辅酶Q₁₀的美白、祛斑功能及其在化妆品中的用途的制作方法

专利名称：辅酶Q₁₀的美白、祛斑功能及其在化妆品中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及美容和化妆品领域，特别是涉及包含辅酶Qltl的美容学和/或皮肤病学组合物，以及辅酶Qltl作为皮肤的美白、祛斑功能的功效添加剂的用途。本发明还提供了用于降低皮肤异常色素沉着的药品添加剂。本发明还涉及细胞生物学领域，尤其是利用黑色素细胞进行美白实验的领域。
背景技术：
辅酶Qltl (CoQltl)又名泛醌10，是一种脂溶性醌，其结构类似于维生素K，因其母核六位上的侧链——聚异戊烯基的聚合度为10而得名，是一种醌环类化合物。CoQltl广泛被熟悉的功能如下:(1)细胞线粒体电子传递链的递氢体，在能量转化过程中具有重要作用，而线粒体是细胞的“能量工厂” (Brandt U 和 Okun JG.，Biochemistry 1997 ；36:11234-11240 ；Okun JG, Lummen P 和 Brandt U.，J Biol Chem.1999 ；274:2625-2630.) ； (2)脂溶性抗氧化剂，保护细胞膜和重要的细胞器，减少氧化应激损伤。该物质在动植物、微生物细胞内广泛存在。人体辅酶Qltl的含量主要取决于食物补充和体内合成。据报道，体内辅酶Qltl含量随年龄增长而下降，20岁时达到高峰，77岁的老人比20岁年轻人心肌中的辅酶Qltl减少了58%。近年来，CoQltl在医学上广泛用于心血管系统疾病，在营养保健品及食品中广泛被添加其中。随着护肤品功效物质的大量需求，人们对CoQltl在皮肤生物学方面的功能也进行了大量的研究。目前已经报道的相关CoQltl功能有抗氧化，抗衰老以及抗炎症反应。CoQ1q、维生素E和抗坏血酸(维生素C)是目前被发现皮肤中存在的抗氧化剂(Y.Shindo,E.Witt,D.Han, ff.Epstein 和 L.Packer, Journal of Investigative Dermatology 1994 ; 102:122-124.)。已经证明，CoQltl能够有效地降低UVA介导的人角质细胞氧应激，其作用机制是通过巯基的耗竭，特定磷酸激酶的激活和预防DNA的氧化损伤(U.Hoppe, J.Bergemann,W.和 Diembeck，J.等，BioFactors.1999 ；9:371-378.)。而且，CoQltl 可以通过抑制成纤维细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的产生而减少脸部皱纹的形成(Inui, M.，Ooe, M.和 Fujii, K.等，Biofactors.2008 ；32:237-243.);能够增加人真皮层的成纤维细胞数量，促进基底膜IV和νπ型胶原的表达，以及减少眼部皱纹的深度(Muta-Takada K, Terada T 和 Yamanishi H 等，Biofactors.2009 ;35 (5):435-41.)。这些研究表明，CoQltl具有抗皮肤老化的生物学功能。另外，CoQltl又被报道能够降低由UVR和IL-1介导的炎症因子IL-6和PGE-2的产生，指出了可能具有抗炎反应的作用(Fuller，B.，Smith, D.和 Howerton, A.等，J.Cosmet.Dermatol.2006 ；5:30-38.)。
尽管CoQltl已作为化妆品的功效添加剂用于改善皮肤的各种功能，但是CoQltl是否能够直接抑制黑色素合成的美白作用目前仍未被指出。众所周知，黑色素沉着是皮肤颜色和着色的主要原因。黑色素是由位于表皮与真皮之间的黑色素细胞产生并存在于其内的黑色素生成颗粒(黑素体)中，生成的黑色素通过渗透作用向相邻上皮细胞扩散。该黑色素细胞内黑色素生成的生化反应推测如下述那样发生。黑色素的生成过程:作为必需氨基酸的酪氨酸(tyrosine)在酪氨酸酶(tyrosinase)的作用下形成多巴醌,其在酶或者非酶的氧化作用下，经红色色素和无色色素变化为黑色的黑色素。其中酪氨酸酶是黑色素合成中的限速酶，也是人们研发抑制黑色素生成的主要作用靶点。一直以来期待开发出具有安全性或减少皮肤刺激的美白剂。而作为体内存在的抗氧化剂，CoQltl在黑色素合成过程中发挥的作用还不清楚。因此，本发明的目的是提供一种美容学和/或皮肤病学组合物，用于淡化皮肤生成的色素沉着，并且安全可靠。

发明内容
本发明人为了达到上述目的进行了深入研究，意外地发现CoQltl在黑色素合成过程中的新功能。本发明通过一系列实验证明CoQltl具有抑制黑色素细胞黑色素合成及酪氨酸酶活性的作用，显示出对色素沉着的淡化有着优异的效果。将CoQltl添加入化妆品中可使化妆品具有美白、祛斑功效，也能够作为降低皮肤异常色素沉着的药品添加剂。色斑是面部容易看到的黑色素沉着的代表，在临床上它是一种色素沉着性皮肤病。常见的色素沉着性皮肤病如雀斑(遗传性)、黄褐斑(内分泌性)、晒斑(炎症性)、瑞尔黑变病(代谢性)等。因其影响美观，越来越多的患者迫切要求治疗，因而产生大量的美白祛斑产品，其中以安全，刺激性小，副作用小的产品倍受欢迎。而CoQltl是一种体内正常存在的、天然的物质，其美白功能的发现将会带来广泛的市场应用前景。目前在筛选美白祛斑剂中通常采用一些客观的、经典的方法，即在细胞水平检测黑素细胞增殖率、黑色素含量、酪氨酸酶活性、及通过显微镜观察黑素细胞型态等(张建友，方艳燕，吴晓琴，张英；精细化工，2008，25 (I)，72-76)。在细胞选择上通常采用小鼠B16细胞株，B16细胞的黑色素合成功能与人正常的皮肤黑色素细胞基本一致，在人体原代皮肤黑色素细胞培养非常困难的情况下，国内外化妆品生产企业的科研部门在筛选美白剂的过程中，广泛采用该细胞株 作为美白化学物功效测定的受试细胞。黑色素含量测定是美白化学物功能评价的最重要检测指标。到目前为止，一直采用生物化学-分光光度法测定黑素细胞中的黑色素含量，此方法经典稳定。从国外文献来看，评价美白化妆品的功效主要以检测施加美白化妆品有效成分后，是否抑制酪氨酸酶活性为主要手段，而酪氨酸酶活性检测方法有放射性同位素法、免疫学法和生化酶学法，其中以生化酶学法较为简单成熟。酶的材料来源可以从蘑菇中得到的酪氨酸酶，也可以从B16黑色瘤细胞或动物皮肤中得到。细胞毒性的测定通常采用MTT方法，由于MTT方法在细胞操作中的繁琐性，经技术改进后，目前经常使用CCK-8检测试剂盒进行细胞增殖和毒性的测定。本发明就是采用上述常用和经典的方法进行CoQltl美白祛斑功效的评估。在本发明中，通过如下步骤测定表明CoQltl是否具有抑制黑色素细胞黑色素合成及酪氨酸酶活性的作用:1.CoQ1。用乙醇或DMSO溶解。2.研究采用的细胞选用小鼠黑色素瘤细胞株B16。3.B16黑色素细胞用低血清培养基(1%、2%、3%或5%特优胎牛血清(Hyclone，Australia)的DMEM(Gibco，USA)培养基)，调整细胞浓度为4-10X IO4/孔，接种于24孔细胞培养板中，在37°C、5%二氧化碳培养箱中培养24h后加入步骤I所述的CoQltl溶液，CoQltl终浓度为0.5 μ M、I μ M或2 μ M。4.步骤3所述细胞在终浓度为0.5μΜ、1μΜ或2μΜ CoQltl的低血清培养基中、37°C、5% 二氧化碳培养箱中培养72h后，再用CCK-8试剂盒(Dojindo Laboratorise,Japan)检测每孔细胞数量，进行细胞毒性检测。5.步骤3所述细胞在终浓度为0.5μΜ、1μΜ或2yMCoQ1(l的低血清培养基中、37°C、5%二氧化碳培养箱中培养72h后，再用BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，中国)检测每孔细胞的总蛋白含量。6.用步骤4所述细胞进行黑色素含量检测:
除去培养液，PBS冲洗后用0.25%的胰酶消化细胞，250 μ L/孔，细胞脱壁后加入250 μ L/孔的添加10%特优胎牛血清的DMEM培养基终止消化。 混匀细胞，转移至1.5mL离心管中，13，800g离心lOmin。完全去除上清液，开盖倒置离心管，室温放置2h左右直至培养基完全干燥。 加入 150 μ L/ 孔的 IN NaOH，85°C金属浴 15min。 冷却至室温后，混匀，转移至96孔板中，酶标仪检测，吸收波长为405nm。7.用步骤3处理后的细胞进行酪氨酸酶活性检测: 用PBS洗细胞，之后加入I % triton, 200 μ L/孔，室温处理20min。.1% triton处理细胞后，将细胞裂解液转移至96孔板中，IOOyL/孔。加入100 μ L 0.1% DOPA/ 孑L。.96孔板放入酶标仪中，490nm检测波长，30min检测一次，检测3h。8.步骤2所述细胞在终浓度为0.5μΜ、1μΜ或2μΜ CoQ10的低血清培养基中培养72h后进行DOPA染色 去除培养基，用PBS洗细胞，500 μ LX 3遍。 每孔加入500 μ L 10%甲醛溶液固定细胞5-10分钟。 去除甲醛溶液，用PBS洗细胞，ImLX 3遍，每孔加入500 μ L 0.1% DOPA溶液，37°C孵育4-5小时。中间可更换DOPA溶液1_2次。 用PBS洗细胞，ImLX3遍。用倒置显微镜拍照保存。因此，本发明的目标在于用于局部应用的组合物，其在美容学和/或皮肤病学上可接受的介质中包含辅酶Q1(l。所述辅酶Qltl以游离的形式或者以美容学和/或皮肤病学上可接受的形式存在，所述美容学和/或皮肤病学上可接受的形式如近年来开发出的各种水溶性辅酶Qltl,包括但不限于通过脂质体技术，包合技术，自乳化技术，纳米粒技术，固体分散技术，微乳技术等产生的水溶性辅酶Q1(1。并且其存在量使得它具有使皮肤美白、祛斑的活性和降低皮肤异常色素沉着的活性。根据本发明，所述组合物可以以适合于局部使用的任何形式存在，尤其是以水包油的简单乳剂或者水包油包水或油包水包油的多重乳剂、凝胶剂、溶液、软膏的形式或者以小球的分散体的形式存在。这些组合物根据美容学领域中的常用方法来进行制备。作为辅助剂的例子，可以尤其提及表面活性剂、胶凝剂、防腐剂、香料、填充剂、着色剂、增稠剂、乳化剂、湿润剂、香料、染料、色素和其他活性物质。
本发明的目标还在于根据本发明的组合物用于保护皮肤以对抗与黑色素增加相关的症状的用途。本发明的目标还在于根据本发明的组合物用于使皮肤增加美白、祛斑和/或降低皮肤异常色素沉着的用途。本发明还涉及皮肤的美容处理方法，其特征在于，所述方法在于在皮肤上应用根据本发明的组合物；和辅酶Qltl在美容学和/或皮肤病学组合物中作为皮肤增加美白、祛斑的功效添加剂和降低皮肤异常色素沉着的药品添加剂的用途。下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。


图1.显示CoQltl对B16细胞黑色素合成、酪氨酸酶活性及DOPA染色的影响。B16细胞用不同浓度的CoQltl(0.5μΜ、1μΜ*2μΜ)及阳性对照维生素C的钠盐(0.5mM)处理72h。(a)CCK-8检测相对细胞数量，即细胞毒性检测。(b)酶标仪检测黑色素含量，结果用细胞数量测定的酶标仪吸光光度值进行校正。(c)细胞裂解后加入D0PA，酪氨酸酶可将DOPA氧化为褐色的物质，用酶标仪进行检测，结果用细胞总蛋白量进行校正。(d)细胞固定后用DOPA进行染色，倒置显微镜观察并拍照，比例尺:100μπι。结果以溶剂处理组为对照，以平均值+SD表示。与对照相比，*ρ < 0.05广P < 0.01。 实施例实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1.黑色素检测Β16黑色素细胞用低血清培养基调整细胞浓度为4 X IO4/孔，接种于24孔板中。过夜培养后换用加入不同浓度(:001(|(0.5111、1111或2111)的低血清培养基。以最高CoQltl浓度时的乙醇含量为标准，各孔间补足乙醇的量，即各孔间乙醇含量相同，只有CoQltl浓度不同。CoQltl作用72h后，除去培养液，用PBS洗一次，加入200yL含10% CCK-8检测试剂的低血清培养基，37°C，5% 二氧化碳培养箱孵育50min左右，再将孵育后的培养液转入96孔板中检测，检测波长450nm。CCK-8检测结果表明，三个浓度CoQltl处理组对细胞数量均无影响，即无细胞毒性；而作为对照的维生素C钠盐(Vc-Na)，虽然是公认的美白剂，但在其发挥作用的浓度下对细胞具有一定毒性。结果参见附图1(a)。进行CCK-8检测后的细胞，用PBS冲洗，再加PBS孵育细胞Ih左右，以完全溶出CCK-8检测试剂，再进行黑色素检测。检测方法如下: 用0.25 %的胰酶消化细胞，200 μ L/孔，细胞脱壁后加入300 μ L/孔的添加10 %特优胎牛血清的DMEM培养基终止消化。 混匀细胞，转移至1.5mL离心管中，13800g离心lOmin。完全去除上清液，开盖倒置离心管，放置2h左右直至培养基完全干燥。 加入 150 μ L/ 孔的 IN NaOH，85°C金属浴 15min。
冷却至室温后，混匀，转移至96孔板中，酶标仪检测，吸收波长为405nm。检测得到的黑色素含量用CCK-8检测的结果进行校正，得到单位数量细胞中黑色素含量。结果显示加入CoQltl后，黑色素合成下降，且与CoQltl浓度呈剂量依赖关系。结果参见附图1(b)。实施例2.酪氨酸酶活性检测B16黑色素细胞用低血清培养基调整细胞浓度为4X104/孔，接种于24孔板中。37°C、5%二氧化碳培养箱过夜培养后换用加入不同浓度CoQltl的低血清培养基。以最高CoQltl浓度时的乙醇含量为标准，各孔间补足乙醇的量，即各孔间乙醇含量相同，只有CoQltl浓度不同。酪氨酸酶检测方法如下: 用PBS洗细胞，之后加入I % triton, 120 μ L/孔，室温处理20min。.I % triton处理细胞后，将细胞裂解液转移至96孔板中，80 μ L/孔，即每24孔板处理孔对应2个96孔板的孔。加入80 μ L 0.1% DOPA/孔。.96孔板放入酶标仪中，490nm检测波长，30min检测一次，检测3h。用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测酪氨酸酶剩余的细胞裂解液中总蛋白的含量，每孔需20 μ L裂解液。酪氨酸酶活性检测结果用总蛋白含量进行校正，得到单位细胞数量中酪氨酸酶活性。结果显示加入CoQltl后，酪氨酸酶活性合成下降，且与CoQltl浓度呈剂量依赖关系，参见附图1(c)。实施例3.DOPA染色将实施例1中所述的Β16黑色素细胞加入不同浓度CoQltl (0.5 μ Μ，I μ Μ，2 μ Μ)的低血清培养基、在37°C、5%二氧化碳培养箱中培养72h后进行如下步骤: 去除培养基，用PBS洗细胞，500 μ LX 3遍。 每孔加入500 μ L 10%甲醛溶液固定细胞5-10分钟。 去除甲醛溶液，用PBS洗细胞，ImLX 3遍，每孔加入500 μ L 0.1% DOPA溶液，37°C孵育4-5小时。中间可更换DOPA溶液1_2次。 用PBS洗细胞，ImLX3遍。用 倒置显微镜拍照保存。DOPA染色结果显示，与未加CoQltl的对照相比，CoQltl处理组(0.5 μ M、I μ M或2 μ M)部分Β16细胞中黑色素的含量明显降低，细胞如被漂白了一样；而且随着CoQltl处理浓度的增加，大多数细胞中的黑色逐渐变淡，具有剂量依赖性。结果参见图1(d)。
权利要求
1.关于局部应用的组合物，其在美容学和/或皮肤病学上可接受的介质中包含辅酶Q10,所述辅酶Qltl以游离的形式或者以美容学和/或皮肤病学上可接受的形式存在，并且其存在量使得它具有使皮肤美白、祛斑的活性和降低皮肤异常色素沉着的活性。
2.根据权利要求1的组合物，所述美容学和/或皮肤病学上可接受的形式是水溶性辅酶Qltl,包括但不限于通过脂质体技术，包合技术，自乳化技术，纳米粒技术，固体分散技术，微乳技术产生的水溶性辅酶Qltl。
3.根据前述权利要 求中任一项的组合物，其特征在于，它以乳剂、凝胶剂、溶液、软膏的形式或者以小球的分散体的形式存在。
4.根据前述权利要求中任一项的组合物，其特征在于，它还包含亲水性或亲脂性的辅助剂。
5.根据权利要求4的组合物，其特征在于，所述辅助剂选自胶凝剂、防腐剂、香料、填充剂、着色剂、增稠剂、乳化剂、湿润剂、香料、染料、色素和其他活性物质。
6.根据前述权利要求中任一项的组合物用于保护皮肤以对抗与黑色素增加相关的症状的用途。
7.根据前述权利要求中任一项的组合物用于使皮肤增加美白、祛斑和/或降低皮肤异常色素沉着的用途。
8.肤的美容处理方法，其特征在于，所述方法在于在皮肤上应用根据权利要求1至5中任一项的组合物。
9.酶Qltl在美容学和/或皮肤病学组合物中作为皮肤增加美白、祛斑的功效添加剂或降低皮肤异常色素沉着的药品添加剂的用途。
全文摘要
本发明提供了辅酶Q10的美白、祛斑功能及其在化妆品中的用途。本发明实验证实了CoQ10能够抑制B16细胞黑色素的合成，以及抑制酪氨酸酶的活性。因此，CoQ10除了可以作为抗氧化和抗衰老剂添加到化妆品中，也可作为美白成分应用于化妆品中(包括美白爽肤水、面霜、面膜等)，或作为药品用于治疗色素过度沉着异常。
文档编号A61Q19/02GK103083198SQ20111034457
公开日2013年5月8日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者赵仁滨, 张美姿, 党磊 申请人:北京天辰空间生物医药研发有限公司