括己烷萃取和/或脱胶步骤。
21.具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽用于从组合物中去除焦脱镁叶绿素污染的用途。
22.一种用于对含有焦脱镁叶绿素的组合物进行酶处理的装置，该装置包括(a)植物油精制装置；和(b)可操作地并入所述植物油精制装置中具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽，从而使所述多肽能够在精制所述组合物的过程中水解所述组合物中的焦脱镁叶绿素。
23.一种组合物，其包含固定于二氧化硅上的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽。
24.—种多肽，其具有如SEQ ID NO :4所示的序列，或由SEQ ID NO :3所示的序列编码的序列，或具有焦脱镁叶绿素酶活性的其功能性变体或片段。
25.可通过权利要求I至20任一项所述的工艺或方法获得的组合物。
26.根据权利要求I至18任一项所述的方法，其中所述酶具有小于80的脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶活性比。
27.一种多肽，其具有SEQ ID NO :25所示序列，或具有焦脱镁叶绿素酶活性的其功能性变体或片段。
全文摘要
本发明提供了用于处理含有焦脱镁叶绿素的组合物，特别是用于从中去除焦脱镁叶绿素的方法和用途。所述组合物通常是植物源性、藻源性或细菌源性产品，例如植物油。所述方法包括使所述组合物与具有焦脱镁叶绿素酶活性的酶接触的步骤。本发明还提供了用于实施所述方法和用途的相关装置和产品。
文档编号C11B3/00GK102803479SQ201080026156
公开日2012年11月28日 申请日期2010年6月10日 优先权日2009年6月12日
发明者约恩·博尔奇·瑟, 夏洛特·霍斯曼斯·波尔森, 马苏德·拉贾比·扎尔加海, 延斯·弗里斯贝克·瑟伦森, 蒂娜·约恩森, 詹妮·布伦斯特德, 勒内·米凯尔森, 苏珊·M·马德里德 申请人:杜邦营养生物科学有限公司