一种天然材料-醇质体复合纳米纤维的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种天然材料-醇质体复合纳米纤维的制备方法，包括：将卵磷脂、胆固醇、十八胺混合，加入无水乙醇，搅拌溶解，减压蒸发，得到脂质膜；将水醇溶液加入上述脂质膜中，室温搅拌，然后再加入水醇溶液，室温搅拌，混匀，超声，得到醇质体悬液；将醇质体悬液和天然材料水溶液混合，浓缩，得到纺丝液，然后进行静电纺丝，即得。本发明操作简单，原料价格低廉，反应条件温和，绿色友好，经济性好，生物相容性好；本发明制备的复合纳米纤维支架可控制释放基因、生长因子以及各类药物，性能稳定并易于保存，应用前景广阔。
【专利说明】一种天然材料-醇质体复合纳米纤维的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于复合纳米纤维的制备领域，特别涉及一种天然材料-醇质体复合纳米纤维的制备方法。
【背景技术】
[0002]纳米纤维由于具有尺度小、比表面积大和物理性能优异等特点，在生物医药领域具有广阔的应用前景。电纺纳米纤维膜有小的孔径和高的比表面积，可促进止血反应，其多孔结构有利于细胞的呼吸而不引起伤口干燥，同时小的孔径还可有效阻止细菌侵入，具有良好的透气透氧性能，因而能诱导皮肤细胞更好的修复，有助于创面愈合与皮肤再生。纳米纤维还是负载药物的理想材料，可实现对药物的控制释放。此外，由天然蛋白和多糖组成的纳米纤维结构可以模拟天然细胞外基质，利于细胞的生长和增殖，促进组织再生。
[0003]尽管支架的制备技术种类繁多，但其中绝大部分在制作过程中均或多或少的涉及对生物体有毒有害、对环境不友好的有机溶剂。不涉及有毒有害物质的支架制备方法受到青睐，追求绿色工艺成为静电纺技术的新趋势。虽然绿色工艺的开发难度很大，但还是有一些技术应运而生，例如，熔融静电纺(melt electrospinning)和水溶液静电纺(aqueoussolution electrospinning)。熔融电纺目前实现起来并不容易，需要较复杂的设备,而且由于熔融液粘度较大，得到的纤维直径一般在微米级以上。蚕丝素蛋白(silk fibroin, SF)的水溶液静电纺技术已经取得突破，许多学者已经分别用不同的方法成功制备再生丝素蛋白水溶液，在此基础上利用静电纺丝技术制备出丝素纳米纤维无纺布。丝素蛋白水溶液电纺的成功无疑为丝素蛋白纳米纤维广泛应用于各类组织损伤修复开启了一扇大门。相比胶原蛋白，蚕丝素在国内具有取材方便，价格低廉的巨大优势。
[0004]醇质体由磷脂、低分子量醇及药物组成，在传统脂质体处方中添加高浓度的地方分子量醇即可制得。醇质体结构既可作为促渗透剂作用于角质层，也可作为药物载体进入全循环。该剂型与普通的脂质体相比，不仅结构稳定，且无毒性并具有长效性，更容易载药透过角质层，发挥较好的疗效，对亲水性和亲脂性分子的经皮吸收均有较强的促渗透作用。
[0005]此外，醇质体与皮肤表面融合性好，以其作为药物载体在疤痕治疗过程中有较大优势，作为一种新型载体，它具有包封率高、可变形、流动性好、皮肤刺激性小、透皮效果好、皮肤滞留量大及可进行细胞内传递药物等特点，应用前景良好。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种天然材料-醇质体复合纳米纤维的制备方法，该方法操作简单，原料价格低廉，反应条件温和，绿色友好，经济性好，生物相容性好。
[0007]本发明的一种天然材料-醇质体复合纳米纤维的制备方法，包括:
[0008](I)将卵磷脂、胆固醇、十八胺混合，加入无水乙醇，搅拌溶解，减压蒸发去除乙醇，得到脂质膜；其中卵磷脂、胆固醇、十八胺、无水乙醇的比例关系为0.16g:0.04g:0.0004-0.0lg:10ml ；[0009](2)将水醇溶液加入上述脂质膜中，室温搅拌,然后再加入水醇溶液,室温搅拌,混匀，超声，得到粒径均匀的醇质体悬液；分别加入的水醇溶液体积比为1: 1，水醇溶液总体积和无水乙醇的体积比为1:1 ;
[0010](3)将上述醇质体悬液和天然材料水溶液混合，浓缩，得到纺丝液，然后进行静电纺丝,得到天然材料-醇质体复合纳米纤维，其中醇质体占天然材料的质量分数为1_15%。
[0011]所述步骤(2)中水醇溶液中水和醇的体积比为7:3，醇为无水乙醇。
[0012]所述步骤(2)中水醇溶液中溶解或分散有染料分子、生物活性因子中的一种或两种。
[0013]所述步骤(2)中脂质膜中包裹有染料分子、生物活性因子中的一种或两种。
[0014]所述的染料分子为荧光活性染料DiO和/或荧光活性染料DiL。
[0015]所述的生物活性因子为生长因子、生物酶、基因、药物中的一种或几种。
[0016]所述生长因子为磷酸鞘氨醇、血管内皮生长因子、神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、骨形成蛋白、表皮生长因子中的一种或几种；生物酶为果胶酶、蛋白酶、脂肪酶、过氧化氢酶、淀粉酶中的一种或几种；基因为基因片段、基因表达载体、MicroRNA, siRNA、mRNA、tRNA、rRNA中的一种或几种；药物为硫辛酸、维生素A、维生素E、阿霉素、地塞米松、洛莫司汀、丹参酮、卡莫司汀、右雷佐生、磷酸氟达拉滨、卡培他滨、紫杉醇、替吉奥、奥沙利钼、多西他赛、长春瑞滨、榄香烯、羟基喜树碱、荧光素纳中的一种或几种。
[0017]所述步骤(2)中室温搅拌时间均为5-10min。
[0018]所述步骤(2)中所述的醇质体悬液中醇质体粒子的的粒径约为lOOnm。
[0019]所述步骤(3)中天然材料为明胶、丝素蛋白、壳聚糖、胶原蛋白、海藻酸钠中的一种或几种。所述步骤(3)中纺丝液中天然材料的质量百分比为10-30%。
[0020]所述步骤(3)中静电纺丝工艺参数为电压为8_20kV，推进速度为0.3-1.0mL/h，接收距离为15-20cm，温度为20-40°C，湿度为30_50%。
[0021]所述步骤(3)中所得的复合纳米纤维在质量百分比0.5-2%的京尼平溶液的蒸汽或者体积浓度75%的乙醇蒸汽中熏蒸交联48h，得到不溶于水的支架材料。
[0022]本发明利用静电纺丝技术制备出负载有醇质体的天然材料复合纳米纤维，主要是利用静电纺技术将天然蛋白和纳米级有机粒子进行混纺、同轴纺，进而得到天然材料-有机纳米粒子复合纳米纤维组织工程支架。醇质体可包裹生物活性分子(如生长因子、基因以及其他活性药物)极大的拓展纳米纤维在生物医学，组织再生等领域的应用。
[0023]本发明采用薄膜分散法制备粒径约lOOnm、表面带阳性电荷的醇质体，并结合静电纺丝技术，最终制备出直径约500nm的天然材料-有机纳米粒子复合纳米纤维。
[0024]本发明所制备的天然材料-有机纳米粒子复合纳米纤维，具有良好的生物相容性，制备方法简单反应条件温和，且整个实验过程不涉及任何有毒有害对环境不友好的物质，实验原料价格低廉，载药量高，能够受控长期释放。由该复合纳米纤维构成的支架可携载并缓释生长因子、基因片段等活性分子，从而在组织工程乃至癌症治疗等在生物医学、组织再生领域具有良好的应用前景。
[0025]有益效果
[0026]( I)本发明操作简单，原料价格低廉，反应条件温和，绿色友好，经济性好，生物相容性好；[0027](2)本发明制备的复合纳米纤维支架可控制释放基因、生长因子以及各类药物，性能稳定并易于保存，在组织修复乃至肿瘤治疗等生物医学领域具有良好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1是实施例1所得产物的TEM照片；
[0029]图2是实施例2所得产物的SEM照片；
[0030]图3是实施例4所得产物的Confocal照片。
【具体实施方式】
[0031]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0032]实施例1
[0033]载药醇质体的制备
[0034](I)采用薄膜分散法制备脂质微球。称取卵磷脂0.16g、胆固醇0.04g、十八胺0.08g以及0.0lg-0.02g药物于50mL单孔圆底烧瓶中，加无水乙醇10.0mL，搅拌使溶解，减压的条件下将乙醇挥去，得脂质膜。
[0035](2)配制体积比为7:3的水醇溶液。
[0036](3)将步骤(2)的产物5ml加至步骤(I)中的圆底烧瓶中，室温搅拌lOmin，再将步骤(2)的产物5ml加至步骤(I)中的圆底烧瓶中，室温搅拌lOmin。
[0037](4)将步骤(3)的产物进行超声，功率为20W，超声3s，间隔3s，共30个周期，得到粒径均匀的载药醇质体悬液。
[0038](5)步骤(4)得到的醇质体悬液用水醇溶液(V:V=7:3)稀释到质量体积分数为
0.lw/v%-0.5w/v%，经磷钨酸负染后用透射电镜观察。
[0039]实施例2
[0040]负载醇质体的丝素蛋白纳米纤维支架
[0041](I)采用薄膜分散法制备脂质微球。称取卵磷脂0.16g、胆固醇0.04g、十八胺
0.08g以及0.02g萘普生于50mL圆底烧瓶中，加无水乙醇IOmL,室温搅拌使溶解，减压的条件下将乙醇挥去，得到脂质膜。
[0042](2)配制体积比为7:3的水醇溶液。
[0043](3)将步骤(2)的产物5ml加至步骤(I)中的圆底烧瓶中，室温搅拌lOmin，再将步骤(2)的产物5ml加至步骤(I)中的圆底烧瓶中，室温搅拌lOmin。
[0044](4)将步骤(3)的产物进行超声，得到粒径均匀的醇质体悬液。
[0045](5)称取再生丝素蛋白0.8g、聚环氧乙烷(分子量为600，000) 0.08g，加2ml去离子水，搅拌得到均一溶液。
[0046](6)将步骤(4)中的产物与步骤(5)得到的产物等体积混合，轻微搅拌的到纺丝溶液。用注射器吸取该溶液，调节电压为20kV，推进速度为0.3mL/h，接收距离为20cm，制得负载萘普生的丝素蛋白-醇质体复合纳米纤维。[0047](6)所得纳米纤维在75%乙醇蒸汽中熏蒸交联24h，既可以达到消毒除菌的效果还可以进行交联，使所得复合纳米纤维从原来的超亲水性转变为疏水性支架。
[0048]实施例3
[0049]负载醇质体的丝素蛋白纳米纤维支架
[0050](I)采用薄膜分散法制备脂质微球。称取卵磷脂0.16g、胆固醇0.04g、十八胺
0.08g以及0.02g维生素E于50mL圆底烧瓶中，加无水乙醇10mL，室温搅拌使溶解，减压的条件下将乙醇挥去，得到脂质膜。
[0051](2)配制体积比为7:3的水醇溶液，加入少量DiO，得到DiO浓度为10 ii M的水醇溶液。
[0052](3)将步骤(2)的产物5ml加至步骤(I)中的圆底烧瓶中，室温搅拌lOmin，再将步骤(2)的产物5ml加至步骤(I)中的圆底烧瓶中，室温搅拌lOmin。
[0053](4)将步骤(3)的产物进行超声，得到粒径均匀的醇质体悬液。
[0054](5)称取再生丝素蛋白0.8g、聚环氧乙烷(分子量为600，000) 0.08g，加2ml去离子水，搅拌得到均一溶液。
[0055](6)将步骤(4)中的产物与步骤(5)得到的产物等体积混合，轻微搅拌的到纺丝溶液。用注射器吸取该溶液，调节电压为20kV，推进速度为0.3mL/h，接收距离为20cm，制得负维生素E生的丝素蛋白-醇质体复合纳米纤维。
[0056](6)所得纳米纤维在75%乙醇蒸汽中熏蒸交联24h，既可以达到消毒除菌的效果还可以进行交联，使所得复合纳米纤维从原来的超亲水性转变为疏水性支架。
【权利要求】
1.一种天然材料-醇质体复合纳米纤维的制备方法，包括: (1)将卵磷脂、胆固醇、十八胺混合，加入无水乙醇，搅拌溶解，减压蒸发，得到脂质膜；其中卵磷脂、胆固醇、十八胺、无水乙醇的比例关系为0.16g:0.04g:0.0004-0.0lg:10ml ； (2)将水醇溶液加入上述脂质膜中，室温搅拌，然后再加入水醇溶液，室温搅拌，混匀，超声，得到醇质体悬液；分别加入的水醇溶液体积比为1:1，水醇溶液总体积和无水乙醇的体积比为1:1; (3)将上述醇质体悬液和天然材料水溶液混合，浓缩，得到纺丝液，然后进行静电纺丝，得到天然材料-醇质体复合纳米纤维，其中醇质体占天然材料的质量分数为1_15%。
2.根据权利要求1所述的一种天然材料-醇质体复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中水醇溶液中水和醇的体积比为7:3，醇为无水乙醇。
3.根据权利要求1所述的一种天然材料-醇质体复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中脂质膜和/或水醇溶液中含有染料分子、生物活性因子中的一种或两种。
4.根据权利要求3所述的一种天然材料-醇质体复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述的染料分子为荧光活性染料DiO和/或荧光活性染料DiL。
5.根据权利要求3所述的一种天然材料-醇质体复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述的生物活性因子为生长因子、生物酶、基因、药物中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的一种天然材料-醇质体复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述生长因子为磷酸鞘氨醇、血管内皮生长因子、神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、骨形成蛋白、表皮生长因子中的一种或几种；生物酶为果胶酶、蛋白酶、脂肪酶、过氧化氢酶、淀粉酶中的一种或几种；基因为基因片段、基因表达载体、MicroRNA、siRNA、mRNA、tRNA、rRNA中的一种或几种；药物为硫辛酸、维生素A、维生素E、阿霉素、地塞米松、洛莫司汀、丹参酮、卡莫司汀、右雷佐生、磷酸氟达拉滨、卡培他滨、紫杉醇、替吉奥、奥沙利钼、多西他赛、长春瑞滨、榄香烯、羟基喜树碱、荧光素纳中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的一种天然材料-醇质体复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中天然材料为明胶、丝素蛋白、壳聚糖、胶原蛋白、海藻酸钠中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的一种天然材料-醇质体复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中纺丝液中天然材料的质量百分比为10-30%。
9.根据权利要求1所述的一种天然材料-醇质体复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中静电纺丝工艺参数为电压为8-20kV，推进速度为0.3-1.0mL/h，接收距尚为15_20cm，温度为20_40 C，湿度为30_50%。
10.根据权利要求1所述的一种天然材料-醇质体复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中所得的复合纳米纤维在质量百分比0.5-2%的京尼平溶液的蒸汽或者体积浓度75%的乙醇蒸汽中熏蒸交联48h，得到不溶于水的支架材料。
【文档编号】D01D5/00GK103614799SQ201310545962
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】王红声, 韩峰, 陈梦霞, 何创龙, 莫秀梅 申请人:东华大学