不含叶绿醇的叶绿素衍生物的检测分析法的制作方法

专利名称：不含叶绿醇的叶绿素衍生物的检测分析法的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测样品中的叶绿素衍生物的方法。该方法可用在测定样品中叶绿素酶或相关酶的活性的检测分析法。
背景技术：
叶绿素是在整个植物界广泛存在的一种绿色色素。叶绿素是光合作用所必需的，并且是地球上发现的最丰富的有机金属化合物之一。因而许多来自植物的产品(包括食物和饲料)含有相当多的叶绿素。在植物中，叶绿素酶(chlorophyllase或chlase)被认为参与叶绿素降解，并催化叶绿素中酯键的水解而生成脱植基叶绿素和叶绿醇。作为另外一种选择,可通过从卟啉(二 氢卟酚)环失去镁离子使叶绿素发生降解，形成名为脱镁叶绿素的衍生物(参见图5)。在某些条件下，一些叶绿素酶还能水解脱镁叶绿素，产生脱镁叶绿酸和叶绿醇。脱镁叶绿酸也可通过从脱植基叶绿素(即叶绿素水解之后)失去镁离子而产生(参见图5)。脱镁叶绿素可进一步降解为焦脱镁叶绿素。一种可能的机制是脱镁叶绿素碳环上甲酯键的酶水解，然后不稳定中间体向焦脱镁叶绿素的非酶转化。据报道，来自藜(Chenopodium album)的名为脱镁叶绿酸酶的28_29kDa酶能够催化脱镁叶绿酸上类似的反应，产生不含叶绿醇的焦脱镁叶绿素衍生物，称为焦脱镁叶绿酸(参见图5)。焦脱镁叶绿素也可由某些酶水解，形成焦脱镁叶绿酸和叶绿醇。已开发出多种检测分析法来测定样品中的叶绿素酶活性(参见例如Khamessanet al. (1994), Journal of Chemical Technology&Biotechnology,Vol.60 (I), pages 73-81 (Khamessan等人,1994年，《化学技术与生物技术杂志》，第60卷第I期第73-81页))。测定叶绿素酶活性的最广泛使用的方法由Klein和Vishniac在J. Biol.Chem. 1961236:2544-2547 (《生物化学杂志》，1961年，第236卷第2544-2547页)中进行了描述。该方法涉及在含丙酮的水性缓冲体系中测定酶活性。加入丙酮是为了确保底物(叶绿素)的溶解。酶反应发生后，将残余的底物萃取到己烷中。反应产物脱植基叶绿素由于失去了叶绿醇链，其亲水性比叶绿素更高。因此，脱植基叶绿素仍留在水/丙酮相中，然后便可通过分光光度计测量法进行定量。虽然已对此方法的多种改良方案进行了描述，但所有已公布的方法均涉及反应产物的己烷分提步骤。此步骤是必需的，因为使用光谱技术难以区分叶绿素和脱植基叶绿素。己烷萃取后，底物和反应产物将处于不同的相中，因此对任一者的测量均可用于测定酶的活性。然而，己烷分提过程费力又麻烦，并不非常适合用于叶绿素酶活性的高通量筛选(HTS)方法。Arkus 等人在 Analytical Biochemistry 353 (2006) 93 - 98(《分析生物化学》，2006年，第353卷第93 - 98页)中报道了尝试克服在叶绿素酶的高通量筛选中己烷萃取方面的问题。此检测分析法不再使用叶绿素作为底物，而是采用对硝基苯酯作为叶绿素酶高通量筛选中的人工底物。遗憾的是，此方法并不是很可靠，因为某些叶绿素酶虽然对叶绿素的活性很高，但是对于对硝基苯酯的活性相当低，可能会产生假阴性结果。此外，微生物叶绿素酶往往与其他酯酶共同表达，这些酶可作用于对硝基苯酯但不会作用于叶绿素，因此会得到假阳性结果。因而，仍需要叶绿素酶和相关酶的改进检测分析法。具体地讲，需要一种避免溶剂萃取的不足而又可靠、准确并适于高通量筛选的方法。

发明内容
因此，本发明提供检测样品中不含叶绿醇的叶绿素衍生物的方法，该方法包括检测与不含叶绿醇的叶绿素衍生物相关的荧光信号的步骤，其中与叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物相关的荧光信号被猝灭。在一个实施例中，与叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物相关的荧光信号通过叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物的二聚化而猝灭。优选地，在检测步骤中所用的条件下，叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物比不含叶绿醇的叶绿素衍生物优先二聚化。 在一个实施例中，不含叶绿醇的叶绿素衍生物包括脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸或焦脱镁叶绿酸。在一个实施例中，叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物包括叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素。可在含表面活性剂、醇和碱的检测溶液中执行检测步骤。优选地，该醇包括异丙醇，更优选地为12至20重量％的醇。在一个实施例中，该表面活性剂的含量按检测溶液的总重量计为O. 01至O. 03重量％，优选地包括4-(1，1,3, 3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇。在一个实施例中，该检测步骤在20至25°C并优选地在大于10. O的pH值下进行。可在例如约670nm处检测突光信号。在一个实施例中，叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物以二聚体和/或其他非胶态多聚体的水溶液形式存在。在一个实施例中，该检测步骤在不存在脂质体的情况下进行。在一个实施例中，表面活性剂包括4- (1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇，醇包括异丙醇，而碱包括氢氧化钠。在另一方面，本发明提供定量样品中的酶活性的检测分析方法，其中该酶能够水解叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物，该检测分析方法包括a)将样品与叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物接触；和b)通过上述方法检测不含叶绿醇的叶绿素衍生物的产生情况。在一个实施例中，步骤(a)包括将样品与叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物在含有表面活性剂、丙酮和/或缓冲液的反应溶液中进行温育。优选地，在步骤(a)之后并在步骤(b)之前，将反应溶液加到如上所定义的检测溶液中以终止酶活性。在一个实施例中，该酶在步骤(a)中具有活性，而在步骤(b)中无活性。在另一个方面，本发明提供用于定量样品中的酶活性的试剂盒，其中该酶能够水解叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物，该试剂盒包含a)反应溶液，该酶在其中具有活性；b)底物，其包含叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物；以及c)检测溶液,该底物在其中比该酶产生的不含叶绿醇的叶绿素衍生物优先发生二聚化。在一个实施例中，该反应溶液包含表面活性剂、丙酮和缓冲液。优选地，该底物包括叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素。该检测溶液可为如上所述的检测溶液。优选地，该酶在该检测溶液中无活性。在一个实施例中，试剂盒还包含一种或多种标准溶液，每种标准溶液均包含已知浓度的不含叶绿醇的叶绿素衍生物。


图I示出了由两个脱镁叶绿素分子形成二聚体的过程。二聚化通过卟啉(二氢卟酚)环发生，并导致670nm处的荧光猝灭。图2示出了相对荧光(RFU)与焦脱镁叶绿酸浓度(PM)的标准(校准)曲线。图3示出了相对荧光(RFU)与脱镁叶绿酸浓度(PM)的标准(校准)曲线。图4示出了脱镁叶绿素在脱镁叶绿素酶的催化作用下水解生成脱镁叶绿酸和叶
绿醇。图5示出了涉及叶绿素和衍生物的反应以及可通过本发明进行检测的酶活性。
具体实施例方式在一个方面，本发明涉及检测样品中不含叶绿醇的叶绿素衍生物的方法。通过猝灭样品中衍生自叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物的荧光信号，可直接检测不含叶绿醇的叶绿素衍生物。该方法可用于定量，即，可使用该方法来测定样品中不含叶绿醇的叶绿素衍生物的水平或浓度。因此，该方法尤其可用于测定样品中叶绿素酶或相关酶的活性，因为它无需进行物理分离便可将产物与底物区分开(即，无需对底物和产物进行己烷萃取或其他溶剂分提)。叶绿素和叶绿素衍牛物所谓“含叶绿醇的叶绿素衍生物”通常是指包含卟啉(二氢卟酚)环和叶绿醇基团(尾)的化合物，包括不含镁含叶绿醇的衍生物，诸如脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。叶绿素和含叶绿醇的叶绿素衍生物的颜色通常为绿色,这是因为有卟啉(二氢卟酹)环存在于分子中。优选地，叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物为叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素，更优选地为脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素。叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物在本文所述的检测分析方法中通常用作底物。所谓“不含叶绿醇的叶绿素衍生物”通常是指含叶绿醇的叶绿素衍生物的酶水解产物。叶绿素酶或相关酶可水解叶绿素和含叶绿醇的叶绿素衍生物以从二氢卟酚环裂解叶绿醇尾。这些化合物仍包含有色卟啉环，其中脱植基叶绿素呈绿色而脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸则呈红棕色。优选地，不含叶绿醇的叶绿素衍生物为脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸或焦脱镁叶绿酸，更优选地为脱镁叶绿酸或焦脱镁叶绿酸。不含叶绿醇的叶绿素衍生物通常为本文所述的检测分析方法中的反应产物。叶绿素或叶绿素衍生物可为例如a、b或d形式。如本文所用，术语“叶绿素”包括叶绿素a、叶绿素b和叶绿素d。类似地,当提及脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿素、脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸时，兼指a、b和d形式。如本文所述的检测方法通常允许将叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物与其相应的不含叶绿醇的叶绿素衍生物区分开。例如，该方法可以使得能够将叶绿素酶或相关酶的底物和反应产物彼此区分开。在特定实施例中，底物/产物(含叶绿醇/不含叶绿醇)对可以为(a)叶绿素和脱植基叶绿素；(b)脱镁叶绿素和脱镁叶绿酸；或(C)焦脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿酸。样品本方法可用于检测存在于样品中的不含叶绿醇的叶绿素衍生物。样品可以(例如)包括衍生自任何类型的植物、藻类或细菌(例如蓝细菌)的植物源制备样、藻类制备样或细菌源制备样。在一个实施例中，样品包含植物材料、植物油或植物提取物。例如，样品可包含诸如菜油的植物油，包括由含油种子或含油果实加工得到的油(例如，诸如低芥酸菜子(油菜籽)油的种子油和诸如棕榈油的果油)。如本文所述，在一些实施例中，该方法用于测定样品中酶(例如叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶)的活性。在此类实施例中，样品可包括任何疑似含有相关酶活性的制备样。样品可以(例如)包含植物、藻类或细菌制备样或提取物，或者可以包含要测试叶绿素酶或相关酶活性的纯化或重组蛋白质。在这些实施例中，不含叶绿醇的叶绿素衍 生物在检测分析方法的接触步骤之前可不存在于样品中，即不含叶绿醇的衍生物可在添加合适的酶底物后产生。检测费光信号在本发明的实施例中，检测与不含叶绿醇的叶绿素衍生物相关的荧光信号。例如，可以检测、测量或定量不含叶绿醇的衍生物所衍生的或发射的荧光信号，优选地在没有衍生自叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物的荧光信号的情况下进行。用于检测荧光信号的方法是本领域中所熟知的。例如，衍生自不含叶绿醇的叶绿素衍生物的荧光信号可以由任何合适的检测器检测，例如荧光分光光度计、荧光酶标仪或分光荧光计。检测器通常包括光源，其产生用于激活荧光材料的适当波长的光；以及光学元件，其引导光源穿过检测窗口至容纳在通道或腔室中的材料。可以使用各种光源作为激发源，包括激光器、光电二极管和氙气灯或汞汽灯。光可透过滤光器(例如衍射光栅)或单色仪，以便在穿过样品之前选择固定的波长。可让发射光透过滤光器或单色仪，而光电检测器检测的特定波长通常与激发光成90度角。光电检测器可包括(例如)光电倍增管、光电二极管或电荷耦合器件(CCD)检测器。光电检测器通常提供荧光信号的强度值。信号可以作为数字或模拟输出进行处理。在本发明的实施例中，选择适于检测叶绿素衍生物荧光的激发和发射波长，例如约410nm的激发波长和约670nm的发射波长。通常，所测荧光信号的强度与样品中不含叶绿醇的叶绿素衍生物的浓度成正比。猝灭叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物发出的荧光信号在本发明的实施例中，样品中与叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物相关的荧光信号被猝灭。所谓“猝灭”是指衍生自样品中的叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物的荧光信号强度下降、受到抑制或遏制。在一个优选的实施例中，与叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物相关的荧光信号通过二聚化猝灭。所谓“二聚化”是指至少两个含叶绿醇的叶绿素衍生物分子关联起来以形成至少一个二聚体。因而，在此所用的“二聚化”包括形成含有三个或更多个含叶绿醇的叶绿素衍生物分子的更高级结构，诸如三聚体、四聚体或其他多聚体，前提条件是这些结构发出的荧光信号被猝灭并且二聚体或其他多聚体仍保留在溶液中(例如二聚体或多聚体是水溶液中的溶质)。也就是说，通常而言，叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物在检测溶液中不形成固体颗粒，例如叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物在检测溶液中不沉淀或不形成固体胶态聚集体。“二聚作用”和“多聚作用”因此可互换使用，并且也应相应地理解“二聚化”、“二聚化的”、“使形成二聚体”、“形成二聚体”。通过HPLC分析(FoodResearch International 38 (8-9) : 1067-1072 (2005))(《国际食品研究》，第38卷第8-9期，第1067-1072页，2005年)已知的是，含叶绿醇的化合物诸如叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素通过410nm处的激发和667nm处的发射产生非常强的荧光信号。在某些条件下，叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素的卟啉环能够形成二聚体，其强烈地猝灭荧光信号(参见 J. Photochem. Photobiol. B:Biol. 54(2000) 194 - 200(《光化学与光生物学杂志，B辑生物学》，第54卷，2000年，第194 - 200页))。不含叶绿醇的叶绿素衍生物诸如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸也能够通过卟啉环二聚化，导致类似的荧光强度下降。然而，含叶绿醇和不含叶绿醇的叶绿素衍生物发生二聚化的条件可不同。在本发明的实施例中，可以对这种差异进行研究，以便选择专门检测不含叶绿醇的衍生物发出的荧光的条件。因此，在一个实施例中，检测步骤在使得叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物相比 不含叶绿醇的叶绿素衍生物优先二聚化的条件下进行。所谓“优先二聚化”是指在这些条件下叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物二聚化的比例大于不含叶绿醇的叶绿素衍生物二聚化的比例。在一些实施例中，至少50%、至少70%、至少90%或至少95%的衍生自叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物的荧光信号被猝灭，优选地通过二聚化猝灭。也就是说，在所用的检测条件下，衍生自叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物的荧光信号强度与不发生猝灭的对照条件下(例如在叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物未发生显著二聚化的条件下)衍生自叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物的荧光信号相比下降指定的比例。例如，无猝灭条件可以包括高(例如>0. 1%)浓度的表面活性剂。优选地，衍生自不含叶绿醇的叶绿素衍生物的荧光信号不显著猝灭，或与衍生自叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物的荧光信号相比，被猝灭的程度较低。例如，在一些实施例中，与不发生猝灭的对照条件下(例如在不含叶绿醇的叶绿素衍生物未发生显著二聚化的条件下)衍生自不含叶绿醇的叶绿素衍生物的荧光信号相比，低于50%、低于25%或低于10%的衍生自不含叶绿醇的叶绿素衍生物的荧光信号被猝灭。检测条件本发明的检测步骤可在使得样品中与叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物相关的荧光信号被猝灭的条件下进行，优选地通过二聚化被猝灭。通过改变检测信号的溶液的组成，本领域技术人员可以选择适当的条件用以猝灭荧光信号，例如叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物显著二聚化而不含叶绿醇的叶绿素衍生物未二聚化的条件。通常，检测步骤在水溶液中进行。执行检测步骤的溶液在本文中称为“检测溶液”。已经发现的是，可改变检测溶液的组成以影响叶绿素衍生物的二聚化和荧光信号的猝灭。具体地讲，检测溶液中表面活性剂的浓度、温度、PH和溶剂的类型与浓度可影响二聚化并且可以改变以便为检测步骤选择合适的条件。优选地，检测溶液包含表面活性剂、溶剂和/或碱。溶剂通常为诸如醇的极性质子溶剂，优选地为低级醇(例如C1-C5或C1-C3),更优选地为脂族一元醇。在特定实施例中，醇包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇，更优选地为乙醇或异丙醇，最优选地为异丙醇。检测溶液可包含5至25重量％的醇，例如5至20重量％、5至15重量％、10至20重量％、12至20重量％、13至17重量％或约15重量％的醇，例如乙醇或异丙醇。溶剂(例如醇)的适当浓度可基于具体的醇和其他条件(即表面活性剂浓度、pH、温度等)进行选择。如果其他反应条件保持不变，则增加溶剂浓度通常会减少二聚化并因此减少荧光信号的猝灭。在一些实施例中，可以调整溶剂浓度(例如逐步增加同时保持其他条件不变)直至达到不含叶绿醇的叶绿素衍生物不再二聚化的浓度，但在此浓度下叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物仍处于二聚化状态。此时，叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物发出的荧光信号仍然猝灭，而不含叶绿醇的衍生物发出的信号不猝灭。溶剂的这一浓度可随后用于检测步骤。对表面活性剂的性质没有特别限制。在特定实施例中，表面活性剂可以为(例如)阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或非离子表面活性剂。
合适的阴离子表面活性剂包括(例如)羧酸盐，诸如皂和聚烷氧基羧酸盐；磺酸盐，诸如烷基苯磺酸盐、烷基芳基磺酸盐、萘磺酸盐、α -烯烃磺酸盐、具有酯、酰胺或醚键的磺酸盐(包括酰胺基磺酸盐、脂肪酸2-磺乙基酯和脂肪酸酯磺酸盐)；硫酸盐，诸如醇硫酸盐、乙氧基化和硫酸化醇、乙氧基化和硫酸化烷基酚、硫酸化酸、硫酸化酰胺、硫酸化酯和硫酸化天然油和脂肪；磷酸酯，诸如磷酸丁酯、磷酸己酯、2-乙基己基磷酸酯、磷酸辛酯、磷酸癸酯、磷酸辛癸酯、混合烷基磷酸酯、多磷酸己酯、多磷酸辛酯、混合脂肪酸的甘油单酯(磷酸化)、2-乙基己醇(乙氧基化和磷酸化)、十二烷基醇(乙氧基化和磷酸化)、十三烷基醇(支化)、9_十八烷基醇(乙氧基化和磷酸化)、多元醇(乙氧基化和磷酸化)、酚(乙氧基化和磷酸化)、辛基酚(乙氧基化和磷酸化)、壬基酚(乙氧基化和磷酸化)、十二烷基酚(乙氧基化和磷酸化)和二壬基酚(乙氧基化和磷酸化)；以及膦酸酯。合适的阳离子表面活性剂包括(例如)胺，诸如不含氧的胺(包括单胺、二胺和多胺)、含氧的胺(包括氧化胺、乙氧基化烷基胺、I- (2-羟基乙基)-2-咪唑啉和乙二胺的烷氧基化物、乙二胺烷氧基化物)以及具有酰胺键的胺；以及季铵盐，诸如二烷基二甲基铵盐、氯化烷基苄基二甲基铵、烷基三甲基铵盐、烷基吡啶鎗卤化物和季铵酯。两性离子表面活性剂的例子包括烷基甜菜碱、酰胺丙基甜菜碱、烷基二甲胺、咪唑啉衍生物和氨基酸及其衍生物。可以使用的非离子表面活性剂包括羧酸酯，诸如甘油酯和聚氧乙烯酯；失水山梨醇酯，诸如乙氧基化失水山梨醇酯；聚氧乙烯表面活性剂，诸如醇乙氧基化物和烷基酚乙氧基化物；天然乙氧基化脂肪、油和蜡；脂肪酸乙二醇酯；烷基聚葡萄糖苷；羧酰胺，诸如二乙醇胺缩合物、单烷醇胺缩合物(包括椰油酸、月桂酸、油酸和硬脂酸单乙醇酰胺)和单异丙醇酰胺、聚氧乙烯脂肪酸酰胺；脂肪酸葡糖酰胺；以及聚氧化烯嵌段共聚物。许多合适的表面活性剂可商购获得，包括=PluiOnii^系列的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；可以商品名Cremoplior#购得的聚乙二醇氢化蓖麻油，例如Cremophor RH40 ;可以商品名Nikkd 购得的产品(例如Nikkolf HC0-40和HC0-60);可以商品名Tagat 购得的聚氧乙烯甘油脂肪酸酯(例如Tagat RH 40和Tagat το);聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，例如可以商品名Tweeni"商购获得的单和三月桂基、棕榈基、硬脂基和油烯基酯(例如Tween 20>Tween5 40或Tweenw 80);磷脂,尤其是卵磷脂,诸如大丑卵磷脂；可以商标Span 商购获得的山梨糖醇酐脂肪酸酯，例如Span 20 (山梨糖醇酐单月桂酸酯)或Span 80 (山梨糖醇酐单油酸酯)。在一个实施例中，表面活性剂为聚氧乙烯表面活性剂,优选地具有约5至约50个聚氧乙烯部分聚合数，例如8至12个。更优选地，表面活性剂包括烷芳基乙氧基化物，诸如烷基酚乙氧基化物，例如与环氧乙烷聚合的辛基酚。在一个实施例中，表面活性剂包括4-辛基酚聚乙氧基化物(4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)，例如可以商品名Triton X-100从密苏里州圣路易斯市西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich, SaintLouis, MO)购得。优选地，检测溶液包含O. 01至O. I重量％，例如O. 01至O. 05重量%、0· 01至O. 04
重量％、0. 01至O. 03重量％或O. 01至O. 02重量％的表面活性剂。表面活性剂的适当浓度可基于具体的表面活性剂和其他条件(即溶剂浓度、pH、温度等)进行选择。如果其他反应条件保持不变，则增加表面活性剂的浓度通常会减少二聚化并因此导致荧光信号的增强。在一些实施例中，可以调整表面活性剂浓度(例如逐步增加同时保持其他条件不变)直至达到不含叶绿醇的叶绿素衍生物不再二聚化的浓度，但在此浓度下叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物仍处于二聚化状态。表面活性剂的这一浓度可随后用于检测步骤。检测步骤可以在任何合适的温度下进行。然而，如果其他反应条件保持不变，则升高温度通常会减少二聚化并因此减少荧光信号的猝灭。因此，可将反应温度选择为使得在所用其他条件(例如溶剂和表面活性剂浓度、PH等)下叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物比不含叶绿醇的叶绿素衍生物优先二聚化。在特定实施例中，检测步骤可以在10至50°C、15至40°C、15至30°C或优选地在室温(例如20至25°C)下进行。检测步骤可以在任何pH下进行。优选地，检测步骤以碱性pH (即大于7的pH，优选8. O或以上、9. O或以上、10. O或以上或者11. O或以上)进行。所需pH可通过向检测溶液添加适量的碱(例如氢氧化钠)而实现。在一个实施例中，检测溶液不含脂质体。有利的是，本发明的检测方法无需脂质体来增强不含叶绿醇的叶绿素衍生物发出的荧光就可以执行。定量样品中不含叶绿醇的叶绿素衍牛物的水平由于叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物发出的荧光在检测步骤中被猝灭，因此荧光强度值可被视为等于样品中不含叶绿醇的叶绿素衍生物的特定水平或浓度。通常，通过添加已知浓度的不含叶绿醇的叶绿素衍生物(例如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸或焦脱镁叶绿酸)并获得荧光值而生成标准(校准)曲线。随后可以将包含未知量的不含叶绿醇的叶绿素衍生物的样品荧光值与标准曲线进行比较，以提供样品中不含叶绿醇的叶绿素衍生物的浓度值。检测分析方法在本发明的一个方面，上述检测方法可用于定量样品中酶活性的检测分析方法。具体地讲，该方法可通过监测不含叶绿醇的叶绿素衍生物的产生情况，用于测量叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物的酶水解。
任何能够水解叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物的酶都可以用此方法进行测定。通常“水解叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物”是指水解叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物中的酯键，例如从叶绿素或叶绿素衍生物中的二氢卟吩环上裂解叶绿醇基团。因此该酶通常具有酯酶或水解酶活性。酶可为(例如)叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶。通常，该检测分析方法包括使样品与叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物接触的步骤。因而，可将样品与期望检测酶活性的底物接触。例如，在具体的实施例中，可让样品与以下底物接触叶绿素(以便检测叶绿素酶活性)、脱镁叶绿素(以便检测脱镁叶绿素酶活性)或焦脱镁叶绿素(以便检测焦脱镁叶绿素酶活性)。该方法还可以通过添加一种以上的底物用于检测上述活性的任何组合。接触步骤可以通过在反应溶液中用叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物温育样品而进行。所谓“反应溶液”是指允许样品中的酶作用于底物的任何溶液，即在检测步骤之前。可以将样品直接加到反应溶液和底物中，随后温育酶活性发生的预定时间段。
接触步骤可以在酶具有水解活性的任何条件下进行。叶绿素酶和相关酶具有活性的条件在(例如)Khamessan et al. (1994), Journal of Chemical Technology&Biotechnology, 60 (I), pages 73-81 (Khamessan等人，1994年，《化工技术和生物技术杂志》，第60 卷第 I 期，第 73-81 页)；Khamessan et al. (1996), Journal of Biotechnology, 45 (3)pages 253-264 (Khamessan等人，1996年，《生物技术杂志》，第45卷第3期，第253-264页)；Klein and Vishniac (1961), J. Biol. Chem. 236:2544-2547 (Klein 和 Vishniac，1961年，《生物化学杂志》，第 236 卷，第 2544-2547 页)；McFeeters et al. , Plant Physiology47:609-618(1971) (McFeeters等人，《植物生理学》，第47卷，第609-618页，1971年)；以及 McFeeters et al. , Plant Physiology 55:377-381 (1975) (McFeeters 等人，《植物生理学》，第55卷，第377-381页，1975年)中结合已知的检测分析方法进行了描述。优选地，反应溶液包含表面活性剂、溶剂和/或缓冲液。表面活性剂和溶剂有助于溶解溶液中的底物(例如叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素)。表面活性剂可为上文关于检测溶液描述的任何表面活性剂，例如聚氧乙烯表面活性剂，诸如Triton X-100。然而，反应溶液通常包含比检测溶液中所存在的更高浓度的表面活性剂。例如，反应溶液可包含0. 05至0. 5重量％、0. I至0. 5重量％或0. I至0. 3重量％的表面活性剂。反应溶液可包含有机溶剂，诸如丙酮、乙醇、丙醇、丁醇等。叶绿素酶在各种有机溶剂中的活性在(例如)Khamessan et al. (1995)Process Biochemistry 30 (2), pages159-168 (Khamessan等人，1995年，《过程生物化学》，第30卷第2期，第159-168页)中有所描述。优选地，反应溶液包含丙酮作为溶剂。在一些实施例中，反应溶液包含I至10重量％，例如3至7重量％或约5重量％的丙酮。反应溶液可以包含任何合适的缓冲液。可用的缓冲液包括(例如)磷酸盐或HEPES(4-2-羟乙基-I-哌嗪乙磺酸)缓冲液。优选地，反应溶液的pH范围为6. O至8. 0，例如6. 5至7. 5或约7，并且本领域技术人员可以很容易地选择适合所需pH的缓冲液。反应溶液可包含一种或多种另外的盐，诸如氯化钾。可将样品用底物和反应溶液温育适当的时间段，以便允许可检测量的产物的水解。典型的温育时间包括(例如)10秒至120分钟，例如I至60分钟、I至30分钟或5至20分钟。温育步骤可以在酶具有活性的任何温度下进行，例如于10至50°C、15至45°C、20至25°C或35至45°C，优选地约40°C。在接触步骤之后，通常在检测荧光信号前将酶活性终止。酶活性可以通过(例如)提高溶液的pH，优选地提高到至少pH 10或至少pH 11而终止。在一个实施例中，在温育步骤之后添加碱(例如氢氧化钠)以便终止酶反应。便利地，酶活性可以通过将反应溶液添加到上述检测溶液中而终止，例如其中所述检测溶液包含诸如氢氧化钠的碱。通常，将反应溶液按至少5倍、10倍、50倍或100倍稀释到检测溶液中。酶促反应之后，检测分析方法包括用上述方法检测不含叶绿醇的叶绿素衍生物产生情况的步骤。通常，测定检测溶液中不含叶绿醇的叶绿素衍生物的浓度。如此，便可确定每单位时间的底物水解速率(在接触步骤中)，其提供样品中酶活性的度量。一单位酶活性可以定义为例如采用本文所述的检测分析方法，在40°C下每分钟水解一微摩尔底物(例如叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素)的酶的量。由于底物和产物是等摩尔的，因此作为另外一种选择，一单位可以定义为在40°C下每分钟产生一微摩尔产物(例如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸或焦脱镁叶绿酸)的酶的量。
有利的是，如上所述，本发明的检测分析方法包括两个分立的步骤酶具有活性的反应步骤，以及酶无活性的检测步骤。由于反应和检测步骤分别进行，因此它们可以在不同的溶液中和不同的条件下进行。这允许优化每个步骤的条件。因此，在一个实施例中，酶在反应溶液中具有活性，但在检测溶液中无活性。例如，反应步骤可以采用酶具有活性的任何条件(例如pH 4至8)进行。相反，检测步骤可采用被优化为有利于叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物发生选择性二聚化，但酶无活性的条件(例如pH为10或更大)进行。试剂盒在另一个方面，本发明提供适用于执行如本文所述的方法或检测分析方法的试剂盒。此类试剂盒可包含本文所述用于这些方法的试剂，具体地讲为如本文所述的反应溶液、检测溶液和底物。每种组分可连同合适的包装和/或执行该方法的说明容纳在合适的小瓶或其他容器内。反应溶液通常为酶具有活性的任何溶液。反应溶液可包含表面活性剂、溶剂和缓冲液，或可以为任何上述与检测分析方法有关的其他反应溶液。优选地，底物包含叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物，诸如叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素。可在试剂盒中以单独的容器或以组合形式提供一、二或三种或更多种底物。例如，在一些实施例中，两种或更多种底物可存在于同一容器中，例如，如果需要测定两种或更多种酶活性。通常，底物以水溶液形式提供。在一些实施例中，反应溶液和底物可按单一溶液提供。试剂盒可以包含如本文所述的任何检测溶液。优选地，在检测溶液中叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物发出的荧光被猝灭，而不含叶绿醇的叶绿素衍生物发出的荧光不猝灭，例如选择检测溶液使得底物相比于酶水解产物优先二聚化。在一个实施例中，检测溶液包含表面活性剂、醇(例如异丙醇)和碱(例如氢氧化钠)。通常，酶在检测溶液中无活性。在一个优选的实施例中，试剂盒还包含例如用于构建检测分析方法中使用的标准(校准)曲线的一个或多个标准品。通常，此类标准品为各自包含已知浓度的产物(即不含叶绿醇的叶绿素衍生物)的容器形式。可提供一个、两个或更多个标准品，其包含不同的产物(例如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸或焦脱镁叶绿酸)和/或不同浓度的每种产物。
现在将结合以下非限制性实例进一步说明本发明。实M在这些实例中，开发了测量叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和焦脱镁叶绿素酶活性的检测分析方法。在该检测分析法的第一步中，制备了在缓冲液中由叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素组成的底物。将该底物加到酶溶液中，在40°C反应10分钟。经过10分钟的反应时间后，将一部分样品转移到检测缓冲液中。测量酶活性所依赖的原理是检测缓冲液中的叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素形成二聚体(参见图I)。二聚体的形成将猝灭叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素的荧光信号。配制检测缓冲液使得产生的脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸或焦脱镁叶绿酸不形成二聚体，并因而可通过荧光光谱法检测。实例I-开发焦脱镁叶绿素酶活性的检测分析 法配制IOOmM pH 7的磷酸盐缓冲液用作反应缓冲液，其含有50mMKCl、0. 2%TritonX-IOO和5. 17%丙酮。配制以下包含焦脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿酸或其混合物的溶液，然后将其加到反应缓冲液中I)焦脱镁叶绿素溶液500 μ I反应缓冲液+50 μ I水+30 μ I焦脱镁叶绿素(Img/ml的丙酮溶液)2)焦脱镁叶绿酸溶液500 μ I反应缓冲液+50 μ I水+15 μ I焦脱镁叶绿酸(2mg/ml的丙酮溶液)+15 μ I丙酮。3)焦脱镁叶绿素焦脱镁叶绿酸的I: I溶液500 μ I反应缓冲液+50 μ I水+15 μ I焦脱镁叶绿素(lmg/ml的丙酮溶液)+7. 5 μ I焦脱镁叶绿酸(2mg/ml的丙酮溶液)+7. 5 μ I丙酮。配制了包含不同浓度的Triton X-100 (表面活性剂)和乙醇或异丙醇(溶剂)的多种检测溶液(A-G)，如下表I和2所示。将10 μ I溶液1、2或3加到1000 μ I的各检测溶液A-G中，在Whirley混合机上混合，然后取200 μ I转移到黑色微孔板。混合后10分钟，在室温测量了荧光信号(激发波长410nm，发射波长670nm)。对测量值进行了分析，以便确定底物(叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素)发出的荧光被猝灭但反应产物(脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸或焦脱镁叶绿酸)发出的荧光未被猝灭并能通过荧光检测而测量的条件。最初，测试了作为检测溶液的乙醇、Triton X-100与50mM NaOH的组合。结果在下表I中显示表I
权利要求
1.ー种检测样品中不含叶绿醇的叶绿素衍生物的方法，包括检测与所述不含叶绿醇的叶绿素衍生物相关的荧光信号的步骤，其中所述样品中与叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物相关的荧光信号被猝灭。
2.根据权利要求I所述的方法，其中与叶绿素或所述含叶绿醇的叶绿素衍生物相关的所述荧光信号通过叶绿素或所述含叶绿醇的叶绿素衍生物的ニ聚化而粹灭。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中叶绿素或所述含叶绿醇的叶绿素衍生物与所述不含叶绿醇的叶绿素衍生物相比优先ニ聚化。
4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述不含叶绿醇的叶绿素衍生物包括脱镁叶绿酸或焦脱镁叶绿酸，和/或所述含叶绿醇的叶绿素衍生物包括脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素。
5.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中在包含表面活性剤、醇和/或碱的检测溶液中执行所述检测步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述醇包括异丙醇或こ醇。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述检测溶液包含12至20重量％的醇。
8.根据权利要求5至7任一项所述的方法，其中所述表面活性剂包括4-(1，I,3，3-四甲基丁基)苯基-聚こニ醇。
9.根据权利要求5至8任一项所述的方法，其中所述检测溶液包含O.01至O. 03重量％的表面活性剤。
10.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述检测步骤在20至25°C进行。
11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述检测步骤在大于10.0的pH值进行。
12.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中检测约670nm波长的荧光信号。
13.一种对样品中的酶活性进行定量的检测分析方法，其中所述酶能够水解叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物，所述检测分析方法包括 a)将所述样品与叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物接触；以及 b)通过前述任一项权利要求所述的方法检测不含叶绿醇的叶绿素衍生物的产生情况。
14.根据权利要求13所述的检测分析方法，其中步骤(a)包括将所述样品与叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物在含表面活性剤、丙酮和/或缓冲液的反应溶液中进行温育。
15.根据权利要求13或14所述的检测分析方法，包括在步骤(a)之后并在步骤(b)之前通过将所述反应溶液加到如权利要求5至9任ー项所定义的检测溶液中而终止酶活性。
16.一种对样品中的酶活性进行定量的试剂盒，其中所述酶能够水解叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物，所述试剂盒包括 a)反应溶液，所述酶在其中具有活性； b)底物，所述底物包括叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物；以及 c)检测溶液，所述底物在其中与由所述酶产生的不含叶绿醇的叶绿素衍生物相比优先ニ聚化。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述反应溶液包含表面活性剤、丙酮和缓冲液。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的试剂盒，其中所述底物包括脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素。
19.根据权利要求16至18任一项所述的试剂盒，其中所述检测溶液如权利要求5至9中任ー项所定义。
20.根据权利要求16至19任一项所述的试剂盒，其中所述酶在所述检测溶液中无活性。
21.根据权利要求16至20任一项所述的试剂盒，还包括一种或多种标准溶液，每ー种包含已知浓度的所述不含叶绿醇的叶绿素衍生物。
22.根据权利要求I至12任一项所述的方法，其中叶绿素或所述含叶绿醇的叶绿素衍生物以ニ聚体和/或其他非胶态多聚体的水溶液形式存在。
23.根据权利要求I至12和22任一项所述的方法，其中所述检测步骤在不存在脂质体的情况下进行。
24.根据权利要求5至12任一项所述的方法，其中所述表面活性剂包括4-(1, 1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚こニ醇，所述醇包括异丙醇以及所述碱包括氢氧化钠。
25.根据权利要求13至15任一项所述的检测分析方法，其中所述酶在步骤(a)中具有活性，而所述酶在步骤(b)中无活性。
全文摘要
本发明提供检测样品中不含叶绿醇的叶绿素衍生物的方法，所述方法包括检测与所述不含叶绿醇的叶绿素衍生物相关的荧光信号，其中所述样品中与叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物相关的荧光信号被猝灭。所述方法可用于对样品中的叶绿素酶和相关酶的活性进行定量，而不用对底物和产物进行溶剂分提。
文档编号C12Q1/44GK102858994SQ201180018072
公开日2013年1月2日 申请日期2011年4月6日 优先权日2010年4月8日
发明者R.米克尔森, T.约根森, J.B.索厄 申请人:杜邦营养生物科学有限公司