专利名称：可留置的荧光显微内窥成像系统及成像方法
技术领域：
本发明涉及荧光显微以及内窥成像领域。具体涉及通过可留置的荧光显微 内窥成像系统获得人或动物体内动态荧光标记目标的图像的方法。
背景技术：
通常，为了观察使用荧光标记的生物组织或细胞，需要使用荧光显微镜、 荧光照相、或者荧光断层成像系统。为了介入观察体内空腔组织，需要使用医 用内窥镜。
荧光显微镜可以观察生物组织微观结构以及细胞，但局限于观察离体的 生物组织切片或离体培养的细胞，无法进行在体或者活体的荧光成像。
荧光照相以及荧光断层成像系统可以进行在体或者活体的荧光成像，但 只能够观察荧光的宏观分布，无法观察生物组织微观结构以及细胞。
医用内窥镜可以插入人或动物的空腔器官内进行观察，但不能观察生物 组织微观结构以及细胞，也不能够进行荧光成像。
基于激光共聚焦扫描显微镜的显微内窥成像系统近年来有国外期刊报道 使用激光共聚焦扫描显微镜改装的显微内窥成像系统，实现对在体或活体情况 下对生物组织微观结构或细胞的荧光成像。但成本较高，技术复杂，难以快速 调节，难于推广；而且只能进行一次观察，难于长时间反复对同一特定位置进 行观察，因此无法进行较长时间的连续观察和对比研究。因此可见，实际应用中，有着对于进行在体或活体观察生物组织微观结构 以及细胞荧光标记图像，以及长期、反复的观察的实际需要。因此新型可留置 的荧光显微内窥成像系统及成像方法在实际应用中具有切实的意义和需求。
发明内容
本发明的目的在于，提出一种新的荧光成像系统。
本发明的特征在于，含有激发光产生部、主光路及荧光拍摄部、激发光 及荧光传递部、以及介入及留置部，其中
激发光产生部，含有光源、激发光滤光片以及透镜组，其中-光源，为大功率LED，
激发光滤光片，为带通滤光片，中心波长与带宽和待观察荧光目标的激发 谱相匹配，
透镜组，用以实现由所述大功率LED发出，并经过所述激发光滤光片后的
光束的准直，
主光路与荧光拍摄部，含有依次水平放置且和所述传像光纤束后端面一 起组成主光路的CCD器件、荧光滤光片、二向色镜以及显微物镜，其中
CCD器件，为低温制冷CCD器件，用于对微弱荧光信号的探测， 荧光滤光片，为带通滤光片，中心波长、带宽与活体动物待观测荧光目标
的荧光发射谱相匹配，且其通带范围与所述激发光滤光片的通带范围不交叠，
以便滤除激发光波段的光线，
二向色镜，在与所述主光路光轴成45度的同时也与所述激发光产生部产生
的用于激发荧光标记目标的窄谱带激发光光轴成45度角，使得所述主光路光轴与所述窄谱带激发光光轴成正交，该二向色镜的转折波长介于所述激发光滤光 片和所述荧光滤光片的通带范围的间隔内，以便反射所述激发光波段的光子且 透射所述荧光波段的光子，
激发光及荧光传递部，含有传像光纤束、传像光纤束固定装置、传像光 纤束连接件外套、以及传像光纤束连接件内卡环，其中
传像光纤束，为20cm 100cm长的柔性传像光纤束，两端各有3cm 5cm 长的硬质护套，外径小于lmm，两端光学平面抛光处理，内部纤丝间距小于 10跳
传像光纤束固定装置，开有中心孔，用于固定所述传像光纤束的后端面， 光纤连接件外套与所述传像光纤束内卡环之间通过精密螺纹连接，以保证 活体动物的被观察位置与插入所述传像光纤束连接件外套之内的所述传像光纤 束的前端面共轭，使得活体动物的组织内被观察位置的荧光图像能清晰成像于 所述传像光纤束的前端面，
介入及留置部，是一个自聚焦透镜，外径小于lmm，插入所述光纤连接件 外套的孔内，介入活体动物体内，与所述组织上被观察部位直接接触，由所述 传像光纤束前端面把激发光汇聚到所述组织的被观察部位，同时，把所述组织 被观察部位的荧光成像于所述传像光纤束前端面，该自聚焦透镜是通过一个穿 刺产生的小于lmm的微创口置于活体动物的体内被观察部位的，
所述的CCD器件、传像光纤束后端面，相对于所述的显微物镜共轭。 相比于现有的荧光成像系统的实际应用，新的荧光显微内窥成像系统具有 明显的优势。和荧光显微镜一样，新的系统能够观察组织微观结构和细胞。和 常规的荧光照相和荧光断层成像系统一样，新的系统能够进行在体或者活体的观察。而且新系统单位面积激发光能量更高，因此易于实现高速视频采集，以 观察荧光标记目标的动态变化。新的系统的可留置设计，可以在长时间内对人 或动物同一位置进行观察。相比于常规的荧光照相和荧光断层成像系统，在激 发光源与荧光探测器方面有着明显的节省。相比于已有的各类系统，本发明具
有若干优势。该系统还可以通过更换GRIN透镜、传像光纤束以及物镜调整放 大倍数和空间分辨率；可以通过切换激发光源、激发光滤光片、二向色镜、和 荧光滤光片支持各种荧光染料、量子点、荧光蛋白等荧光标记物的成像应用。
图1示出了本发明的部件示意图，其中各部件说明如下
1、 GRIN透镜(或称自聚焦透镜、梯度折射率透镜)
2、 光纤连接件外套，
3、 光纤连接件内卡环，
4、 传像光纤束，
5、 光纤固定装置，
6、 显微物镜，
7、 二向色镜(或称分色片)、或者分光平片(或称半透射半反射镜)，
8、 荧光滤光片，
9、 透镜或透镜组，
10、 光源，
11、 激发光滤光片，
12、 CCD (电荷耦合器件
具体实施例方式
该系统包含至少一个或多个光源(光源为激光器、大功率LED (发光二极
管)、激光二极管或其他灯具，也可以是光纤从外部其他光源导入的光，优选的
为大功率LED)、激发光滤光片、荧光滤光片、和二向色镜组。所述光源、激发 光滤光片、荧光滤光片、与二向色镜共同配合，将在与对应的荧光标记物的激 发波长下工作。
该系统在应用时，通过手术器械的工作腔或注射器针头的内腔，将GRIN 透镜插入待观察的人或动物组织内。需要长期固定观察位置时，可将GRIN透 镜插入端留置于人或动物组织内，另一端暴露于人或动物组织外，与人或动物 组织之间通过外科手术固定(使用骨水泥、生物胶、或者缝合等方法)。
该系统通过光源前方的透镜和显微物镜的配合，将激发光汇聚导入传像光 纤束，并通过传像光纤束传递进入GRIN透镜，进而照射到生物组织表面，激 发荧光。荧光再通过GRIN透镜和传像光纤束，经由显微物镜放大，并最终由 CCD (电荷耦合器件)探测。
该系统通过GRIN透镜与传像光纤束之间的固定和调节机构，完成GRIN 透镜与传像光纤束端面距离的调节，以实现对于成像物距(人或动物组织与 GRIN透镜插入端面可能存在的间隙)的适应。并且可以通过该固定和调节机构， 实现GRIN透镜与系统其他部分的快速分离与组装，方便GRIN透镜的留置以及 反复观察。
图1示意性表示了本发明的荧光显微内窥成像系统，具体各部分说明如下 激发光产生模块
此模块包括光源IO、激发光滤光片ll、透镜或透镜组9，产生用于激发荧光标记目标的窄谱带激发光，整形为合适的光束形状并送入系统主光路(下文 介绍)，送入系统主光路的激发光束与主光路光轴正交。
其中光源10可以为激光器、大功率LED (发光二极管)、激光二极管、或 其他灯具，也可以是光纤从外部其他光源导入的光，优选的为大功率LED。
其中激发光滤光片11为带通滤光片，其中心波长以及带宽的选择应当与待 观测荧光目标的激发谱相适应。
其中透镜或透镜组9，在使用激光器作为光源时，需要实现光束的扩束， 为透镜组构成的激光扩束镜；在使用其他光源时，需要实现光束的准直，为单 透镜或透镜组。
主光路及荧光拍摄模块
此模块包括CCD (电荷耦合器件)12、荧光滤光片8、 二向色镜7、显微 物镜6，用于将激发光汇聚导入传像光纤束4，并同时将传像光纤束传出的荧光
图像放大成像并采集。
其中包括CCD (电荷耦合器件)12可以为科学用低温制冷CCD、或者民 用CCD，优选的为科学用低温制冷CCD，以提供更宽的动态范围、更高的信噪 比以及更高的感光效率，更加有利于对于微弱荧光信号的探测。
其中荧光滤光片8为带通滤光片，其中心波长与带宽的选择应当与待观测 荧光目标的荧光发射谱相适应，并且其通带范围与激发光滤光片的通带范围不 可交叠，用以滤除激发光波段的光线。
其中二向色镜(或者分光平片)7在光路中成45度放置(与主光路光轴和 激发光产生模块的光轴均成45度角)，用以反射激发光波段的光子并且透射荧 光波段的光子，当使用二向色镜时，其转折波长应介于激发光滤光片和荧光滤光片的通带范围之间，优选的为二向色镜。 激发光及荧光传递模块
此模块包括传像光纤束4、光纤固定装置5、光纤连接件外套2、和光纤连 接件内卡环3。以下说明中，以"前端面"表示传像光纤束靠近GRIN透镜1的一 端端面，以"后端面"表示传像光纤束靠近显微物镜的一端端面。
传像光纤束4为20cm 100cm长的柔性成像光纤束，两端各有长度为 3cm 5cm的硬质护套，以便于夹持和固定，外径小于lmm，两端光学平面抛 光处理，内部纤丝间距小于lO)om，优选为2拜或以下，以实现更高的空间分辨 率。在特殊应用场合下传像光纤束长度可以为100cm以上，但是过长的光纤长 度将导致更多的光强衰减以及加工时更高的断丝率。
光纤连接件外套2和光纤连接件内卡环3为配套结构，外套可以与GRIN 透镜l实现简单快速的固定或拆除，内卡环与传像光纤束4固定，外套与内卡 环之间通过精密螺纹连接，同时借助此精密螺纹保证人或动物组织被观察位置 与传像光纤束4的前端面共轭，也即保证组织被观察位置的荧光图像能够清晰 成像于传像光纤束前端面。
介入及留置模块
此模块只包括GRIN透镜1，外径小于lmm，长度依被观察组织的深度而 定，用以介入人或动物体内，与组织被观察部位直接接触，从传像光纤束4前 端面将激发光汇聚到组织被观察部位，同时将组织被观察部位的荧光成像于传 像光纤束4的前端面，将此模块通过一个穿剌产生的小于lmm的微创口置于人 或动物体内的被观察部位，如需要留置以便长时间反复观察，则使用骨水泥、 生物胶或者手术缝合等方式固定于微创口内，保持一端与被观察部位接触，另一端暴露于微创口之外，以方便光纤连接外套2与其连接。 成像操作方法
1、 根据成像针对的荧光标记目标光谱学特征，切换为对应的光源、激发光 滤光片、荧光滤光片和二向色镜。
2、 使用穿刺针或注射器对人或动物待观察部位进行穿刺，如果进行动物脑 部观察，需要进行开颅手术操作。通过穿剌针或注射器的内腔将GRIN透镜送 达待观测部位，取出穿剌针或注射器，将GRIN透镜留置于待观察部位。
3、 如果需要长时间反复观察此特定部位，则使用骨水泥、生物胶、或者手 术缝合等方法将GRIN透镜固定于微创口处；如果只需要进行单次观察，则可 以跳过此步骤。
4、 将光纤连接件外套安装于GRIN透镜暴露于微创口外的一端，通过光纤 连接件外套与内卡环之间的精密调节螺纹调焦(调节人或动物被观测组织与传 像光纤束的前端面相对于GRIN透镜共轭)。
5、 使用CCD (电荷耦合器件)进行单帧图像的拍摄或连续的视频采集。
权利要求
1、可留置的荧光显微内窥成像系统，其特征在于，含有激发光产生部、主光路及荧光拍摄部、激发光及荧光传递部、以及介入及留置部，其中激发光产生部，含有光源、激发光滤光片以及透镜组，其中光源，为大功率LED，激发光滤光片，为带通滤光片，中心波长与带宽和待观察荧光目标的激发谱相匹配，透镜组，用以实现由所述大功率LED发出，并经过所述激发光滤光片后的光束的准直，主光路与荧光拍摄部，含有依次水平放置且和所述传像光纤束后端面一起组成主光路的CCD器件、荧光滤光片、二向色镜以及显微物镜，其中CCD器件，为低温制冷CCD器件，用于对微弱荧光信号的探测，荧光滤光片，为带通滤光片，中心波长、带宽与活体动物待观测荧光目标的荧光发射谱相匹配，且其通带范围与所述激发光滤光片的通带范围不交叠，以便滤除激发光波段的光线，二向色镜，在与所述主光路光轴成45度的同时也与所述激发光产生部产生的用于激发荧光标记目标的窄谱带激发光光轴成45度角，使得所述主光路光轴与所述窄谱带激发光光轴成正交，该二向色镜的转折波长介于所述激发光滤光片和所述荧光滤光片的通带范围的间隔内，以便反射所述激发光波段的光子且透射所述荧光波段的光子，激发光及荧光传递部，含有传像光纤束、传像光纤束固定装置、传像光纤束连接件外套、以及传像光纤束连接件内卡环，其中传像光纤束，为20cm～100cm长的柔性传像光纤束，两端各有3cm～5cm长的硬质护套，外径小于1mm，两端光学平面抛光处理，内部纤丝间距小于10um，传像光纤束固定装置，开有中心孔，用于固定所述传像光纤束的后端面，光纤连接件外套与所述传像光纤束内卡环之间通过精密螺纹连接，以保证活体动物的被观察位置与插入所述传像光纤束连接件外套之内的所述传像光纤束的前端面共轭，使得活体动物的组织内被观察位置的荧光图像能清晰成像于所述传像光纤束的前端面，介入及留置部，是一个自聚焦透镜，外径小于1mm，插入所述光纤连接件外套的孔内，介入活体动物体内，与所述组织上被观察部位直接接触，由所述传像光纤束前端面把激发光汇聚到所述组织的被观察部位，同时，把所述组织被观察部位的荧光成像于所述传像光纤束前端面，该自聚焦透镜是通过一个穿刺产生的小于1mm的微创口置于活体动物的体内被观察部位的，所述的CCD器件、传像光纤束后端面，相对于所述的显微物镜共轭。
2、 根据权利要求1所述的可留置的荧光显微内窥成像系统，其特征在于， 所述自聚焦透镜使用骨水泥粘接、生物胶粘接、或手术缝合方式中任何一种方 式固定在活体动物的微创口内的。
3、 根据权利要求1所述的可留置的荧光显微内窥成像系统，其特征在于， 所述传像光纤束内各纤丝间距小于2um。
4、 根据权利要求1所述的可留置的荧光显微内窥成像系统，其特征在于， 所述光源为激光器、激光二极管、灯、以及外部导入光中的任何一种。
5、 根据权利要求1所述的可留置的荧光显微内窥成像系统，其特征在于， 所述的CCD器件为民用CCD器件。
全文摘要
可留置的荧光显微内窥成像系统属于荧光显微技术领域，介入和留置部，是一个自聚焦透镜，插入活体动物的微创口内；激发光和荧光传递部，由光纤连接装置、传像光纤束、光纤束固定装置依次连接而成，该传像光纤束前端面与组织内被观察区域，相对于自聚焦透镜共轭；荧光拍摄部，依次由沿荧光发射主轴水平排列的显微物镜、二向色镜、荧光滤光片、及CCD器件组成，CCD器件与传像光纤束后端面相对于显微物镜共轭；激发光产生部，由光源、激发光滤光片、透镜组依次构成，激发光主轴与荧光发射光主轴正交，且均与二向色镜成45度角。本发明具有易于实现高速视频采集，以观察荧光标记目标的动态变化，也可长时间对活体动物同一位置进行连续观察。
文档编号G02B6/06GK101609207SQ20091008899
公开日2009年12月23日 申请日期2009年7月17日 优先权日2009年7月17日
发明者硕 毛, 净 白, 陈欣潇 申请人:清华大学