本申请要求于2013年11月25日提交的申请号为1320733.7的英国专利申请的优先权和权益。
技术领域
本发明的领域涉及用于使样本成像的光学布置。
背景技术：
显微镜是用于使对象成像的应用科学仪器，所述对象或者本身太小，或者具有太小以致裸眼无法可见的细节。市场上有许多类型的显微镜可用。其中最常见并且第一个发明的是所谓的光学显微镜，其利用透镜系统中的光线放大样本的图像。光学显微镜中的图像或者可以通过目镜观看，或者现在更普遍地，利用感光摄像头捕获以生成所谓的显微图。以前图像被捕获到胶片上，但现在电荷耦合器件(CCD)摄像头的发展允许捕获并存储数字图像。
用在光学显微镜中的照明光源已经发展了多年，并且目前有多种照明光源可用，其可发射不同波长的光线或其他类型的辐射线。为了限定照射样本的辐射线的波长，可以在照明光源和要成像的样本之间放置滤光片。
现代的生物显微术使用荧光探针用于使作为样本的细胞内的特定结构成像。相比正规的透照光显微术，荧光显微术中的样本通过采用窄组光波长的物镜进行照明。这些窄组光波长和样本内的荧光相互作用，然后发射不同波长的光。此所发射的光/发出的荧光用于构建样本的图像。
欧洲专利EP1019769(CarlZeissJena)教导了紧凑的共焦θ显微镜，其可以用作具有单物镜或双物镜系统的显微镜。显微镜具有单独的照明和检测方向，由此物镜中的检测方向相对于照明方向倾斜一个设置的角度。此设置的角度被选择，使得相比于常规的共焦显微镜，照明锥体和检测锥体的重叠面积减小。在显微镜的物镜和图像平面之间的光路径上，放置分光镜和反射镜，用于注入照明光和/或耦合出检测光。此专利中公开的显微镜使用点照明。
典型的光片显微镜的光学性能受到照明物镜和检测物镜的物理尺寸施加的几何约束条件的限制。光片显微镜的光学性能(对比度、光学分辨率以及聚光)依赖于照明物镜和检测物镜的数值孔径(NA)。
图1a和图1b示出了如本领域已知的光片显微镜的示例。照明物镜30产生照明光束40，其照亮样本20。辐射线60从样本20反射出来或发出荧光并进入检测物镜50，在此处利用检测器(未示出)测量并在计算机(未示出)上生成图像。所用的检测器典型地是CCD检测器。
检测物镜50的数值孔径(NA)限定了可进入检测物镜50中的光线的最大圆锥。数值孔径限定如下：NA＝n*sin(θdet)。对于多数光片显微镜来说，折射率n＝1.33(水)。θdet是可进入或射出检测物镜50的光线的最大圆锥的半角。
照明物镜30的照明光圆锥35和检测物镜50的检测光圆锥55对于垂直光片布置来说不可重叠。换句话说，角θill(照明光圆锥35的半角)和θdet(检测光圆锥55的半角)必须小于90°。检测物镜50和照明物镜30的机械外壳通常占据比数值孔径的特定数值所需的显著更大的圆锥。这导致了照明物镜30和检测物镜50的布置可以是次最理想的结果。
国际专利申请号WO2014/063764A1(KarlsruheInstitutfurTechnologie)教导了具有安装在样本台上或上方的照明透镜的显微镜。所述照明透镜引导以二维光片形式的至少一个照明光束，以照明样本台上的正在检查的样本。至少一个检测物镜被安装在样本下方并且检测从检测中的样本反射或发射的检测光束。照明透镜的光轴以相对于检测物镜的光轴大于90°的角度布置。优选地，一旦照明透镜的光轴外面的照明透镜处于某一入射角，则照明光束入射，使得光片位于检测物镜的焦点平面内。
此显微镜的布置要求在样本、照明光束源和检测透镜的布置上高度精确，以确保样本的图像可以用摄像头准确记录。
美国专利公布号US2012/0320438A1(Knebel等人转让给LeicaMicrosystemsGmbH)也教导了扫描显微镜，其包括光源、照明光学器件以及扫描装置，其用于跨目标区域移动照明焦点并通过改变照明光束进入照明光学器件的入射瞳孔的入射角的方向做到。照明透镜和检测物镜在样本台上以彼此间为锐角(小于90°)的角度安装并且位于与样本台平面垂直的平面上。
技术实现要素：
本公开教导了用于使样本成像的光学布置，所述样本安装在样本台上。光学布置包括用于产生照明的照明物镜和用于使来自样本的辐射线成像的检测物镜。照明物镜和检测物镜以彼此间为钝角(大于90°)的角度布置在样本台周围。在本公开的一个方面，所述照明为投影到所述样本上的一维光线的形式。
照明物镜和检测物镜放置在大致水平的平面上。
在本公开的一个方面中，光学布置进一步包括摄像头，其被放置在垂直于所述照明物镜与所述检测物镜的平面的方向，所述检测物镜与位于照明物镜的后平面上的可平移的照明光束生成器协同操作，以确保样本用平行于检测物镜的光轴的照明光片进行照明。控制处理器连接至摄像头和可平移照明光束生成器两者，以起到反馈回路的作用，以使照明光片处于正确位置上。
本公开的另外的方面具有另外的检测透镜，其以另外的非垂直于照明透镜的角度布置。在此另外的方面，另外的检测透镜、检测物镜和照明物镜以彼此间角度近似为等角布置。
可替代地物镜可用作照明物镜或检测物镜。
附图说明
图1示出了如本领域已知的光学布置。图1a是检测物镜和照明物镜的光锥的概览图并且图1b是其分解图。
图2示出了此公开的光学布置。图2a是光学布置的概览图。图2b示出了来自照明物镜和检测物镜的光锥的分解图。
图3示出了反射到照明物镜内的光源的示例。
图4示出了可用作照明物镜和检测物镜两者的三个物镜的示例。
具体实施方式
现在本发明将基于附图进行描述。将理解，本文描述的本发明的实施例和方面仅是示例并且并不以任何方式限制权利要求的保护范围。本发明用权利要求和它们的等价物进行限制。将理解，本发明的一个方面或实施例的特征可以和本发明的不同的一个或多个方面和/或实施例的特征进行组合。
图2a示出了根据本公开的一个方面的光学布置10的示例。照明物镜30生成照明光片40，其为样本台22上的样本20照明。照明物镜30具有照明光锥35和中心轴32。检测物镜50从样本20接收位于检测光锥55内并具有轴52的所辐射的射线或所发出的荧光射线。照明物镜30和检测物镜50两者都沉浸到用相同的沉浸介质22的相同的室内并且布置在样本台23(其并未分离照明物镜30和检测物镜50的沉浸介质22)周围。图2b示出了样本20周围区域的分解图。可以看到，照明物镜30以非垂直于检测物镜50的角度布置。尤其是，照明光片40的平面处于非垂直于检测物镜50的中心轴52的角度。非垂直轴为大于90°。在本发明的另一方面，照明物镜30生成线或线的阵列(一维照明)，其可通过移动样本台22跨样本20浏览。
样本20沉浸在沉浸介质22中并安装在样本台23上。沉浸介质22和制作样本台23所用材料具有相同的折射率。在光学布置10的一个非限制性示例中，沉浸介质22是水并且样本台23的材料是氟化乙丙烯(FEP)。
进入检测物镜50中的所反射的射线或发出的荧光射线在检测器100上成像并且图像在连接至检测器100的处理器110中进行处理。检测器可以是CCD检测器，但这并不是对本发明的限制。
图3更加详细示出了照明物镜30。辐射源36在照明物镜30的后焦平面34处生成光图案。此光图案62导致了样本20处的光片40或扫描光线。
可移动反光镜70将来自辐射源36的光图案62反射到偏心方向38的照明物镜30的后方，所述偏心方向38偏离照明物镜30的中心轴32。可移动反射镜70可被平移到位于由光图案62的照明路径和沿照明物镜30的中心轴32的反射光路径形成的平面内，以改变光图案62被反射到照明物镜30后方的方向。后焦平面34上的光图案62的平移引起光片(或扫描光线)40在物体空间内旋转，以便样本20处的光片40以大致垂直于检测物镜50的中心轴52的角度为样本20照明。此可移动反射镜70的平移可或者手动控制或者利用机动台90控制。
光片40(或扫描光线)的对准通过摄像头80监控，所述摄像头80垂直于照明物镜30和检测物镜50两者的平面放置。
摄像头80或者通过荧光溶液发射荧光或者通过在沉浸介质22(通常为水，如上所注释的，但也可以是例如空气或油)中散射光来使样本20的照明光束成像。由连接至摄像头80和机动台90的控制处理器95运行的自动图像分析可以用于确定照明平面和摄像头物体平面之间的角度差异。此角度差异可以通过计算机控制回路93最小化。
示例1
使用了尼康25x(或100x)检测物镜30和照明物镜50。照明物镜30的中心轴32和检测物镜50的中心轴52之间的角度为120°。为照明安装的标准光片具有0.3的NA值。根据本公开的教导的倾斜的光片安装具有0.6的数值孔径。
示例2
使用了尼康25x(或100x)检测物镜50和16x照明物镜30。照明物镜30的中心轴32和检测物镜50的中心轴52之间的角度为105°。相比用于现有技术的光学布置的点0.3的数值孔径，使用了此公开的光学布置10的光片具有0.6的数值孔径。
示例3
可替代地用尼康25x(或100x)物镜作为检查物镜50和照明物镜30。此总共得出了相同样本20的6个视图，而没有旋转或否则移动样本20。然后此6个不同的图像可以在计算机中处理以获得样本或任务的三维视图。这在图4中示出，其中示出了另外的物镜57并且三个物镜30、50和57以相对彼此大约为120°布置。另外的物镜57也安装在与检测物镜50和照明物镜30相同的平面上。
参考数字
10光学布置
20样本
22沉浸介质
23样本台
30照明物镜
32中心轴
34后焦平面
36光源
38偏心方向
40照明光片
50检测物镜
52轴
55检测光锥
57另外的物镜
60辐射源
62光图案
70可移动反射镜
80摄像头
90机动台
95控制处理器
100检测器
110图像处理器