专利名称：静电纺丝制备纳米纤维酶膜的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于纳米材料制备技术和生物合成技术领域，具体涉及一种静电纺丝制备纳米纤维酶膜的方法及其应用。
背景技术：
茶氨酸是一种非蛋白质氨基酸，在生物体内发挥重要的生理、生化功能外，还具有很好的保健功能和药理作用，具有抗肿瘤、抗癌功效，还能够有效预防脑栓塞、脑中风、脑缺血以及老年痴呆疾病等，因此有广泛的应用前景。由于茶氨酸的自然资源有限，所以茶氨酸的合成与制备一直是国内外学者的研究热点。在国外，目前茶氨酸主要以酶法转化工业化生产，而国内，除了有化学合成的制品外，天然茶叶中提取的产品，纯度不高于40%，所以高纯度生物制品主要依赖进口。日本已利用固定化微生物细胞技术酶法工业化大量合成茶氨酸，通过κ-卡拉胶固定假单胞菌，利用谷氨酰胺酶催化合成茶氨酸，但是转化效率低，所以仍存在如何进一步提高催化效率、降低成本等问题。因此，选择先进的细胞固定化技术提高催化效率，是实现茶氨酸高效合成的研究关键。由于用静电纺丝的方法制备纳米纤维具有多孔性和连通性等诸多优势，在纳米纤维制备领域备受青睐。目前，由于纳米纤维在催化、生物医学、药学等方面的广泛用途，其越来越被人们关注。这些应用不仅取决于静电纺丝技术的一些参数设计，更加取决于用静电纺丝技术制备的纳米纤维作为载体所固定化的物质。已经报道的用静电纺丝的方法制备纳米纤维固定化脂肪酶的方法，主要通过共纺的方法将酶固定在聚合物载体上，来提高酶的回收率重复利用率。目前未见有报道关于用静电纺丝的方法制备的纳米纤维固定化谷氨酰胺合成酶方面的研究。
发明内容
本发明目的在于提供一种静电纺丝制备纳米纤维酶膜的方法及其应用。本发明提出的静电纺丝制备纳米纤维酶膜的方法，具体步骤如下
(1)称取聚乙烯醇(PVA)溶解于去离子水中，控制PVA浓度为5-12%(w/v，g/ml), 80°C下搅拌1-4小时至完全溶解，冷却至室温，加入谷氨酰胺合成酶(GQ水溶液，得到GS/ PVA混合纺丝液，室温搅拌，谷氨酰胺合成酶水溶液与聚乙烯醇溶液的体积比为1:9-1 1 ；
(2)将步骤(1)所得的振荡均勻的溶液分别加入注射器内，装上直径0.6-1. 2mm针头， 调整针头到接收器的距离为5-20cm，调节电压在10-23kv，纺丝溶液流速控制在0. 2_6ml/ h，纺丝l_8h，将制备的薄膜放入真空干燥箱，4°C真空干燥12小时以上，即得所需产品。本发明中，步骤(1)中所述搅拌时间为25-35分钟。本发明提出的纳米纤维酶膜用于生物催化合成茶氨酸，具体步骤如下
将纳米纤维酶膜(l-5g)加入到含有10-50 mmol L—1谷氨酸钠，5_15 mmol L—1盐酸乙胺，10-50 mmol I71 氯化镁，10-50 mmol Γ1 2-巯基乙醇和5-20 mmol Γ1 ATP二钠盐的 100mrnolL-1 Tris-HCl缓冲溶液中，在水浴中50_150rpm振荡反应10_60min ；然后在 10000rpm，4°C下离心8-12min，除去沉淀，收集上清液，即得所需产品。本发明中，Tris-HCl缓冲溶液的pH值为6-9。本发明优点在于
1. 本发明实现了利用静电纺丝技术制备谷氨酰胺合成酶膜纳米纤维生物催化合成茶氨酸的方法，为静电纺丝技术提供了新的应用领域。2.本发明采用的聚合物是最终能够降解，对环境污染小，是一种环保的工艺。3.本发明的工艺简单，整个制备系统容易构建，操作简便，条件易控，成本低廉， 产物的生态学特征容易调控，且可以回收方便，可以重复利用，适合于大规模工业生产。4.本发明制备的酶膜纳米纤维具有较好的生物相容性，在生物催化，组织工程有较为广阔的发展前景和应用空间。
图1为实施例1的GS/PVA静电纺丝纳米纤维的扫描电镜图。图2为实施例3温度对固定化酶活性的影响。图3为实施例4的pH对固定化酶活性的影响。图4为实施例5催化反应时间对固定化酶活性的影响。
具体实施例方式下面通过实施例进一步描述本发明。实施例1
(1)称取聚乙烯醇(PVA)溶解于去离子水中，控制PVA浓度为8% (w/v，g/ml)，80°C 下搅拌2小时至完全溶解，冷却至室温，加入谷氨酰胺合成酶(GQ水溶液，得到GS/PVA混合纺丝液，室温搅拌30分钟。(2)将振荡均勻的溶液分别加入注射器内，装上直径0.9 mm针头，调整针头到接收器的距离为12cm，调节电压在21kv，纺丝溶液流速控制在0. 5ml/h，纺丝4 h，得到谷氨酰胺合成酶膜纳米纤维(见图1)，将制备的薄膜放入真空干燥箱，4°C真空干燥过夜。(3)将上述制备的纳米纤维加入到含有25 mmol厂1谷氨酸钠，10 mmol L—1盐酸乙胺，25讓ol L4氯化镁，25讓ol Γ1 2-巯基乙醇和10讓ol Γ1 ATP 二钠盐的100 mmolL"1 Tris-HCl (pH 7. 5)缓冲溶液中，在30°C水浴中IOOrpm振荡反应20min ；然后在IOOOOrpm, 4°C下离心lOmin，除去沉淀，收集上清液。实施例2
(1)称取聚乙烯醇(PVA)溶解于去离子水中，控制PVA浓度为8% (w/v，g/ml)，80°C 下搅拌2小时至完全溶解，冷却至室温，加入谷氨酰胺合成酶(GQ水溶液，得到GS/PVA混合纺丝液(GS:PVA体积比为3:7)，室温搅拌30分钟。(2)将振荡均勻的溶液分别加入注射器内，装上直径0.9 mm针头，调整针头到接收器的距离为12cm，调节电压在21kv，纺丝溶液流速控制在0. 5ml/h，纺丝4 h，将制备的薄膜放入真空干燥箱，4 °C真空干燥过夜。(3)将上述制备的纳米纤维加入到含有25 mmol厂1谷氨酸钠，10 mmol L—1盐酸乙胺，25讓ol L4氯化镁，25讓ol Γ1 2-巯基乙醇和10讓ol Γ1 ATP 二钠盐的100 mmolL-1 Tris-HCl (pH 7. 5)缓冲溶液中，在30°C水浴中IOOrpm振荡反应20min ；然后在IOOOOrpm, 4°C下离心lOmin，除去沉淀，收集上清液，得到茶氨酸。实施例3
将实施例2中制备的纳米纤维加入到含有25 mmol L—1谷氨酸钠，10 mmol L—1盐酸乙胺，25匪ol L4氯化镁，25匪ol Γ1 2-巯基乙醇和10匪ol Γ1 ATP 二钠盐的100 mrnolL"1 Tris-HCKpH 7.5)缓冲溶液中，在水浴中IOOrpm振荡反应20min ；然后在 10000rpm，4°C下离心lOmin，除去沉淀，收集上清液；得到茶氨酸，通过实验显示最适反应温度为30°C (见图2)。实施例4
将实施例2中制备的纳米纤维加入到含有25 mmol L—1谷氨酸钠，10 mmol L—1盐酸乙胺，25讓ol L4氯化镁，25讓ol Γ1 2-巯基乙醇和10讓ol Γ1 ATP 二钠盐的100 mmolL"1 Tris-HCKpH 6-9)缓冲溶液中，在30°C水浴中IOOrpm振荡反应20min ；然后在lOOOOrpm， 4°C下离心lOmin，除去沉淀，收集上清液；得到茶氨酸，通过实验显示最适pH为7. 5 (见图 3)。实施例5
将实施例2中制备的纳米纤维加入到含有25 mmol L—1谷氨酸钠，10 mmol L—1盐酸乙胺，25讓ol L4氯化镁，25讓ol Γ1 2-巯基乙醇和10讓ol Γ1 ATP 二钠盐的100 mmolL"1 Tris-HCKpH 7. 5)缓冲溶液中，在30°C水浴中IOOrpm振荡反应30-120 min;然后在 lOOOOrpm，4°C下离心lOmin，除去沉淀，收集上清液，得到茶氨酸；通过实验显示最适pH为 7. 5 ；通过实验显示最适反应时间60 min (见图4)。
权利要求
1.一种静电纺丝制备抗菌纳米纤维酶膜的方法，其特征在于具体步骤如下(1)称取聚乙烯醇溶解于去离子水中，控制PVA浓度为5-12%，80°C下搅拌1_4小时至完全溶解，冷却至室温，加入谷氨酰胺合成酶水溶液，得到GS/PVA混合纺丝液，室温搅拌30 分钟，谷氨酰胺合成酶水溶液与聚乙烯醇溶液的体积比为1:9-1:1 ；(2)将振荡均勻的溶液分别加入注射器内，装上直径0.6-1.2mm针头，调整针头到接收器的距离为5-20cm，调节电压在10-23kv，纺丝溶液流速控制在0. 2_6ml/h，纺丝l_8h，将制备的薄膜放入真空干燥箱，4°C真空干燥12小时以上，即得所需产品。
2.根据权利要求1所述的静电纺丝制备抗菌纳米纤维酶膜的方法，其特征在于步骤 (1)中所述搅拌时间为25-35分钟。
3.—种如权利要求1所述的纳米纤维酶膜用于生物催化合成茶氨酸的应用，其特征在于具体步骤如下(1)将纳米纤维酶膜l_5g加入到含有10-50mmol L—1谷氨酸钠，5_15 mmol L-1盐酸乙胺，10-50匪ol L4氯化镁，10-50匪ol Γ1 2-巯基乙醇和5-20匪ol Γ1 ATP 二钠盐的 100 mmoir1 Tris-HCl缓冲溶液中，在洸_34°C水浴中50_150rpm振荡反应30_120min ；(2)然后在10000rpm，4°C下离心8-12min，除去沉淀，收集上清液，即得所需产品。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于Tris-HCl缓冲溶液的pH值为6_9。
全文摘要
本发明属于纳米材料制备技术和生物合成技术领域，一种静电纺丝制备纳米纤维酶膜的方法及其应用。将谷氨酰胺合成酶水溶液与聚乙烯醇混合，利用静电纺丝技术制备纳米纤维酶膜，以谷氨酸钠和乙胺为底物合成茶氨酸，并对反应条件进行了优化，在最适条件下，其酶活保留率为92.3%。
文档编号D01D5/00GK102206623SQ20111009883
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月20日 优先权日2011年4月20日
发明者刘博 , 孙立明, 张晨璐, 李平 申请人:同济大学