用于标记材料的方法

专利名称：用于标记材料的方法
技术领域：
本发明涉及用微粒标记材料的领域。
背景技术：
材料的标记是一种用于鉴定物品的来源的重要特征。传统上，通过材料的包装来 实现上述标记，在材料的包装上可以提供关于生产商、内容物以及所包装材料的其它特征 的包装信息。然而，在物品被拆开以后，所述信息会丧失。如果物品的使用者以后需要鉴 定材料的来源，则这是尤其麻烦的。当物品出现故障时，可能会出现这样的需要。标记的 另一种用途是证明伪劣品或伪造品。对其标记会是有利的物品的实例是服装，鞋，香烟，手 表，银行票据，涂料，炸药，医药产品，食品，化妆品，动物以及农产品如(盆栽)植物、插条 (cutting)、组织培养材料以及种子。在现有技术中，已描述了若干种利用微粒来标记材料的系统。大多数这些系统使 用着色的或以其它方式标记的微粒，其可以通过将微粒沉积在材料上的方式(因此提供功 能像条码的系统)或通过微粒本身的内在特性来提供代码。上述系统的实例(尤其)被描 述在US 3，772，099 (来自镧系元素和硅酸钾的发光微粒)、US 4，390，452 (形成着色层的 微粒)、WO 2003/052025 (掺杂有铕或铈的YVO4或LaPO4的微粒)、WO 2002/46528 (用于形 成图案的荧光微粒)、US 6，620，360 (多层微粒)以及US 6，455，157 (用微粒“标条形码”) 中。在WO 2005/118650中描述了一种系统，其中聚合物微粒掺杂有染料、稀土元素或具有 用于标记材料的放射性。W0-A-90/14441描述了一种用于标记材料的方法，其中通过用核酸标记物来处理 材料使得足够量的核酸附着于所述材料用于随后的检测。为了检测，标记物可以从所标记 的材料中回收。在农业方面在种子的情况下，材料的标记是尤其重要的。在种子已被播种以后，种 子供应商几乎不可能鉴定种子是否源自供应商的公司。在这种情况下，如上所述的现有技 术的微粒是没用的或几乎没用的，因为它们对于种子或正发育的幼苗有毒性，和/或它们 被溶解在其中播种种子的土壤中，和/或它们易于仿制，和/或已经用于其它目的、其它种 子批、其它公司等，因而并不具有辨别力。因此，仍然需要可替换的标记微粒，尤其用于种子的标记。

发明内容
因此本发明包括一种用于标记对象的方法，该方法包括对所述对象施加包含交联 聚合物和标记成分的微粒，其中所述标记成分从所述微粒的释放通过微粒与外部刺激的接 触被触发，以及其中所述聚合物是碳水化合物或蛋白质、或它们的组合。优选地，在所述方 法中，外部刺激是酶，其能够降解聚合物，或可替换地，标记成分从所述微粒的释放由静电 相互作用的变化所引起，由例如PH的变化或盐浓度的变化所引起。进一步优选的是一种微粒，其中所述微粒的聚合物选自由淀粉或淀粉的衍生物、纤维素或纤维素的衍生物、果胶或果胶的衍生物、以及明胶或明胶的衍生物组成的组。进一步优选的是一种微粒，其中交联剂选自由二乙烯基砜、表氯醇、双环氧化合物 如丙三醇二缩水甘油醚(甘油二缩水甘油醚，glycerol diglycidyl ether)或丁二醇二缩 水甘油醚(butanedioldiglycidyl ether)、三偏磷酸钠以及己二酸、或它们的衍生物组成 的组。同样优选的是一种微粒，其中聚合物通过选自由过氧化物酶、漆酶、多酚氧化酶、 转谷氨酰胺酶、蛋白质二硫键异构酶、巯基氧化酶、赖氨酰氧化酶以及脂肪氧合酶组成的组 中的交联酶来交联。在所述微粒中，标记成分优选为染料或酶，更优选为漆酶。优选将所述标记系统施 加于对象，其选自服装、鞋、香烟、手表、银行票据、涂料、炸药、医药产品、食品、化妆品、动物 以及农产品如(盆栽)植物、插条、组织培养材料以及种子，更优选种子。本发明的一部分还是一种用于鉴定对象的方法，该方法包括以下步骤按照本发明的方法来标记对象； 通过施加适当的外部刺激以从所述微粒释放标记成分来鉴定所述对象；以及对标记成分进行测定。此外，本发明包括包含带电荷的交联聚合物和标记成分的微粒在用于标记对象中 的应用，其中所述标记成分从所述微粒的释放通过微粒与外部刺激的接触被触发，以及其 中所述聚合物是碳水化合物或蛋白质。另外，本发明涉及一种用于标记对象或用于鉴定对象的试剂盒，包含-如本文定义的微粒；以及-用于降解聚合物的酶。另外，本发明涉及一种用于标记对象或用于鉴定对象的试剂盒，包含-如本文定义的微粒；以及-用于释放标记成分的盐。


图I.A.绿豆和草种子，涂布有包含酚酞的WDV86-88颗粒以及未涂布的。B.干燥 BioSwitch颗粒的实例，即细磨的。图2.绿豆和草种子，涂布有包含酚酞的WDV86-88颗粒以及未涂布的，在测试溶 液50mM碳酸钠缓冲液(pHIO)中。图3.在不同pH值下二甲酚橙的UV/Vis(紫外光/可见光)谱。图4.在二甲酚橙与阳离子WDV86-88基质之间相互作用的盐依赖性。图5.与未涂布的绿豆相比，包含二甲酚橙的WDV124凝胶颗粒涂布的绿豆。测试 溶液 A :5mM TRIS/HC1 (ρΗ8· 0)；溶液 B 在 5mM TRIS/HC1 (ρΗ8· 0)中的 50χ 稀释的热稳定性 淀粉酶(Thermamyl Amylase)。图6.两步光标记原理(构思，concept)。图7.上图片与未涂布的绿豆相比，包含漆酶的WDV 124凝胶颗粒(冻干)涂布的 绿豆。测试溶液 A :5mM TRIS/HC1 (ρΗ8· 0)；溶液 B 在 5mM TRIS/HC1 (ρΗ8· 0)中的 50χ 稀释 的热稳定性淀粉酶(Thermamyl Amylase) 0在环境温度下，在10分钟温育以后，添加ABTS ；其后2分钟获取图片。下图片在右边的两个管包含游离的BioSwitch颗粒(即，未涂布在 种子上)。用来分解基于淀粉的BioSwitch基质的淀粉酶仅允许在管B中反应10分钟。在 两种情况下，其后均添加ABTS。图8.与未涂布的绿豆相比，包含漆酶的WDV124凝胶颗粒(冻干)涂布的绿豆。测 试溶液 A:5mM TRIS/HC1 (pH8. 0)；溶液 B:在 5mM TRIS/HC1 (pH8. 0)中的 50x 稀释的热稳定 性淀粉酶(Thermamyl Amylase)。在环境温度下，在10分钟温育以后添加ABTS ；分别在其 后8和210分钟获取图像用于上图片和下图片。图9.与未涂布的绿豆相比，包含漆酶的WDV124凝胶颗粒(风干)涂布的绿豆。测 试溶液 A:5mM TRIS/HC1 (pH8. 0)；溶液 B:在 5mM TRIS/HC1 (pH8. 0)中的 50x 稀释的热稳定 性淀粉酶(Thermamyl Amylase)。在环境温度下在10分钟温育以后添加ABTS ；分别在其后 30秒、2和15分钟获取图像用于上图片和下图片。图10.与未涂布的绿豆相比，包含漆酶(第2批次)的WDV124XF凝胶颗粒(冻 干)涂布的绿豆。测试溶液A :5mMTRIS/HCl(pH8. 0)；溶液B 在5mM TRIS/HC1 (pH8. 0)中的 50x稀释的热稳定性淀粉酶(Thermamyl Amylase) 0在环境温度下在10分钟温育以后添加 ABTS ；分别在其后1和5分钟获取图像用于上图片和中间图片。下图片示出了用ABTS温育 的在测试溶液A中的经涂布绿豆的特写(close-up)。图11.如在甜菜根(甜菜，beetroot)种子(左侧图片)和独行菜种子(水芹种 子，garden cress seed)(右侧图片)上，即在种子本身上，在2、4以及7天(甜菜)以后， 或在1、2以及3天(独行菜(水芹，cress))以后测得的漆酶活性。图12.如在甜菜根种子(左侧图片)和独行菜种子(右侧图片)上，即在种子本 身上，在2、4以及7天(甜菜)以后，或在1、2以及3天(独行菜)以后测得的二甲酚橙的 存在。图13.如在甜菜根种子(左侧图片)和独行菜种子(右侧图片)上，即在种子本身 上，在2、4和7天(甜菜)以后，或在1、2和3天(独行菜)以后测得的AZCL-直链淀粉。
具体实施例方式根据本发明的微粒包含交联碳水化合物和/或蛋白质，由低聚和聚合碳水化合物 和/或蛋白质制成，其可以用作用于任何外部刺激如酶的底物(substrate)。因此可以使用 的碳水化合物是这样的碳水化合物，如，例如，葡萄糖，果糖，蔗糖，麦芽糖，阿拉伯糖，甘露 糖，半乳糖，乳糖以及这些糖的低聚物和聚合物，纤维素，糊精如麦芽糊精，琼脂糖，直链淀 粉，支链淀粉以及树胶，例如瓜尔豆胶(guar)。可以使用的蛋白质包括白蛋白、卵清蛋白、 酪蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白、球蛋白、氯化高铁血红素、血红蛋白、肌红蛋白以及小肽。优选 地，使用从DP2以后的低聚碳水化合物或从DPlO以后的聚合碳水化合物。更具体地说，使用 > DP50的聚合碳水化合物，以及甚至更具体地说使用> DP75的聚合碳水化合物。这些聚 合碳水化合物可以是自然发生的聚合物如淀粉(直链淀粉、支链淀粉)，纤维素以及树胶或 它们的衍生物，其可以通过磷酸化或氧化而形成。还可以使用其它聚合物(例如己内酯)， 其可以被加入为了与例如待标记材料更好的相容性。在蛋白质的情况下，还可以使用从植 物或动物材料的水解产物获得的蛋白质。还可以使用适宜的碳水化合物的混合物(例如共 聚物)或蛋白质的混合物。
可以使用合成聚合物，如，例如，乙烯基树脂(polyvinyl)、聚乙烯 (polyethylene)、聚丙烯、以及类似化合物。 交联聚合物的优点在于通过在基质中引入交联所形成的载体的内在稳定性。具体 地说，交联是醚键和/或酯键，其中对于酯键来说，磷酸酯是优选的。另一个重要的优点在 于，交联提供了交联聚合物的三维晶格，其中用作标记的成分可以被“填入”。此外，成分的 选择，即，聚合物和交联剂的选择会影响载体的三维结构，因而将便于制备适用于一定尺寸 和/或一定电荷的分子的特定载体。从其构造微粒的聚合物基质可以构造自容易获得的和水溶性聚合物如多糖和 (水解)蛋白质，并且这样做时可以形成柔性基质并且通过例如羧酸和/或阳离子基团正和 /或负电荷将产生用于标记成分的定制载体。这不可能利用多糖如壳多糖和/或壳聚糖来 完成。此外上述聚合物比迄今为止使用的壳多糖和壳聚糖要便宜得多。具有电荷是用于本 发明的聚合物的最重要特征。它将大大地促进在标记成分(其经常是带电荷分子)与聚合 物晶格之间复合物的形成。优选地，聚合物是带电荷的。这样的电荷可以通过聚合物本身 来提供，但是如果聚合物并不具有正或负电荷，则可以作为聚合物的改性的结果或通过用 于交联聚合物的交联剂来弓丨入电荷。可以通过聚合物的共价交联来完成基质的形成。可以使用的典型的交联剂是化学 交联剂如二乙烯基砜、表氯醇、双环氧化合物如丙三醇二缩水甘油醚或丁二醇二缩水甘油 醚、三偏磷酸钠以及己二酸或它们的衍生物、或戊二醛等。交联还可以通过酶作用，例如通 过利用来自由漆酶(其例如诱导果胶的交联)、过氧化物酶、多酚氧化酶、转谷氨酰胺酶、蛋 白质二硫键异构酶、巯基氧化酶、赖氨酰氧化酶以及脂肪氧合酶组成的组的酶而建立。如何 使用这些交联剂或交联酶的方法在本领域是众所周知的和/或已大量地描述在实验部分 中。可以通过氧化、用阳离子官能团或羧甲基基团的取代和/或用例如乙酰基基团的 酯化来完成聚合物的改性。虽然在后者情况下没有添加电荷，但它用来使聚合物更疏水以 便于聚合物与具有很少或没有电荷的标记成分复合。通常，在交联和凝胶化以前改性聚合物。只要通过醚形成的交联已经完成，则可以 在交联和凝胶化以后改性聚合物。本领域技术人员将知道如何改性在本发明中指定的聚合 物以向它们提供所述基团。交联聚合物的电荷可以是负的或正的，这取决于聚合物的类型、改性的类型以及 交联的类型。有利地，聚合物具有相当大的尺寸，S卩，30kD或更大。这便于在交联以后容易形成 凝胶并且它便于形成能够接收标记成分的晶格。本发明的微粒通过交联容易获得的碳水化合物聚合物和/或蛋白质来制备。优选 地，如在实施例中所示，交联的聚合物形成凝胶，其确保了微粒的长期稳定性并且对于标记 物品和材料的微粒易于进一步使用。通常，制备微粒的方法如下a)提供聚合物；b)提供交联剂或交联酶并通过添加碱或酸来激活交联剂；c)将交联剂加入聚合物；应当明了，交联剂的激活可以在混合聚合物和交联剂以前发生，或者当两者已被混合时发生。这取决于所使用的交联剂的类型和聚合物的类型；d)使交联发生；e)使交联聚合物凝胶化；f)洗涤凝胶以除去所有溶剂和未反应的试剂；g)通过破坏凝胶以及可选地进一步磨碎来从凝胶形成微粒；h)干燥微粒；以及i)用标记成分加载载体。 这种方法便于形成适宜的根据本发明的微粒。在这种方法中，作为聚合物基材，还 可以使用蛋白质和碳水化合物的混合物。以这种方式，形成了稳定的并且可以用于根据本发明的各种用途的微粒。以下实 施例说明，当被溶解时，甚至没有当被加热或煮沸时，微粒将不会再次胶凝，并且它们不会 自发破裂，其将引起任何标记成分的凌乱的释放。微粒的尺寸取决于破坏和研磨方法。优选通过迫使凝胶通过所期望的筛目大小的 筛来进行破坏。如有必要，可以通过另外研磨筛过的颗粒来形成更细颗粒。载体的尺寸优 选可以在从0. 5 μ m至100 μ m的范围并且最佳尺寸将取决于它们所用于的具体应用。通常 认为，小微粒是优选的用于其中应看不见标记的用途(如在银行票据上)，其中在未限制能 见度或尺寸的情况下(如在种子包衣中)可以使用较大的微粒。认为，标记成分的加载是可能的，因为形成了复合物，这是由于交联聚合物的带电 荷基团与感兴趣的化合物上的带电荷基团之间的静电相互作用。在使用中性成分和/或聚 合物的情况下，通过疏水基团之间的静水相互作用将很可能引起复合物形成。标记成分可以具有任何尺寸和重量，只要微粒可以提供与所述化合物的稳定复 合，但它优选具有小于50kD，更优选小于30kD以及最优选小于IOkD的重量。在酶、或其它 蛋白质用作标记成分的情况下，尺寸和重量可以容易地大于50kD。在微粒中获得的标记成 分将不会从所述微粒释放，除非外部刺激改变载体的性能。这具有的优点在于标记成分不 会泄漏到环境中或用微粒标记的物品上。刺激可以具有任何来源，只要它能够打开载体或 减小标记成分与微粒晶格的复合作用(络合作用)，使得标记成分将从微粒释放。基本上， 存在两种可以采用的刺激，即通过微粒与标记成分之间的静电相互作用或通过聚合物的水 解。 可以通过pH、盐浓度的变化或其它一般机制来实现静电相互作用效应。通常，这将 导致标记成分与溶液中自由离子的交换。可以借助于酸或碱、或优选酶的作用来实现聚合 物链的水解。 在一种优选实施方式中，本发明包括这样的微粒，其中能够触发载体分解的外部 刺激是能够降解聚合物的酶。在包埋的活性组分被释放以后，能够转化上述聚合物的许 多酶是已知的，如淀粉酶、半纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、普鲁兰酶(支链淀粉酶)、阿 拉伯糖苷酶(arabinodase)、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶或肽酶或蛋白酶。标记成分 与本发明的微粒复合的事实的优点是不仅仅通过外部刺激的释放而且标记化合物由微 粒加以保存并且将不会受到环境影响而降解(当然，除了如果存在外部刺激)的副作用 (side-effect)。此外，大多数可以用于生产微粒的聚合物没有毒性，并且甚至是食品级成 分。
根据本发明，还可以提供两种或更多种标记成分。这可以通过以下来实现混合加 载有不同成分的微粒，或提供具有溶解于其中的两种或更多种标记成分的加载溶液用于加 载微粒(即，进行上述方法的步骤(i))。本发明的优点在于，仅当施加外部刺激时，标记物质才从微粒释放。因此，在经标 记的材料上的微粒将实际上是惰性的直到加载的标记物质被释放。在本发明的一种实施方式中，包含具有标记物质的微粒的涂层可以非常很好地用 于施加在材料上，甚至经常与食品接触的表面上或易损坏的系统上，如(切茎(cut stem) 的)切花、植物根系(plantroot)、用作繁殖材料(propagating material)的插条、植物组 织培养材料、石棉或其它材料的营养支持和植物支持介质等。利用根据本发明的涂层来涂 布这种类型的材料并不阻碍材料的功能(例如水或营养物吸入)，而仍然提供所期望的标 记。根据本发明的涂层可以优选用于涂布种子。种子经常被提供有涂层以提供杀真菌 齐U、杀虫剂、农药、营养物以及其它化合物，用于萌发幼苗、幼嫩植物和/或正发育作物。加 载有根据本发明的标记成分的微粒可以容易地施加至种子，作为正常涂 层的一部分或在正 常涂层的工艺中，或作为分开的涂层。可替换地，微粒可以包括在种子颗粒中或在施加至包 衣种子(颗粒种子，pelleted seed)的涂层中。颗粒是一种通用术语，其用于小颗粒或细 粒，通常通过压缩原始材料所产生的一种颗粒或细粒。在种子处理中，造球是指将种子封装 到粘土填料的球中，其大大改善种子的处理特性以及提供用于种子处理化学品的载体。造 粒混合物通常包含各种类型的有机或无机纤维、粘土和惰性的无机材料，以及还包含具有 内部开放孔隙度的颗粒。其它常用类型的造粒混合物是粘土与惰性原料的各种组合而没有 添加纤维。本发明的微粒可以包括在施加于涂层上的造球混合物顶部中。可替换地，因为 种子颗粒经常涂布有聚合物薄膜涂层以将有益的化合物施加至种子，所以本发明的微粒还 可以被施加至涂层。另外，种子的涂层并不需要完全包住种子，如果若干微粒附着于种子就足够了，使 得每个种子被标记并易于通过测定标记而被鉴定。先决条件是，微粒将对种子没有害处，也 对正发育的幼苗没有害处。此外，对于环境或当它们最后处于可食用物质(如植物的根部、 块茎或其它部分)中时剩余微粒将不应当是有害的。根据本发明，这些目标可以容易地达 到。可以用于微粒中的标记物质可以是可以被特异性识别的任何化合物。对于实际应 用来说，优选的标记物质利用容易、快速以及便宜的方法被特异性识别。这样的标记物质 可以是光标记，如天然染料，发色团或荧光或磷光化合物，具有特定NIR吸收或荧光谱的化 合物，具有特定拉曼光谱的化合物，酶标记，如漆酶、或任何其它酶，其不能降解微粒的聚合 物，生物聚合物如核苷酸序列，化合物如PH指示剂，或上述的任何组合。标记物质还可以是 这样的物质，其可以通过与被加入鉴定试样中的其它化合物的特定的化学反应或物理相互 作用加以鉴定。可以用传感器或传感器系统特异性识别的物质也可以用作标记物质。例如，酶，如漆酶，可以用作微粒中的标记物质。在适当刺激(例如淀粉酶)以后， 微粒被降解，从而释放酶。于是，存在标记酶，其可以通过添加第二成分加以检测。在漆酶 的情况下，第二成分将是ABTS，其是用于这种酶的模型底物。ABTS将被漆酶氧化并从无色 变色到绿色。在种子标记的情况下，用本发明的微粒标记的种子将被加入溶液，其包含用于降解微粒的刺激，例如，一种酶。然后，能够与标记反应的反应物被加入溶液并观测(显色) 反应。本领域技术人员将能够使用特定的反应，其适合本发明的上述方案。如上所述，一个 实例是使用漆酶作为标记以及ABTS作为反应物，其它实例将是抗原和标记抗体的组合；核 酸(其中反应物被标记)，其能够杂交；等等。甚至可以具有三步反应方案，其中标记与反 应物反应，上述反应物将产生一种产物，以及其中借助于第二反应物可以检测该产物。在实施例中将说明本发明的载体的制备和应用。本领域技术人员将明了，本发明 并不限于所提及的具体实施方式
和应用，而是可以以本领域技术人员容易获得的各种其它 实施方式来显现本发明。实施例实施例1微粒(BioSwitch颗粒)的制备向2. 4克NaOH在480ml水中的溶液中加入120克马铃薯淀粉并通过在65°C下温育 而进行胶凝。当淀粉被完全溶解时，添加73ml缩水甘油三甲基氯化铵(70%，在水中)以引 入阳离子官能团。在60°C下搅拌反应混合物120分钟。在冷却至室温以后，将Ig NaOH(溶 解在2ml水中)加入IOOml获得的反应混合物中。然后添加2ml丙三醇二缩水甘油醚用于 交联的阳离子淀粉，接着搅拌15分钟。将此溶液存储在;TC下3天。在冷却至室温以后，使 获得的凝胶施压通过筛目大约为Imm2的筛，其后添加水，其容易被凝胶吸收。然后用乙醇 沉淀凝胶，随后用乙醇洗涤两次以及用丙酮洗涤一次，接着在凝胶干燥机中风干。使用两种类型的凝胶用于有关光标记的实验 实施例2将酚酞或二甲酚橙加入凝胶WDV86-88中将大约200mg酚酞溶解在20ml乙醇中。添加2. 4g凝胶颗粒(WDV86-88)并使其 在剧烈摇动下溶胀。该溶液容易被凝胶吸收(在30秒内)。其后，冻干反应混合物，产生大 约2. 2克干燥的白色凝胶颗粒。作为说明，描述了涂布有包含酚酞的WDV86-88颗粒的绿豆和草种子(图1)。与未 涂布的颗粒相比，涂布有BioSwitch颗粒的CMC很难看出来。当施用适当的测试溶液时，涂布与未涂布种子之间的明显差异变得显而易见(图 2)。测试溶液导致从BioSwitch颗粒释放酚酞。除了释放以外，此测试溶液还导致pH的增 加(高于pH9，酚酞从无色变化至红紫色)。虽然这种构思是可行的，但缺点在于，在没有外部触发的情况下会释放活性化合 物。此外，太容易仿制(使用酚酞的简单涂布也将达到目的)。在搅拌下在IOml Milli Q水中，使50mg凝胶颗粒(WDV86-88)溶胀1小时。然后， 添加溶解在0. 5ml Milli Q中的1. 5mg染料二甲酚橙。所有的染料在15分钟内被凝胶吸 收(离子化(ionogenic)相互作用)。二甲酚橙与凝胶的结合导致染料从黄色变色到深红色。
将氯化钠加入0. 5ml合并有二甲酚橙的WDV86-88凝胶颗粒悬浮液中，以达到2ml 的最终体积，并具有以下NaCl的最终浓度:0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、以及IM0在搅拌30 分钟以后，通过离心(5分钟，3700rpm)从悬浮液除去凝胶颗粒。在获得的透明上清液中的 二甲酚橙浓度通过测量在480. 2nm处的消光来确定。通过使用参比溶液，确定了在480. 2nm 处的1消光单位对应于0.0625mg 二甲酚橙。发现，在此波长(等吸光点)处没有观测到pH 对二甲酚橙的消光的实质影响。分别在以下缓冲液(均为50mM)苹果酸pH3. 0、乙酸盐pH5. 0、MES pH6. 0,BisTRIS 丙烷(双TRIS丙烷，BisTRIS propane) pH7. 0、以及BisTRIS丙烷pH9中确定来自二甲酚橙 的UV/Vis谱。在各种pH值下，利用最终浓度为0.03mg/ml的二甲酚橙，记录了光谱。图3中描述了在不同pH值下二甲酚橙的UV/Vis谱。由于它的四个负电荷(4个 羧基基团)，它是一种有趣的分子。因此，预期与阳离子BioSwitch基质具有相当良好的静 电相互作用。此外，由于它可以在四个位置被质子化/去质子化，所以在不同的PH值下二 甲酚橙将具有不同的颜色。就光标记而言，这使它成为一种有趣的化合物。以下描述二甲 酚橙的结构式。 在480. 2nm的波长处，消光似乎不受pH的影响，使这成为等吸光点。在此pH下的 消光可以用于确定溶液中的二甲酚橙浓度。图4中描述了盐(NaCl)对二甲酚橙结合于WDV 86-88凝胶的影响。它表明，4个 负电荷导致与阳离子基质的足够的相互作用，尤其是在更低离子强度下。对于演示实验，将加载有二甲酚橙的凝胶颗粒施加至种子。然而，似乎是，当5% CMC用来将BioSwitch颗粒涂布于绿豆时，大量的二甲酚橙已经被释放。在有或没有淀粉 酶(其用来分解凝胶颗粒，以便释放染料)的试管中没有观测到真正的区别。测量所使用 的CMC的电导率并发现为7. 2mS/cm，其对应于0. IM NaCl的离子强度。为了降低涂层材料 的离子强度，使用2%的胶凝淀粉溶液用于进一步的实验。实施例3将二甲酚橙加入WDV124凝胶颗粒中在搅拌下，在380ml Milli Q中，使2. 5g的WDV124凝胶颗粒溶胀1小时。然后， 添加20ml的50mM MES/NaOH pH6缓冲液，接着添加在50ml Milli Q中的150mg 二甲酚橙。 几乎所有的染料在30分钟内被凝胶吸收。二甲酚橙与凝胶的结合导致染料从黄色变色到 深红色。其后，冻干凝胶，产生2克深红色的粉末。 实施例4用加载有标记的WDV86-88凝胶颗粒涂布种子或豆类
用5%的羧甲基纤维素(CMC)溶液湿润种子(来自草、甜菜根或绿豆)。添加干燥 凝胶颗粒WVD86-88，由此目标在于在种子上均勻分布加载有标记的凝胶颗粒。这通过在加 入家用筛(household sieve)期间摇动种子来实现。其后，借助于鼓风干燥器，干燥经涂布 的种子。用包含酚酞的WDV124凝胶颗粒对绿豆的涂布如下进行
用2%的胶凝淀粉溶液湿润绿豆。添加干燥凝胶颗粒(WDV124)，由此目标在于在 种子上均勻分布凝胶颗粒(大约0. 25mg颗粒/豆)。这通过在加入家用筛期间摇动种子来 实现。随后，借助于鼓风干燥器，干燥经涂布的种子。在这种情况下用CMC涂布种子并没有产生良好结果CMC的离子强度高于阈值，从 而导致染料的释放。实施例5用WDV86-88和WDV124颗粒涂布的种子的释放以及来自用WDV86-88和 WDV124颗粒涂布的种子的显色反应将少量的经涂布的WDV86-88种子加入0. 5ml的50mM碳酸钠pHIO中。将少量的 WD-124涂布的绿豆加入0. 5ml的50x稀释的在5mM TRIS/HC1 pH8中的Thermamyl 120淀 粉酶(SigmaA3404)中。Thermamyl是一种商业上可获得的淀粉酶，其能够分解基于淀粉的 颗粒(导致所加入的活性化合物释放)。通过将经涂布的绿豆加入到相同的缓冲液中来进 行对照实验，从而省略Thermamyl。通过溶液变成粉红色来说明酚酞的存在。图5说明⑴经涂布与未涂布绿豆之间的差异，以及(ii)在存在或缺少淀粉酶的 情况下在二甲酚橙的释放方面的差异。显而易见的是，如果存在淀粉酶(其降解BioSwitch 基质，从而释放染料)，二甲苯酚仅被释放在溶液中。在缺少淀粉酶的情况下，BioSwitch基质不会被分解。然而，在试管中可以检测二 甲酚橙。与用淀粉酶的实验相反，淀粉酶的缺少导致观测到局部着色斑点完整的包含二甲 酚橙的BioSwitch颗粒。因此，染料未被释放，而是保持牢固地结合于BioSwitch基质。实施例6将漆酶加入WDV124凝胶颗粒中第一批次在搅拌下，在30ml的50mM Bis-TRIS pH6. 8中，使大约200mg的WDV124 凝胶颗粒溶胀1小时。随后，添加IOml纯化漆酶，pH被重新调节至6. 8，然后在搅拌下使凝 胶颗粒吸收上述酶30分钟。用相同的50mM BisTRIS缓冲液洗涤凝胶颗粒一次，然后通过 离心(5分钟，3700rpm)来收获。使一半凝胶颗粒静置以用空气(30°C )干燥，另一半被冻干。第二批次借助于Retsch，研磨凝胶颗粒，直到大约80%的颗粒能够通过0. 05mm 筛(凝胶代码WDV124XT 超细)。通过利用在FPLC系统上的200ml Sephadex G25柱，从 在20mM Bis-TRISpH6. 5中的50ml漆酶中除去盐。将脱盐漆酶收集在70ml缓冲液中并通 过0. 22Mm无菌过滤器过滤。在搅拌下，在30ml部分(demi)中，使250mg的WDV124XG颗粒 溶胀30分钟，其后添加15ml的在20mM Bis-TRIS pH6. 5中的 1. 5mg/ml漆酶。在30分 钟搅拌期间，上述酶被凝胶吸收。获得的凝胶被冻干，产生细白粉末。实施例7用包含漆酶的WDV124 (XF)凝胶颗粒涂布绿豆用200mL的2 %胶凝淀粉溶液湿润20粒绿豆。添加5mg干燥凝胶颗粒 (WDV124 (XF))，由此目标在于在种子上均勻分布凝胶颗粒(大约0. 4mg颗粒/豆)。这通过 在加入家用筛期间摇动种子来实现。随后，借助于鼓风干燥器来干燥经涂布的种子。
实施例8在经涂布的绿豆上释放和检测漆酶_两步反应向试管中添加一粒经涂布的绿豆和975mL溶液A或B (见下文)，接着在环境温度 下温育10分钟。其后，添加25M15mg/mlABTS，其通过漆酶的作用被氧化，从而从无色变成绿 色。接着进行显色反应(1-120分钟)并及时在不同时刻获取图片(或用分光光度法测量 溶液的消光)。
测试溶液A = 5mM BisTRIS pH6. 5测试溶液B= 200x 稀释的 Thermamyl 120 淀粉酶(SigmaA3404)，在 5mM Bis TRIS ρΗ6· 5 中活性化合物(漆酶)的检测需要两个步骤通过淀粉酶分解基质；接着由漆酶催 化显色反应，从而使ABTS从无色变成绿色(图6)。淀粉酶或ABTS的排他使用并不导致显 色，即活性化合物的检测两种化合物均是需要的。图7示出了从绿豆上的WDV124释放活性化合物以后的显色。这种构思表明，为了 显色，需要两步反应。ABTS或淀粉酶将排他地不会导致清晰均勻的颜色(仅ABTS导致蓝 色/绿色的局部斑点，即完整的BioSwitch颗粒，其中ABTS被吸收并使得可以与结合的漆 酶局部地进行反应)。图8表明，用ABTS进行的延长的温育导致进一步显色。这表明，为了 显强色，需要相对较长的时间。同时用冻干BioSwitch颗粒进行上述实验，用风干颗粒重复 实验(图9)。引人注目的是，与在用冻干颗粒的实验中相比，颜色变化更快得多。这说明，由于 冻干，漆酶已经丧失部分其活性。超细磨碎颗粒WDV124XF被加载有漆酶(第二批次)，并进行类似的实验(图10)。提供的结果形成这样的证据，S卩，可以开发光标记系统，其中需要两个连续步骤以 释放颜色。实施例9现场试验进行了最初的现场试验，其中使用独行菜和甜菜根种子作为测试材料。种子涂布 有包含BioSwitch凝胶颗粒的三种涂层，其中BioSwitch凝胶颗粒结合有二甲酚橙、漆酶或 AZCL-直链淀粉。AZCL可商业上获得，用作淀粉酶试验。它是一种用于淀粉酶的基于直链 淀粉的底物；淀粉酶的活性导致从AZCL-直链淀粉释放标记，导致显色。未涂布的种子用作 对照。对于所有样品，在盆栽用土、泥炭以及(1 1 1)的混合物中，使5X15粒种子发 芽。在气候室中，在20°C和80%相对湿度(16小时光明/8小时黑暗)下，进行发芽。立即 分析发芽的种子的样品，或存储于-20°C。在第2、4以及7天分析甜菜根种子/籽苗(发芽开始于第2-3天)。在第1、2以及3天分析独行菜种子/籽苗(发芽开始于第1天)。基本上如先前所描述的来进行结合有BioSwitch的化合物的分析。对于现场试 验，降低分析的规模以便于使用96孔微孔板进行测量。漆酶在缓冲液A或B中温育5粒独行菜种子或两粒甜菜根种子20分钟，接着在5000rpm 下离心1分钟。在96孔微孔板中混合IOOmL上清液+IOOmL缓冲液+IOM 5mg/ml ABTS，然 后在不同时间点读出在405nm处的消光。重复进行测量，示出的结果是两次测量结果的平 均值。
二甲酚橙在1ml 5mM TRIS/HAc缓冲剂pH8. 0缓冲液中温育5粒独行菜种子或两粒甜菜根种子10分钟，接着在5000rpm下离心1分钟。将250M1上清液转移到微孔板，然后读出在 580nm处的消光。重复进行测量；示出的结果是两次测量结果的平均值。AZCL-直链淀粉在缓冲液A或B中，温育三粒独行菜种子或1粒甜菜根种子30分钟，接着在 5000rpm下离心1分钟。将250M1上清液转移到微孔板，并读出在595nm处的消光。重复进行测量，示出的结果是两次测量结果的平均值。进行现场试验，以便表明在实践中利用光标记系统的可行性。独行菜种子和甜 菜根种子均涂布有BioSwitch凝胶颗粒。种子被涂布有颗粒，其结合有二甲酚橙、漆酶或 AZCL-直链淀粉。对每种活性化合物表示结果。漆酶图11示出了用涂布有漆酶的种子获得的结果。结果表明，在已经深翻(subsoil)种子四天以后仍然明显地检测到漆酶的活性。 对于独行菜，这是仅在1-2天后的情况。二甲酚橙图12示出了用涂布有二甲酚橙的种子获得的结果。结果表明，在已经深翻甜菜种子2天后检测不到二甲酚橙达四天之久。对于独行 菜在1天以后保持相同情况。对于独行菜在第3天观测到的信号是人工产物(或假象)，即 在所测量样品中的非特异性浊度。AZCL-直链淀粉图13示出了用涂布有AZCL-直链淀粉的种子获得的结果。结果表明，在已经深翻甜菜根种子2天以后，仍然可以明显地检测到AZCL-直链淀 粉的存在。在发芽4天和7天以后，测量值并不显著高于对照，并且发现结果中有许多变化。 对于独行菜，发芽1-2天以后仍然可以检测。根据结果，显而易见的是，基于漆酶的本发明的光标记构思提供了最好的结果。虽 然这种构思未加以优化，但在种子已发芽数天以后漆酶仍然是可检测的。综上所述，可以说，已开发了功能光标记构思。该构思包括BioSwitch基质、标记 化合物以及结合于化合物的检测的释放机制。作为标记化合物，可以使用，例如，酶、酶的底 物、或荧光的有色化合物。可以以两步反应来进行释放和检测，该两步反应将伪冒的威胁降 低到最小程度。此构思使得能够标记单独的种子。如通过最初的现场试验所表明的，可以 在发芽深翻经涂布的种子一定时间以后进行标记化合物的检测。有趣的是，该构思使得可以使用各种标记。这使得最终用户可以施用标记的不同 组合来具体地标记种子，例如来自一定的地表以上的土地(land aerial)、一定的种子类型 或一定的收获。此外，不同的使用者可以使用不同的标记来标记他们自己的种子。
权利要求
用于标记对象的方法，包括对所述对象施加包含交联聚合物和标记成分的微粒，其中，所述标记成分从所述微粒的释放通过所述微粒与外部刺激的接触被触发，以及其中，所述聚合物是碳水化合物或蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述外部刺激是能够降解所述聚合物的酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述标记成分的释放由静电相互作用的变化所 引起，由例如PH的变化、温度的变化、或盐浓度的变化所引起。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述聚合物选自由淀粉或淀粉的衍 生物、纤维素或纤维素的衍生物、果胶或果胶的衍生物、以及明胶或明胶的衍生物组成的 组。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，交联剂选自由二乙烯基砜、表氯醇、 双环氧化合物如丙三醇二缩水甘油醚或丁二醇二缩水甘油醚、三偏磷酸钠以及己二酸、或 它们的衍生物组成的组。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述聚合物通过选自由过氧化物酶、 漆酶、多酚氧化酶、转谷氨酰胺酶、蛋白质二硫键异构酶、巯基氧化酶、赖氨酰氧化酶以及脂 肪氧合酶组成的组中的交联酶或通过化学交联剂来交联。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述标记成分选自天然染料；发色团 或荧光或磷光化合物；具有特定NIR吸收或荧光谱的化合物；具有特定拉曼光谱的化合物； 酶标记，如漆酶、或任何其它酶，其不能降解所述微粒的所述聚合物；生物聚合物如核苷酸 序列；化合物如PH指示剂；以及上述的任何组合。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述酶是漆酶。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述聚合物是带电荷的。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述标记的对象选自服装、鞋、香 烟、手表、银行票据、涂料、炸药、医药产品、食品、化妆品、动物以及农产品如(盆栽)植物、 插条、组织培养材料以及种子。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述对象是种子。
12.用于鉴定对象的方法，包括以下步骤a.使用根据权利要求1-11中任一项所述的方法来标记所述对象；b.通过施加适当的外部刺激以从所述微粒释放所述标记成分来鉴定所述对象；以及c.对所述标记成分进行测定。
13.包含交联聚合物和标记成分的微粒在用于标记对象中的应用，其中，所述标记成分 从所述微粒的释放通过所述微粒与外部刺激的接触被触发，以及其中，所述聚合物是碳水 化合物或蛋白质。
14.用于标记根据权利要求2以及4-11中任一项所述的对象或用于鉴定根据权利要求 12所述的对象的试剂盒，包含如在权利要求2以及4-9任一项中所定义的微粒；以及用于降解所述聚合物的酶。
15.用于标记根据权利要求3-7以及9-11中任一项所述的对象或用于鉴定根据权利要 求12所述的对象的试剂盒，包含如在权利要求3-7以及9任一项中所定义的微粒；以及用于释放所述标记成分的盐。
全文摘要
本发明涉及一种用于标记对象的标记系统，其中所述系统包含含有交联聚合物和标记成分的微粒，其中所述标记成分的释放通过微粒与外部刺激的接触被触发，以及其中所述聚合物是碳水化合物或蛋白质。
文档编号G09F3/00GK101874262SQ200880105742
公开日2010年10月27日 申请日期2008年7月4日 优先权日2007年7月6日
发明者兰道夫·彼得·哈佩, 约翰内斯·威廉默斯·莱昂纳德斯·博曼斯, 约翰内斯·威廉默斯·蒂默曼斯, 罗纳德·塔科·马里纳斯·范登杜尔 申请人:荷兰应用科学研究会(Tno)