使用灰度掩模生产分离介质的制作方法
【专利说明】使用灰度掩模生产分离介质
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2013年9月24日提交的美国临时申请N0.61/881，879的提交日的优先权，以引用的方式将该临时申请的公开内容并入本文中。
[0003]政府支持的引用
[0004]本发明是在国家科学基金会授予的基金号1056035的政府支持下做出的。政府对本发明孚有一定的权利。
【背景技术】
[0005]SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)是广泛用于生物化学、细胞和分子生物学以及临床诊断的仅基于蛋白质大小对蛋白质进行分离的基本工具。通过将SDS分子与蛋白质结合来实现蛋白质大小的确定，涵盖了具有相同的相对于每单位质量的负电荷的不同的蛋白质。
[0006]为了实现多样化的功能，实验室芯片装置常包含具有空间上变化的性质的水凝胶。这些定制水凝胶在微流体通道网中的集成具有先进的实验室芯片性能。具体而言，非均匀的水凝胶提供了将制备功能和分析功能两者集成的途径(例如，样品富集、高分辨率的生物分子分离、样品固定/捕获)。用于空间上变化的水凝胶的当前的制造方案仍然缺乏灵活性:需要前体交换步骤或长的扩散时间以建立单体梯度。这些方案在本质上是缓慢的，并被约束到低复杂度至中等复杂度的几何体的有限子集。
【发明内容】
[0007]本发明提供了用于生产分离介质的方法，其中，该方法包括将分离介质前体溶液暴露至穿过光掩模的来自光源的光，以生产分离介质，该光掩模包含具有变化的透光率的区域。本发明还提供了用于实施该方法的系统、包含分离介质的微流体装置以及使用微流体装置的方法。发现了本公开的实施方式在众多不同应用中的用途，包括检测分析物是否存在于流体样品中。
[0008]本公开的实施方式包括用于生产空间上变化的分离介质的方法。该方法包括将分离介质前体溶液暴露至穿过光掩模的来自光源的光，以生产分离介质，该光掩模包含具有变化的透光率的区域。
[0009]在一些实施方式中，具有变化的透光率的区域是半透明的。
[0010]在一些实施方式中，所述方法进一步包括引导来自光源的光穿过光掩模和分离介质前体溶液之间的光扩散器。
[0011]在一些实施方式中，光掩模包含具有不同的透光率的两个以上的区域。
[0012]在一些实施方式中，光掩模的区域具有10%-90%的透光率。
[0013]在一些实施方式中，光掩模的区域具有40 % -90 %的透光率。
[0014]在一些实施方式中，光掩模具有O%-100%的透光率的线性梯度。
[0015]在一些实施方式中，光掩模具有10%-90%的透光率的线性梯度。
[0016]在一些实施方式中，分离介质前体溶液包含丙烯酰胺单体、交联剂和光致引发剂。
[0017]本公开的方面还包括通过本文所公开的方法生产的分离介质。
[0018]本公开的方面还包括微流体装置，该装置包含:支撑体；以及分离介质，该分离介质与支撑体接合并被配置用于沿导向轴(direct1nal axis)分离样品，其中，该分离介质具有均匀的组成并包含具有不同聚合度的区域。
[0019]在一些实施方式中，分离介质包括聚合凝胶。
[0020]在一些实施方式中，分离介质包括具有如下区域的邻接的聚合凝胶块(monolith)，该区域具有不同的密度。
[0021 ]在一些实施方式中，分离介质具有线性密度梯度。
[0022]本公开的方面还包括用于生产分离介质的系统。该系统包含:支撑体，该支撑体被配置用于容纳分离介质前体溶液;光掩模，该光掩模包含半透明区域；以及光源，该光源被配置用于引导来自光源的光穿过光掩模至分离介质前体溶液。
[0023]在一些实施方式中，光掩模包含具有不同透光率的两个以上的区域。
[0024]在一些实施方式中，系统进一步包含支撑体和光掩模之间的光扩散器。在一些实施方式中，在支撑体和光掩模之间不存在光扩散器。
[0025]在一些实施方式中，支撑体包含支撑体表面上的垫片，该垫片被配置用于容纳分离介质前体溶液。
[0026]在一些实施方式中，支撑体包含被配置用于容纳分离介质前体溶液的微通道。
[0027]本公开的方面还包括检测样品中的分析物的方法。该方法包括:将流体样品引入本文所述的微流体装置的分离介质中；引导样品穿过分离介质，以生产分离的样品；以及对分离的样品中的分析物进行检测。
[0028]在一些实施方式中，引导包括向分离介质施加电场。
[0029]本公开的方面还包括套件，该套件包括如本文所公开的微流体装置、以及容纳微流体装置的包装。
【附图说明】
[°03°]图1A示出了使用灰度掩模光致图案化(photo-patterning)的直接的梯度凝胶的示意图，其为基于梯度凝胶制造的扩散提供了高通量和设计灵活的替代方案。图1B示出了表明通过在灰度掩模和前体溶液之间插入摄影光扩散器(Rosco P#3010)而降低了来自激光打印灰度掩模的低分辨率点的图像。灰度激光打印掩模/光扩散器暴露设施能够可预测地在相对值的大范围内(例如，从0%到100%)减弱UV光。图1C示出了梯度凝胶形成的图像，通过加入荧光丙烯酰胺单体监测梯度凝胶形成的多个梯度斜率，以在沿灰度掩模的不同位置处获得相对的单体并入。
[0031]图2A示出了在具有美分硬币大小的区域中的24重(24-plex)圆形微流体装置的图像。图2B示出了以如下方式进行的24个通道注射的图像:将样品加入至中心存储部，向外侧存储部均匀地施加电势，使样品迀移至通道中。载样后，用Tris/甘氨酸缓冲液替换中心存储部中的剩余样品。由于Tris/甘氨酸和样品之间的电导率差异，发生Tris/HCl缓冲液瞬间等速电泳引起样品在各通道中起始进行堆积以及随后进行分离。图2C示出了将角度上变化的灰度掩模用于使圆形芯片内的通道差异性地图案化的图像。在全部通道内对荧光SDSPAGE梯带(I adder)进行分离，以确定最佳的凝胶条件。图2D示出了 60 % -O %梯度的图像，表明了对于80%和100%的凝胶梯度观察到的具有不完全的凝胶聚合的分离。
[0032]图3A-图3D示出了为了大阵列内的高分辨率的蛋白质大小分级而进行的96重SDS-PAGE梯度凝胶分离的图像。图3A示出了在96孔板的区域内用96个分离泳道制造的分离凝胶。各样品存储部间隔9mm，有利于使用多通道移液器递送样品。图3B示出了相较于包含荧光丙烯酰胺单体的经制造的梯度凝胶的灰度掩模的CAD图像。明显的不均匀性由成像系统中的非均匀性导致。图3C示出了使用四种荧光标记的物质在4分钟内进行的96重SDS PAGE梯度凝胶分离:牛血清白蛋白(BSA，65kDa，第2行、第7行)、卵白蛋白(OVA，45kDa，第I行、第8行)、胰蛋白酶抑制剂(TI，21kDa，第5行)、小白蛋白(PARV，12kDa，第4行)、以及包含全部四者的梯带(第3行和第6行)。图3D示出了防止从一个泳道污染至下一泳道的梯度凝胶阵列；相较于在均匀的20 %凝胶中的分离，示出了梯度凝胶中的5个邻接的梯带分离。在梯度凝胶中，样品在15分钟的分离中未受到污染，而在均匀的凝胶泳道中，早在4分钟时就可看到污染。
[0033]图4示出了本公开的实施方式所述的用于生产空间上变化的分离介质的方法的工艺流程示意图。
[0034]图5示出了本公开的实施方式所述的用于生产梯度分离介质的方法的工艺流程示意图。
[0035]图6A示出了灰度光掩模的示意图，该灰度光掩模包含用于75%灰度图案(S卩，25%透射率；图6A(顶部))和25%灰度图案(S卩，75%透射率；图6A(底部))的透光基板(白色区域)上的不透明材料(阴影区域)的网格图案。图6B示出了相对于灰度掩模值(灰度％)的透射光的相对强度(透射率％)的曲线图。图6C示出了光掩模的图像，该光掩模包含透光基板上所产生的具有不同灰度的区域。
[0036]图7A示出了本公开的实施方式所述的0%灰度(S卩，100%透射率)至100%灰度(即，0%透射率)的多种灰度掩模的图像。图7B示出了经放大以显示透光基板上的不透明材料的网格图案的20 %灰度掩模。图7C示出了相对于灰度值(灰度％ )的透射穿过灰度掩模的光的相对强度的曲线图。
[0037]图8A示出了用于测量根据本文所述方法生产的分离介质的刚度的应力流变仪的示意图。图SB示出了就在不同的UV光强度下生产的分离介质的流变仪刚度测试而言，相对于角频率(rad/s)的弹性模量(Pa)的曲线图。图SC示出了相对于UV光强度(mW)而言的在5rad/s下的弹性模量(Pa)的曲线图。
[0038]图9A示出了具有不同密度梯度的多种分离介质的示意图:例如50%梯度、60 %梯度、70%梯度、80%梯度、90%梯度以及无梯度。图9B示出了根据本文所述方法生产的多种分离介质梯度的相应的荧光图像。图9C示出了就使用本文所公开的方法生产的梯度分离介质而言的荧光图像(顶部)，以及相应的相对于在分离通道中的位置(像素)的相对荧光单位(RFU)的曲线图(底部)。
[0039]图1OA示出了根据本文所述的方法生产的梯度分离介质随时间而言的一系列荧光图像。图1OB不出了就样品焚光蛋白而g，相对于时间(s)的相应位点(mm)的曲线图(图10B，顶部)，以及相对于时间(s)的速度(μπι/s)的曲线图(图10B，底部)。图1OC示出了荧光蛋白带的放大视图，其示出了来自激光打印的灰度掩模的分离介质的像素图像(pixilat1n)。
[0040]图1lA示出了就具有0%灰度、10%灰度、20%灰度、30%灰度、40%灰度、50%灰度、60%灰度、70%灰度、80%灰度、90%灰度和100%灰度的灰度掩模而言，未使用扩散器而透射穿过多种灰度掩模的光的图像。图1lB示出了就具有0%灰度、10%灰度、20%灰度、30%灰度、40%灰度、50%灰度、60%灰度、70%灰度、80%灰度、90%灰度和100%灰度的灰度掩模而言，使用扩散器而透射穿过多种灰度掩模的光的图像。灰度掩模与扩散器的间距为1mm。图1lC(顶部)示出了未使用扩散器而透射穿过20%灰度掩模的光的放大图像，该图像示出了灰度掩模的像素图像。图1lC(底部)示出了使用扩散器而透射穿过20%灰度掩模的光的放大图像，该图像示出了在像素图像方面的明显降低。
[0041]图12示出了96重梯度的基于凝胶的分离装置的示意图，该装置包括串联布置的12个梯度分离介质的8个平行泳道的阵列。
[0042]图13(顶部)示出了就>0%至25%灰度、25%至45%灰度、45%至75%灰度和75%至〈100%灰度而言，用于确定本公开的实施方式所述的灰度掩模的不透明特征的尺寸的图示和附带公式。图13(底部)示出了 5%-95%线性梯度灰度掩模的实例的图示。
[0043]图14A示出了就Imm空间图案化而言，本公开实施方式所述的20% -80 %的铬线性梯度灰度掩模的图像。图14B(顶部)示出了两个20%-80%的灰度掩模的图像，该图像通过2倍的物镜拍摄并聚焦在掩模上。图14B(底部)示出了一个20%-80%的灰度掩模的图像，该图像通过10倍的物镜拍摄并聚焦在掩模上。图14C(顶部)示出了两个20%-80%的灰度掩模的图像，该图像通过2倍的物镜拍摄并聚焦在掩模上方的Imm处。图14C(底部)示出了一个20%-80%的灰度掩模的图像，该图像通过10倍的物镜拍摄并聚焦在掩模上方的Imm处。
[0044]图15示出了本公开的实施方式所述的生产用于单细胞分析的灰度凝胶的制造装备的不意图。
[0045]图16A示出了梯度凝胶的荧光图像，该图像示出了以凝胶密度计的梯度。图16B示出了就本公开实施方式所述的梯度凝胶而言，相对于位点(像素)的相对荧光单位(RFU)的曲线图。
[0046]图17A示出了本公开实施方式所述的通过TRITC荧光团可视的处于梯度凝胶上的微孔中的U373GFP表达细胞的图像。图17B示出了相应的相对于距离(像素)的灰度值的曲线图。
[0047]图18(顶部左侧)示出了本公开实施方式所述的迀移穿过90%_10%梯度聚丙烯酰胺凝胶(PAG)的分析物的荧光图像。图18(顶部右侧)示出了迀移穿过20%T均匀的PAG的分析物的荧光图像。图18(底部左侧)示出了就90%-10%梯度PAG而言，相对于时间(s)的速度(μπι/s)的曲线图，且图18(底部右侧)示出了就90%~10%梯度PAG而言，相对于位点(μπι)的速度(μπι/s)的曲线图。虚线表示对于具有所示的T%的均匀的PAG而言的相应值。
[0048]图19A示出了本公开实施方式所述的光掩模图案的图像，该光掩模图案包括300μπι长的均匀的70 %灰度区域以及300ym-lmm之间的70 % -1 %的灰度区域。图19B示出了在70%-1%梯度凝胶中的分析物分离的荧光图像。图19C示出了在12%T均匀凝胶中的分析物分离的荧光图像。
【具体实施方式】
[0049]本发明提供了生产分离介质的方法，其中，该方法包括将分离介质前体溶液暴露至穿过光掩模的来自光源的光，以生产分离介质，该光掩模包含具有变化的透光率的区域。本发明还提供了用于实施该方法的系统、包含分离介质的微流体装置以及使用微流体装置的方法。发现了本公开的实施方式在众多不同应用中的用途，包括检测分析物是否存在于流体样品中。
[0050]在更详细地描述本发明之前，将理解的是，本公开的方面并不局限于所描述的【具体实施方式】，因为这些【具体实施方式】当然可以变化。还将理解的是，由于本公开的实施方式的范围将仅由所附的权利要求限定，本文中使用的术语仅用于描述【具体实施方式】，而并不打算进行限定。
[0051]在提供了取值范围的情况下，应理解的是，在范围的上下限与在该所述范围内的任何其它所述值或中间值之间的各中间值(除非上下文中明确地另有所指，否则直至下限单位的十分之一)被涵盖在本公开的实施方式内。这些更小的范围的上限和下限可被独立地包含在更小的范围内并且被涵盖在本公开的实施方式内，受到在所述范围内的任何明确排除的端值的影响。在所述范围包括一个或两个端值时，排除一个或两个所含端值的范围也包括在本公开的实施方式内。
[0052]除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科技术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的含义相同的含义。虽然还可将与本文中所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料用于实施或检验本公开的实施方式，但是现在将对代表性的说明性方法和材料进行描述。
[0053]以引用的方式将本申请文件中引用的所有公开和专利并入本文中(如同各单独的公开或专利已被具体且单独地指明以引用的方式并入)，并以引用的方式并入本文中，从而公开和描述与所引用的公开相关的方法和/或材料。任何公开的引用是为了其在本提交曰之前的公开内容，并且不应当被解释为承认了本公开的实施方式无权凭借在先的发明而先于此类公开。此外，所提供的公开的日期可能与实际公开日期不同，这可能需要单独确认。
[0054]应注意的是，除非上下文中明确地另有指明，否则本说明书和所附的权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数的指代物。进一步应注意的是，权利要求可能被撰写为排除任何可选要素。这样，这一陈述旨在充当如下的在先基础:使用与权利要求要素的叙述有关的如“只”和“仅”等排他性术语或者使用“否定的”限制。
[0055]在阅读本公开时，对本领域技术人员来说显而易见的是，本文中描述和示出的各个实施方式各自具有离散的组件和特征，在不背离本发明的范围或精神的情况下，这些离散的组件和特征可容易地与任何其它