一种结合光镊功能的扩展焦深显微成像系统的制作方法

本发明涉及显微成像、光镊领域，具体涉及一种结合光镊功能的扩展焦深显微成像系统。

背景技术：

在细胞生物学的研究中，经常需要同时对细胞中生物分子的力学、机械特性以及细胞三维结构同时进行研究。因此，实际研究过程中，通常采用光镊模块与荧光显微成像模块相结合的单分子力学显微系统进行实验。利用单分子力学显微系统对样品进行操作时，其中的光镊模块可以实现对生物细胞中单分子的动力学特性的测量，同时荧光显微成像模块可获取生物结构、细胞外或细胞内等多维度的信息。

利用单分子力学显微系统中的荧光显微成像模块实现样品实时的三维生物结构成像时，荧光显微成像模块通常使用全内反射显微镜或共聚焦激光扫描显微镜实现。2004年，langmatthewj等人在《naturemethods》期刊上发表题为《simultaneous,coincidentopticaltrappingandsingle-moleculefluorescence》的文章中提出了一种利用全内反射显微镜和光镊结合的单分子力学显微系统，全内反射显微镜利用全反射时光能量在光疏介质内穿透深度有限且光能量仅沿界面传播的特性，选择性的激发位于荧光表面的荧光标记，即通过捕获样品表面的倏逝波来获取样品表面的信息，倏逝波穿透深度在200纳米以下，所以全内反射显微镜不适用于微米量级的深度方向的扫描，因此无法实现微米量级生物样品的三维结构成像；同年，vossendirkl.j等人在《reviewofscientificinstruments》期刊上发表了题为《opticaltweezersandconfocalmicroscopyforsimultaneousthree-dimensionalmanipulationandimaginginconcentratedcolloidaldispersions.》的文章中提出了一种利用共聚焦激光扫描显微镜与光镊结合的单分子力学显微系统，而共聚焦激光扫描显微镜的聚焦平面是固定的，通过移动样品的微位移台或者操控物镜的位置可以实现样品深度方向的扫描。但是使用带有微位移台的共聚焦激光扫描显微镜，通过移动微位移台来实现对样品深度方向扫描时，随着样品台的垂直移动，光镊探测的粒子和压力传感器的连接会被中断，这就直接影响了单分子力学显微系统中光镊模块对分子力学和机械特性的测量；而保持微位移台固定，通过控制物镜在样品深度方向的位置来扫描不同深度的样品时，对于大数值孔径的物镜，这不适合对单分子进行荧光成像，同时在利用单分子力学显微系统对粒子进行捕获以及对分子力学和机械特性测量等操作时，也会因为物镜的移动导致捕获光的偏移，最后影响光镊捕获目标粒子。这些技术问题都很大程度的限制了单分子力学显微系统样品深度方向的扫描成像，导致其无法完成生物微结构的三维成像。。

技术实现要素：

本发明针对现有单分子力学显微系统对样品生物结构实时三维成像时存在的样品深度方向扫描深度有局限性的问题，提出了一种结合光镊功能的扩展焦深显微成像系统。该系统结合光镊可以对粒子进行精准的操控，并且在实现三维成像的同时没有机械振动引入的误差，成像质量更高、更快速稳定，成本也较低。

一种结合光镊功能的扩展焦深显微成像系统，包括：第一激光器、第一反射镜、第一分光镜、第一透镜、第二透镜、第一声光偏转器、第三透镜、第四透镜、第五透镜、第二声光偏转器、第六透镜、第二分光镜、第一二色镜、第二二色镜、第一物镜、样品台、第二物镜、第三二色镜、第三分光镜、第四分光镜、第五分光镜、第一四象限位置探测器、第二四象限位置探测器、位置探测器、led光源、第一探测器、第二激光器、第一柱面透镜、柱面透镜组、第四二色镜、扫描振镜、第一望远系统、电控透镜、第二望远系统、第二反射镜、第三望远系统、狭缝、第三反射镜、第二柱面透镜、第二探测器。

所述第一激光器输出光束经第一反射镜反射后入射到第一分光镜，第一分光镜将光束分成第一光束和第二光束；其中第一光束透射经过第一分光镜后，经第一透镜、第二透镜、第一声光偏转器、第三透镜后从第二分光镜反射到达第一二色镜；第二光束经第一分光镜反射后，经第四透镜、第五透镜、第二声光偏转器、第六透镜后从第二分光镜透射同样到达第一二色镜。第一光束和第二光束经第一二色镜反射、第二二色镜透射，最后由第一物镜聚焦到样品台上形成两个光势阱，对样品中的粒子进行捕获和测量；第一光束和第二光束经过样品后，由第二物镜收集经第三二色镜反射到达第三分光镜被分光；第一光束和第二光束中由第三分光镜透射的部分经第四分光镜透射到达第一四象限位置探测器，第一光束和第二光束中由第三分光镜透射的部分经第四分光镜反射到达位置探测器；第一光束和第二光束中由第三分光镜反射的部分经第五分光镜透射到达第二四象限位置探测器，第一光束和第二光束中由第三分光镜反射的部分经第五分光镜反射到达位置探测器；第一四象限位置探测器、第二四象限位置探测器、位置探测器并行工作可以测出光势阱精确三维位置。

所述第二激光器输出光束经第一柱面透镜扩束后到达柱面透镜组，被柱面透镜组一维整形后，从第四二色镜反射入射到扫描振镜上，经扫描振镜反射后经过第一望远系统、电控透镜、第二望远系统后由第二反射镜和第二二色镜反射到第一物镜，第一物镜将第二激光器输出光束聚焦到样品上，样品经第二激光器输出的光束照射激发产生荧光，荧光由第一物镜收集后，再分别经过第二二色镜和第二反射镜的反射，然后依次经过第二望远系统、电控透镜、第一望远系统，后经过扫描振镜反射、第四二色镜的透射入射到第三望远系统，第三望远系统中设有狭缝，狭缝将聚焦平面之外的荧光过滤后，经过第三望远系统准直、第三反射镜反射，再通过第二柱面透镜将荧光聚焦，最后经第二探测器收集并成像；所述led光源经第三二色镜、第二物镜后照明到样品上，后由第一物镜收集、第二二色镜和第一二色镜透射入射到第一探测器上成像。

本发明中，所述第一激光器、第二激光器均为点光源。

本发明中，所述第一、第二声光偏转器分别用于改变第一、第二光束的偏转角度，分别实现第一、第二光束的在样品中聚焦平面内聚焦位置的改变，即分别实现第一、第二光束在聚焦平面内的光势阱位置的调控。

本发明中，所述第一透镜和第四透镜在沿光路传播方向上的相对位置可以调节，其中调节第一透镜的位置可以操控第一光束聚焦于样品深度方向的不同位置，即调节第一光束聚焦平面的位置；调节第二透镜的位置可以操控第二光束聚焦于样品深度方向的不同位置，即调节第二光束聚焦平面的位置。

本发明中，所述第二透镜、第三透镜用于对第一光束进行准直，第五透镜、第六透镜用于对第二光束进行准直。

本发明中，所述第一二色镜对第一激光器输出的光束表现为高反。所述第二二色镜对第二激光器输出的光束以及荧光表现为高反，对第一激光器输出的光束表现为高透。所述第三二色镜对荧光表现为高反。所述第四二色镜对第二激光器输出光束表现为高反，对荧光表现为高透。所述的高透，是指透射率在98%以上；所述的高反，是指反射率在98%以上，具体为98%~99.9%。

本发明中，所述第一四象限位置探测器用于探测光势阱在样品聚焦平面方向上的水平坐标，第二四象限位置探测器用于探测光势阱在样品聚焦平面方向上的垂直坐标；位置探测器用于探测光势阱在样品深度方向上的位置。第一四象限位置探测器、第二四象限位置探测器和位置探测器并行工作可以确定光势阱精确的三维位置。

本发明中，所述柱面透镜组包含两个反向放置的柱面透镜，用于将从第二激光器输出的光束进行一维整形。

本发明中，所述一维整形是指柱面透镜对第二激光器输出光束只在一个方向有聚焦效应，使得第二激光器输出光束在样品中的聚焦平面内的聚焦光斑为线。

本发明中，所述扫描振镜用于实现对在样品聚焦平面内的样品的线扫描，其扫描方向在样品聚焦平面内与聚焦光斑的线垂直。

本发明中，所述电控透镜由电压控制，电控透镜电压小于阈值电压时，电控透镜表现为负透镜，经过电控透镜的出射光束呈发散状；电控透镜电压等于阈值电压时，电控透镜表现为平面镜，经过电控透镜的出射光束是平行光束；电控透镜电压大于阈值电压时，电控透镜表现为正透镜，经过电控透镜的出射光束呈会聚状；经过电控透镜的不同状态的出射光束最终会聚于样品的不同深度；以平行出射光束聚焦平面为基准面，呈会聚状出射的光束最终聚焦于基准面靠近第一物镜的一侧，呈发散状出射的光束最终聚焦于基准面靠近第二物镜的一侧。

本发明中，所述第一望远系统、第二望远系统和第三望远系统均包含两个反向放置的柱面透镜；其中，第一望远系统和第二望远系统，用于消除电控透镜引入的明显的放大率偏差，第三望远系统用于对荧光进行扩束准直。

本发明中，所述狭缝置于第三望远系统中的共焦面上，用于过滤扫描成像聚焦平面外的荧光，从而实现只对聚焦平面进行扫描成像。

本发明中，所述第一探测器为点阵ccd。

本发明中，所述第二探测器为线阵ccd，对荧光进行线性扫描成像。

本发明中，所述led光源用于照明样品，为实验过程中提供明亮视场。

作为优选，所述第一激光器输出光束的波长为1064纳米，生物样品对该波长吸收较小。

作为优选，所述第二激光器输出光束的波长为532纳米，可有效激发样品荧光。

作为优选，所述第一物镜选用奥林巴斯公司生产的型号为uplansapo的油浸物镜，放大倍率为100倍，数值孔径为1.4。

作为优选，所述第二物镜选用奥林巴斯公司生产的型号为lumplanfln的物镜，放大倍率为60倍，数值孔径为1.0。

作为优选，所述扫描振镜选用cambridgetechnology生产的型号为6231h的光学扫描振镜，线扫描宽度为15毫米。

作为优选，所述狭缝选用thorlab公司生产的型号为s100r的狭缝。

作为优选，所述第二探测器选用andor公司生产的型号为ixon3的高灵敏emccd相机。

相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：。

1、本发明将光镊系统与共聚焦激光扫描显微系统结合起来，在实现对粒子操控的同时也完成了对样品实时成像，系统结构紧凑。

2、本发明引入电控透镜实现对样品不同焦深的聚焦平面进行扫描，不会移动物镜也不会移动样品台，无机械振动，成像质量高，成像稳定，成本较低。

3、本发明利用多个柱面透镜以及线阵ccd实现对样品进行线扫描成像，扫描成像速度快、灵敏度高。

因此，本发明的技术方案与原有技术相比，在进行分子动力学特性测试的同时，能够实现无机械振动地对样品不同深度的生物样品进行快速扫描并完成三维成像。

附图说明

图1为本发明一种结合光镊功能的扩展焦深显微成像系统结构的一个实施例的光路图；

其中：1、第一激光器；2、第一反射镜；3、第一分光镜；4、第一透镜；5、第二透镜；6、第一声光偏振器；7、第三透镜；8、第四透镜；9、第五透镜；10、第二声光偏转器；11、第六透镜；12、第二分光镜；13、第一二色镜；14、第二二色镜；15、第一物镜；16、样品台；17、第二物镜；18、第三二色镜；19、第三分光镜；20、第四分光镜；21、第五分光镜；22、第一四象限位置探测器；23、第二四象限位置探测器；24、位置探测器；25、led光源；26、第一探测器；27、第二激光器；28、第一柱面透镜；29、柱面透镜组；30、第四二色镜；31、扫描振镜；32、第一望远系统；33、电控透镜；34、第二望远系统；35、第二反射镜；36、第三望远系统；37、狭缝；38、第三反射镜；39、第二柱面透镜；40、第二探测器。

图2为平行光束经过不同控制电压的电控透镜后呈现不同的出射状态；其中，图2a表示控制电压小于阈值电压时，电控透镜表现为负透镜，出射光束呈发散状，图2b表示控制电压等于阈值电压时，电控透镜表现为平面镜，出射光束是平行光束，图2c表示控制电压大于阈值电压时，电控透镜表现为正透镜，出射光束呈会聚状。

图3为电控透镜扫描控制电压的波形图。

图4为扫描振镜扫描电压的波形图。

具体实施方式

下面结合说明书附图来详细说明本发明，但本发明并不限于此。

如图1所示是本发明一种结合光镊功能的扩展焦深显微成像系统结构的一个实施例的光路图，该实施例的系统包括：

第一激光器1；第一反射镜2；第一分光镜3；第一透镜4；第二透镜5；第一声光偏振器6；第三透镜7；第四透镜8；第五透镜9；第二声光偏转器10；第六透镜11；第二分光镜12；第一二色镜13；第二二色镜14；第一物镜15；样品台16；第二物镜17；第三二色镜18；第三分光镜19；第四分光镜20；第五分光镜21；第一四象限位置探测器22；第二四象限位置探测器23；位置探测器24；led光源25；第一探测器26；第二激光器27；第一柱面透镜28；柱面透镜组29；第四二色镜30；扫描振镜31；第一望远系统32；电控透镜33；第二望远系统34；第二反射镜35；第三望远系统36；狭缝37；第三反射镜38；第二柱面透镜39；第二探测器40。

其中，第一激光器1为picoquant公司的ldh-ta-595型激光器，第二激光器27为picoquant公司的ldh-p-c-650b型激光器。

第一激光器1输出光束经第一反射镜2反射后，传播方向改变90°，入射到第一分光镜3，经第一分光镜3透射的光束为第一光束，经第一分光镜3反射的光束为第二光束。第一光束经过第一透镜4、第二透镜5后到达第一声光偏转器6，其中，第一透镜4在沿光路传播方向上的相对位置可以调节，通过调节第一透镜4的相对位置可以调节第一光束聚焦于样品深度方向的不同位置，即调节第一光束聚焦平面的位置；第一声光偏转器6可以操控第一光束的偏转角度，使其经过第三透镜7准直、第二分光镜12和第一二色镜13的反射以及第二二色镜14的透射后能够经第一物镜15聚焦于样品台16上样品聚焦平面方向上的任一位置；第一透镜4和第一声光偏转器6协调配合工作，可以调节第一光束聚焦于样品中三维的不同位置。第二光束经过第四透镜8、第五透镜9后到达第二声光偏转器10，其中，第四透镜8在沿光路传播方向上的相对位置可以调节，通过调节第四透镜8的相对位置可以调节第二光束聚焦于样品深度方向的不同位置，即调节第二光束聚焦平面的位置；第二声光偏转器10可以操控第二光束的角度偏转，使其经过第六透镜11准直、第二分光镜12的透射和第一二色镜13的反射以及第二二色镜14的透射后能够经第一物镜15聚焦于样品聚焦平面方向上的任一位置；第四透镜8和第二声光偏转器10协调配合工作，可以调节第二光束聚焦于样品中三维的不同位置。经过操控可以使第一光束和第二光束经第一二色镜13反射、第二二色镜14透射，最后由第一物镜15聚焦到样品台上样品中目标粒子附近形成两个光势阱，对粒子进行力学和机械特性的测量。第一光束和第二光束经过样品后，由第二物镜17收集经第三二色镜18反射到达第三分光镜19；由第三分光镜19透射的光束经第四分光镜20透射到达第一四象限位置探测器22，由第三分光镜19透射的光束经第四分光镜20反射到达位置探测器24，由第三分光镜19反射的光束经第五分光镜21透射到达第二四象限位置探测器23，由第三分光镜19反射的光束经第五分光镜21反射到达位置探测器24；第一四象限位置探测器22用于探测光势阱在样品聚焦平面方向上的水平坐标，第二四象限位置探测器23用于探测光势阱在样品聚焦平面方向上的垂直坐标；位置探测器24用于探测光势阱在样品深度方向上的位置。第一四象限位置探测器22、第二四象限位置探测器23和位置探测器24并行工作可以确定光势阱精确的三维位置。

第二激光器27输出光束经第一柱面透镜28扩束后，经过柱面透镜组29实现对第二激光器27输出光束一维整形，也即第二激光器27输出光束入射到第四二色镜30、扫描振镜31、第一望远系统32、电控透镜33、第二望远系统34、第二反射镜35、第二二色镜14的聚焦光斑以及最后由第一物镜15在样品中的聚焦平面内的聚焦光斑为线，同时样品发射荧光经第一物镜15收集入射到第二二色镜14、第二反射镜35、第二望远系统34、电控透镜33、第一望远系统32、扫描振镜31、第四二色镜30、第三望远系统36、第三反射镜38、第二柱面镜39的聚焦光斑变为线。如图3所示为扫描振镜31的扫描电压波形图，本实施例中，扫描振镜31的扫描频率为50赫兹；经过扫描振镜31反射的光束经第一望远系统32、电控透镜33、第二望远系统34、第二反射镜35、第二二色镜14最后经第一物镜15聚焦于样品台16上样品中对样品进行快速线扫描，其扫描方向在样品聚焦平面内且与聚焦光斑的线垂直。其间第二激光器27输出光束经过电控透镜33时，如图2所示，控制电控透镜33的电压可以改变从电控透镜33出射光束的状态。本实施例中，如图2a所示，电控透镜33电压小于3伏特时，电控透镜33表现为负透镜，从电控透镜33出射光束呈发散状；如图2b所示，当电控透镜33电压等于为3伏特时，电控透镜33表现为平面镜，从电控透镜33出射光束是平行光束；如图2c所示，电控透镜33电压大于3伏特时，电控透镜33表现为正透镜，从电控透镜33出射光束呈会聚状；不同状态的出射光束最终会聚于样品的不同深度，以平行出射光束的聚焦平面为基准面，呈会聚状出射光束最终聚焦于基准面靠近第一物镜15的一侧，呈发散状出射光束最终聚焦于基准面靠近第二物镜17的一侧。如图4所示，本实施例中，电控透镜33的扫描控制电压频率为10赫兹，当对电控透镜33的扫描控制电压以10赫兹的频率在-3伏特和3伏特之间扫描时，可以实现在样品的不同深度的聚焦平面的快速线扫描。同时控制扫描振镜31的扫描频率为50赫兹和电控透镜33控制电压的扫描频率为10赫兹，可以完成对样品的三维快速扫描。经过快速扫描的样品激发出的荧光，经第一物镜15收集，然后依次经过第二二色镜14、第二反射镜35、第二望远系统34、电控透镜33、第一望远系统32、扫描振镜31、第四二色镜30、第三望远系统36、第三反射镜38，最后经第二柱面镜39聚焦到第二探测器40上进行实时三维成像。

led光源25经第三二色镜18后被第二物镜17会聚到样品上，后由第一物镜15收集、第二二色镜14和第一二色镜13透射入射到第一探测器26上探测成像，其中led光源25经第二物镜17会聚到样品上可以为样品实时三维扫描成像提供视场。

最后需要说明的是，以上实施方式仅用以说明专利的技术方案而非限制，本领域的普通技术人员来说不脱离本专利原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这也应视为本专利的保护范围。