专利名称：纳米金颗粒在dna折纸芯片上的可控分布方法
技术领域：
本发明涉及的是一种纳米技术领域的分布方法，特别是基于非对称二维DNA折纸术芯片为模板，构建5nm纳米颗粒在DNA折纸芯片上的可控分布方法。
背景技术：
纳米金(nanogold)是指金的微小颗粒,其直径为I 一 IOOnm,—般为分散在水中形成的胶体溶液，故又称胶体金。在纳米金颗粒表面吸附着某种化学物质，单体纳米金颗粒是非常稳定的。金纳米粒子电子密度高，具有量子尺寸效应，小体积效应和表面效应，可以通 过静电引力、疏水效应等多种作用形式与大分子结合形成稳定的胶体金探针。在过去40多年来，纳米金颗粒已经被广泛应用于免疫细胞化学以及生物标记等生物技术中。2006年，加州理工大学的Rothemund提出、设计、并实现了 DNA折纸术。[RothemundPw. Nature2006,440, 297)。Rothemund在最初的文章中折出了六种图形，虽然各具特色，但不难发现它们全部是对称图形。DNA折纸术排布纳米金按照方式方法的不同大体可分为三类第一类是寡核苷酸杂交法。在纳米金颗粒上修饰某寡核苷酸链(实际一个金球表面会连很多链)，然后把它加入折纸术图形中，由于订书钉链上会伸出与该寡核苷酸链互补的探针，所以金球将通过核酸链的杂交而结合到图形的特定位置上[L。JD，PintoY，SeelllanNc, et al. Nano LetterS 2004,4,2343]。第二类是直接组装法。既然纳米金可以与DNA结合，那么就有可能让其直接参与折纸术图形自组装过程，自组装完成的同时，也就形成了这些小分子的排布[SharmaJ, ChhabraR, Andersen CS, et al. J AmChem Soc 2008，130，7820]。第三类是其他方法。其他连接纳米金的方法还有很多，比如Chengde Mao组开发的分子光刻法(molecular lithography)〔DengZ,Mao C. Angew Chem Int Ed Engl2004,43，4068〕，等等。公开文献记载了张钊等在先进材料上发表名为空间可寻址免索引的液相非对称DNA折纸芯片文章中公开了 DNA折纸芯片订书钉链序列表[zhaoz, Yingw, et al. AdyMater2010，22,1],该文利用仿中国地图形状的非对称二维DNA折纸术为模板，在模板上设计和引出特定的寡核苷酸序列作为连接位点，通过和修饰了互补序列DNA短链的生物素一亲和素系统杂交结合，把纳米粒子结合到折纸芯片上，同时，还对纳米粒子的结合位置进行了比较。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种纳米颗粒在DNA折纸芯片上的可控分布方法。本发明采用现有技术相同的DNA折纸芯片订书钉链序列表，方向是从左到右为5’一 3’。但是，本发明中模板上设计结合位点的位置和伸出特定的寡核苷酸序列在制备DNA折纸芯片时，需将带伸出寡核苷酸捕获探针的订书钉链替换列表中相同序列号的订书钉链即可。本发明通过利用寡核苷酸序列修饰和杂交的方法，在仿中国地图形状的纳米折纸术结构上连接5nm粒径胶体金颗粒,从而实现纳米颗粒在DNA折纸芯片上的可控分布。本发明是通过以下三种技术方案实现的技术方案一技术方案一包括步骤如下第一步，利用DNA折纸术构造一个非对称二维图形，制备DNA折纸芯片；所述的非对称二维图形，在特定位置的订书钉链末端伸出寡核苷酸捕获探针，让它与末端修饰5nm粒径胶体金颗粒的目标链一对一杂交。 所述的非对称二维图形是依靠M13mpl8噬菌体的单链DNA，长达7249个碱基脚手架长链光栅填充式的反复折叠形成的，而图形则来自用于绑定的229条短订书钉链。所述的DNA折纸芯片的制备方法(I)把所有要用的ΙΟΟμΜ订书钉链，包括形成非对称二维图形的、伸出探针的等体积混合，再稀释20倍备用；订书钉链伸出寡核苷酸捕获探针序列号为9。(2)在96孔板上混合总量为30 μ I的溶液0. 025 μ M订书钉链22 μ I ；1/2浓度的 M13mpl8 1 μ I ；I XTAE-Mg2+buffer :7 μ I。第二步，制备胶体金探针；第二步中所述的胶体金探针制备方法①寡核苷酸与5nm粒径胶体金摩尔浓度比200比I加入IOmM磷酸缓冲液中，室温300rpm摇24小时。②加入终浓度O.1M NaCl，室温300rpm摇48小时。③4°C, 15000rpm离心10分钟，弃上清。④加入IOmM磷酸缓冲液，终浓度O.1M NaCl清洗两次。⑤加入IxTE ；10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0，4°C保存。⑥5nm粒径胶体金探针浓度利用520nm波长紫外吸收峰测定。第三步，粒径胶体金探针与非对称二维图形DNA折纸芯片连接；第三步中所述的连接是指5nm粒径胶体金探针与非对称二维图形DNA折纸芯片摩尔浓度比2比I混合，37°C水浴杂交I小时。第四步，原子力显微镜成像；第四步中所述的原子力显微镜成像的步骤吸取2· 5μ I样品(实际2-5 μ I均可)滴到新切云母表面，吸附2分钟后即可拿到原子力显微镜下成像。统一使用轻敲模式，液相成像。原子力显微镜成像结果显示，采用技术方案一所述方法，纳米金颗粒在DNA折纸术图形上连接效率能达到10%左右。技术方案二考虑到连接在金胶颗粒上的寡核苷酸探针存在着大约50°C的活性温度阈值(meltingtemperature),低于该温度寡核苷酸探针吸附在金胶颗粒表面而丧失了大部分和捕获探针链链接的能力，结果导致连接效率很低。当杂交温度高于50°C时，仿中国地图折纸图形会出现局部热降解和不规则连接，失去原有形貌。所以杂交固定在靠近金颗粒底部寡核苷酸探针上，以避免寡核苷酸探针吸附在金胶颗粒表面影响连接效率。技术方案二包括步骤如下第一步，利用DNA折纸术构造一个非对称二维图形，制备DNA折纸芯片；所述的非对称二维图形是依靠M13mpl8噬菌体的单链DNA，长达7249个碱基脚手架长链光栅填充式的反复折叠形成的，而图形则来自用于绑定的229条短订书钉链。所述的DNA折纸芯片的制备方法(I)把所有要用的ΙΟΟμΜ订书钉链，包括形成非对称二维图形的、伸出探针的等体积混合，再稀释20倍备用； 订书钉链伸出寡核苷酸捕获探针序列号为9。(2)在96孔板上混合总量为30 μ I的溶液0. 025 μ M订书钉链22 μ I ；1/2浓度的 M13mpl8 1 μ I ；I XTAE-Mg2+buffer :7 μ I。第二步，制备胶体金探针；所述的胶体金探针，在胶体金探针连入地图之前，先将一个IOnt短链，在50°C时，杂交固定在靠近金颗粒底部寡核苷酸探针上。所述的胶体金探针制备方法包括以下步骤 ①寡核苷酸与5nm粒径胶体金摩尔浓度比200比I加入IOmM磷酸缓冲液中，室温300rpm摇24小时。②加入终浓度O.1M NaCl，室温300rpm摇48小时。③4°C, 15000rpm离心10分钟，弃上清。④加入IOmM磷酸缓冲液，终浓度O.1M NaCl清洗两次。⑤加入IxTE ；10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0，4°C保存。⑥5nm粒径胶体金探针浓度利用520nm波长紫外吸收峰测定。第三步，DNA短链与胶体金探针杂交；第三步中所述的杂交是指5nm粒径胶体金探针与IOnt DNA短链摩尔浓度比I比I混合，50°C水浴杂交I小时。第四步，粒径胶体金探针与非对称二维图形DNA折纸芯片连接；第四步中所述的连接是指5nm粒径胶体金探针与非对称二维图形DNA折纸芯片摩尔浓度比2比I混合，37°C水浴杂交I小时。第五步，原子力显微镜成像；第五步中所述的原子力显微镜成像的步骤吸取2. 5 μ I样品(实际2-5 μ I均可)滴到新切云母表面，吸附2分钟后即可拿到原子力显微镜下成像。统一使用轻敲模式，液相成像。原子力显微镜成像结果显示，采用技术方案二所述方法，纳米金颗粒在DNA折纸术图形上连接效率略有提高，能达到15%左右。技术方案三技术方案三包括步骤如下第一步，利用DNA折纸术构造一个非对称二维图形，制备DNA折纸芯片；
所述的非对称二维图形，在特定位置附近伸出三条订书钉链末端修饰寡核苷酸捕获探针，让它们与同一个末端修饰5nm粒径胶体金颗粒的报告探针链三对一杂交。所述的非对称二维图形是依靠M13mpl8噬菌体的单链DNA，长达7249个碱基脚手架长链光栅填充式的反复折叠形成的，而图形则来自用于绑定的229条短订书钉链。所述的DNA折纸芯片的制备方法(I)把所有要用的ΙΟΟμΜ订书钉链，包括形成非对称二维图形的、伸出探针的等体积混合，再稀释20倍备用；订书钉链伸出寡核苷酸捕获探针序列号为9，10，22。(2)在96孔板上混合总量为30 μ I的溶液0. 025 μ M订书钉链22 μ I ；1/2浓度的 M13mpl8 1 μ I ；I XTAE-Mg2+buffer :7 μ I。
第二步，制备胶体金探针；第二步中所述的胶体金探针制备方法①寡核苷酸与5nm粒径胶体金摩尔浓度比200比I加入IOmM磷酸缓冲液中，室温300rpm摇24小时。②加入终浓度O.1M NaCl，室温300rpm摇48小时。③4°C, 15000rpm离心10分钟，弃上清。④加入IOmM磷酸缓冲液，终浓度O.1M NaCl清洗两次。⑤加入IxTE ；10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0，4°C保存。⑥5nm粒径胶体金探针浓度利用520nm波长紫外吸收峰测定。第三步，DNA短链与胶体金探针杂交；第三步中所述的杂交是指5nm粒径胶体金探针与IOnt DNA短链摩尔浓度比I比I混合，50°C水浴杂交I小时。第四步，粒径胶体金探针与非对称二维图形DNA折纸芯片连接；第四步中所述的连接是指5nm粒径胶体金探针与非对称二维图形DNA折纸芯片摩尔浓度比2比I混合，37°C水浴杂交I小时。第五步，原子力显微镜成像；第五步中所述的原子力显微镜成像的步骤吸取2. 5 μ I样品(实际2-5 μ I均可)滴到新切云母表面，吸附2分钟后即可拿到原子力显微镜下成像。统一使用轻敲模式，液相成像。在折纸图形特定位置附近伸出三条订书钉链末端修饰寡核苷酸捕获探针，让它们与同一个末端修饰5nm粒径胶体金颗粒的报告探针链三对一杂交,再结合方案二，使得金颗粒空间位置得到有效控制同时增强了连接的稳定性。原子力显微镜成像结果显示，采用技术方案三所述方法，纳米金颗粒在DNA折纸术图形上连接效率明显提高，能达到95%以上。
具体实施例方式本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1检测条件本实施例采用DNA折纸术构造了中国地图的形状，原子力显微镜成像结果显示所得到的中国地图最长处约150纳米，最宽处约120纳米，高度为2纳米。此图形是依靠脚手架长链(M13mpl8噬菌体的单链DNA，长达7249个碱基)光栅填充式的反复折叠形成的，而地案则来自用于绑定的229条短订书钉链。此图形的特点是229条订书钉链就是两百多个可寻址的潜在反应位点，模版上的任何一点都可以利用图形自身作为参照精确定位，无需索引标记。另外，229条短DNA单链中的任意一条都可以伸出核苷酸序列作为捕获探针与带纳米颗粒标记的互补核苷酸序列进行杂交，作为折纸图形上纳米颗粒的连接点。在利用此非对称图形为模板形成纳米点分布时，利用模板复杂性来降低对纳米点分布的复杂性 要求。本实施例中所述的非对称二维图形，在特定位置的订书钉链末端伸出寡核苷酸捕获探针，让它与末端修饰5nm粒径胶体金颗粒的目标链一对一杂交。本实施例以中国地图为芯片基底，所有订书钉链，包括形成地图的、伸出探针的，全部从上海捷瑞公司订购(PAGE纯化)，且统一用二次水稀释到100 μ M备用。脚手架链使用NEB公司的M13mpl8病毒单链，货号N4040S。共7249base，浓度为O. 25 μ g/ μ 1，总5 μ g。由于0.42pmol，故浓度约O. 1ρΜ/μ I = O. ΙμΜ。实际稀释到1/2浓度使用。不用酶切处理，保持环链状态。5nm粒径胶体金颗粒使用Sigma公司，货号G1402。使用相同的反应buffer和成像buffer :在I X TAE (Tris，40mM ;乙酸，20mM ；EDTA, 2mM)中加入乙酸镁粉末，Mg2+终浓度为12. 5mM,pH8. O。使用美国Veeco/Digital Instruments公司的多模式原子力显微镜(Multimode AFM)观测。J-scanner, NP-S针尖,共振频率在7_10kHz之间。本实施例的纳米颗粒的可控分布实施步骤如下兎一制备仿中国地图形状DNA折纸芯片1.把所有要用的订书钉链(ΙΟΟμΜ)包括形成地图的、伸出探针的等体积混合，再稀释20倍备用。订书钉链伸出寡核苷酸捕获探针序列号为9。2.在96孔板上按照以下体系混合溶液(以下是最“节省”的体系，实际做时可以整体翻倍，或单独把脚手架链翻倍)订书钉链(O.025 μ Μ) 22 μ IM13mpl8 (1/2 浓度)I μ IIX TAE-Mg2+buffer7 μ ITotal30 μ I3.放在 PCR 仪(ABI 9700)上退火，95°C 降温至 20°C，0. 1°C /10s = 0. 6°C /min =rc /iooso第二制备5nm粒径胶体金探针1.寡核苷酸与5nm粒径胶体金颗粒摩尔浓度比200比I加入IOmM磷酸缓冲液中，室温300rpm摇24小时。2.加入终浓度0.1M NaCl，室温300rpm摇48小时。3. 4°C, 15000rpm 离心 10 分钟，弃上清。4.加入IOmM磷酸缓冲液，终浓度0.1M NaCl清洗两次。5.加入 IxTEdOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0)，4°C保存。
6. 5nm粒径胶体金颗粒探针浓度利用0D260测定。第三5nm粒径胶体金颗粒探针与仿中国地图形状DNA折纸芯片连接5nm粒径胶体金颗粒探针与仿中国地图形状DNA折纸芯片摩尔浓度比2比I混合，37°C水浴杂交I小时。第四原子力显微镜成像吸取2. 5 μ I样品(实际2-5 μ I均可)滴到新切云母表面，吸附2分钟后即可拿到原子力显微镜下成像。统一使用轻敲模式，液相成像。原子力显微镜成像结果显示，本实施例纳米金颗粒在DNA折纸术图形上连接效率能达到10%左右。
实施例2检测条件本实施例采用DNA折纸术构造了中国地图的形状，原子力显微镜成像结果显示所得到的中国地图最长处约150纳米，最宽处约120纳米，高度为2纳米。此图形是依靠脚手架长链(M13mpl8噬菌体的单链DNA，长达7249个碱基)光栅填充式的反复折叠形成的，而地案则来自用于绑定的229条短订书钉链。此图形的特点是229条订书钉链就是两百多个可寻址的潜在反应位点，模版上的任何一点都可以利用图形自身作为参照精确定位，无需索引标记。另外，229条短DNA单链中的任意一条都可以伸出核苷酸序列作为捕获探针与带纳米颗粒标记的互补核苷酸序列进行杂交，作为折纸图形上纳米颗粒的连接点。在利用此非对称图形为模板形成纳米点分布时，利用模板复杂性来降低对纳米点分布的复杂性要求。本实施例中考虑到连接在金胶颗粒上的寡核苷酸探针存在着大约50°C的活性温度阈值(melting temperature),低于该温度寡核苷酸探针吸附在金胶颗粒表面而丧失了大部分和捕获探针链链接的能力，结果导致连接效率很低。当杂交温度高于50°C时，仿中国地图折纸图形会出现局部热降解和不规则连接，失去原有形貌。所以杂交固定在靠近金颗粒底部寡核苷酸探针上，以避免寡核苷酸探针吸附在金胶颗粒表面影响连接效率。本实施例以中国地图为芯片基底，所有订书钉链，包括形成地图的、伸出探针的，全部从上海捷瑞公司订购(PAGE纯化)，且统一用二次水稀释到100 μ M备用。脚手架链使用NEB公司的M13mpl8病毒单链，货号N4040S。共7249base，浓度为O. 25 μ g/ μ 1，总5 μ g。由于0.42pmol，故浓度约O. 1ρΜ/μ I = O. ΙμΜ。实际稀释到1/2浓度使用。不用酶切处理，保持环链状态。5nm粒径胶体金颗粒使用Sigma公司，货号G1402。使用相同的反应buffer和成像buffer :在I X TAE (Tris, 40m ;乙酸，20m ；EDTA, 2m)中加入乙酸镁粉末，Mg2+终浓度为12. 5mM, pH8. O。使用美国Veeco/Digital Instruments公司的多模式原子力显微镜(Multimode AFM)观测。J-scanner, NP-S针尖,共振频率在7_10kHz之间。本实施例的纳米颗粒的可控分布实施步骤如下兎一制备仿中国地图形状DNA折纸芯片1.把所有要用的订书钉链(ΙΟΟμΜ)包括形成地图的、伸出探针的等体积混合，再稀释20倍备用。订书钉链伸出寡核苷酸捕获探针序列号为9。2.在96孔板上按照以下体系混合溶液(以下是最“节省”的体系，实际做时可以整体翻倍，或单独把脚手架链翻倍)订书钉链(O.025μΜ) 22 μ I
M13mpl8(l/2 浓度)Ιμ I X TAE-Mg2+buffer7 μ ITotal30 μ I3.放在 PCR 仪(ΑΒΙ 9700)上退火，95°C 降温至 20°C，O. 1°C/IOs = O. 6°C/min =rc /iooso第二制备5nm粒径胶体金探针
1.寡核苷酸与5nm粒径胶体金颗粒摩尔浓度比200比I加入IOmM磷酸缓冲液中，室温300rpm摇24小时。2.加入终浓度0.1M NaCl，室温300rpm摇48小时。3. 4°C, 15000rpm 离心 10 分钟，弃上清。4.加入IOmM磷酸缓冲液，终浓度0.1M NaCl清洗两次。5.加入 lxTE(10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0)，4°C保存。6. 5nm粒径胶体金颗粒探针浓度利用0D260测定。第三IOnt DNA短链与5nm粒径胶体金颗粒探针杂交5nm粒径胶体金颗粒探针与IOnt DNA短链摩尔浓度比I比I混合，50°C水浴杂交I小时。第四5nm粒径胶体金颗粒探针与仿中国地图形状DNA折纸芯片连接5nm粒径胶体金颗粒探针与仿中国地图形状DNA折纸芯片摩尔浓度比2比I混合，37°C水浴杂交I小时。第五原子力显微镜成像吸取2. 5μ I样品(实际2-5 μ I均可)滴到新切云母表面，吸附2分钟后即可拿到原子力显微镜下成像。统一使用轻敲模式，液相成像。原子力显微镜成像结果显示，本实施例纳米金颗粒在DNA折纸术图形上连接效率略有提闻，能达到15%左右。实施例3检测条件本实施例采用DNA折纸术构造了中国地图的形状，原子力显微镜成像结果显示所得到的中国地图最长处约150纳米，最宽处约120纳米，高度为2纳米。此图形是依靠脚手架长链(M13mpl8噬菌体的单链DNA，长达7249个碱基)光栅填充式的反复折叠形成的，而地案则来自用于绑定的229条短订书钉链。此图形的特点是229条订书钉链就是两百多个可寻址的潜在反应位点，模版上的任何一点都可以利用图形自身作为参照精确定位，无需索引标记。另外，229条短DNA单链中的任意一条都可以伸出核苷酸序列作为捕获探针与带纳米颗粒标记的互补核苷酸序列进行杂交，作为折纸图形上纳米颗粒的连接点。在利用此非对称图形为模板形成纳米点分布时，利用模板复杂性来降低对纳米点分布的复杂性要求。本实施例中在折纸图形特定位置附近伸出三条订书钉链末端修饰寡核苷酸捕获探针，让它们与同一个末端修饰5nm粒径胶体金颗粒的报告探针链三对一杂交,再结合方案二，使得金颗粒空间位置得到有效控制同时增强了连接的稳定性。本实施例以中国地图为芯片基底，所有订书钉链，包括形成地图的、伸出探针的，全部从上海捷瑞公司订购(PAGE纯化)，且统一用二次水稀释到100 μ M备用。脚手架链使用NEB公司的M13mpl8病毒单链，货号N4040S。共7249base，浓度为O. 25 μ g/μ 1，总5 μ g。由于1“8~0.42 11101，故浓度约0.1 1/^1 = 0.1^。实际稀释到1/2浓度使用。不用酶切处理，保持环链状态。5nm粒径胶体金颗粒使用Sigma公司，货号G1402。使用相同的反应buffer和成像buffer :在I X TAE (Tris，40mM ;乙酸，20mM ；EDTA, 2mM)中加入乙酸镁粉末，Mg2+终浓度为12. 5mM,pH8. O。使用美国Veeco/Digital Instruments公司的多模式原子力显微镜(Multimode AFM)观测。J-scanner, NP-S针尖,共振频率在7_10kHz之间。本实施例的纳米颗粒的可控分布实施步骤如下兎一制备仿中国地图形状DNA折纸芯片1.把所有要用的订书钉链(ΙΟΟμΜ)包括形成地图的、伸出探针的等体积混合，再稀释20倍备用。订书钉链伸出寡核苷酸捕获探针序列号为9，10，22。·2.在96孔板上按照以下体系混合溶液(以下是最“节省”的体系，实际做时可以整体翻倍，或单独把脚手架链翻倍)订书钉链(O.025 μ Μ) 22 μ IM13mpl8(l/2 浓度)Ιμ IX TAE-Mg2+buffer 7 μ ITotal30 μ I3.放在 PCR 仪(ABI 9700)上退火，95°C 降温至 20°C，0. 1°C /10s = 0. 6°C /min =rc /iooso第二制备5nm粒径胶体金探针1.寡核苷酸与5nm粒径胶体金颗粒摩尔浓度比200比I加入IOmM磷酸缓冲液中，室温300rpm摇24小时。2.加入终浓度0.1M NaCl，室温300rpm摇48小时。3. 4°C, 15000rpm 离心 10 分钟，弃上清。4.加入IOmM磷酸缓冲液，终浓度0.1M NaCl清洗两次。5.加入 lxTE(10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0)，4°C保存。6. 5nm粒径胶体金颗粒探针浓度利用0D260测定。 第三IOnt DNA短链与5nm粒径胶体金颗粒探针杂交5nm粒径胶体金颗粒探针与IOnt DNA短链摩尔浓度比I比I混合，50°C水浴杂交I小时。第四5nm粒径胶体金颗粒探针与仿中国地图形状DNA折纸芯片连接5nm粒径胶体金颗粒探针与仿中国地图形状DNA折纸芯片摩尔浓度比2比I混合，37°C水浴杂交I小时。第五原子力显微镜成像吸取2. 5μ I样品(实际2-5 μ I均可)滴到新切云母表面，吸附2分钟后即可拿到原子力显微镜下成像。统一使用轻敲模式，液相成像。原子力显微镜成像结果显示，本实施例纳米金颗粒在DNA折纸术图形上连接效率明显提高，能达到95%以上。DNA折纸芯片订书钉链伸出寡核苷酸捕获探针序列如下(直体部分是订书钉链，斜体部分是伸出寡核苷酸捕获探针，从左到右为5’ _3’，制备DNA折纸芯片时，替换相同序列号订书钉链)9CGCCTAGTTGGACGGCGACACAGGAGGTAGTGCCGTCGAGAGGG (用于技术方案一，二，三)10CGCCTAGTTGGACGGCGACACAGTACCAGGCGGATATTAGCGGG (用于技术方案三) 22CGCCTAGTTGGACGGCGACAGTTTTGCTAAGAGAAGGATTAGGAGAGGCTGA (用于技术方案三)IOnt DNA短链序列(从左到右为5’ _3’)CGCCTAGTTG巯基基团修饰报告探针序列(从左到右为5’ -3’ )
TGTCGCCGTCCAACTAGGCG-SH 以上实施例的原子力显微镜成像结果分别显示纳米金颗粒在DNA折纸术图形上连接效率能达到10% -15%，最高能达到95%以上。
权利要求
1.一种纳米颗粒在DNA折纸芯片上的可控分布方法，其特征在于，包括如下步骤第一步，利用DNA折纸术构造一个非对称二维图形，制备DNA折纸芯片，第二步，制备胶体金探针，第三步，DNA短链与胶体金探针杂交，第四步，粒径胶体金探针与非对称二维图形DNA折纸芯片连接，第五步，原子力显微镜成像，所述的非对称二维图形，在特定位置附近伸出三条订书钉链末端修饰寡核苷酸捕获探针，让它们与同一个末端修饰5nm粒径胶体金颗粒的报告探针链三对一杂交。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒在DNA折纸芯片上的可控分布方法，其特征是，所述的DNA折纸芯片，其制备方法如下(1)把所有要用的ΙΟΟμΜ订书钉链，包括形成非对称二维图形的、伸出探针的等体积混合，再稀释20倍备用；(2)在96孔板上混合总量为30μ I的溶液0. 025 μ M订书钉链22 μ I ;1/2浓度的 M3mpl8 :1 μ I ; I X TAE-Mg2+buffer :7 μ I。
3.根据权利要求1所述的纳米颗粒在DNA折纸芯片上的可控分布方法，其特征是，所述的胶体金探针，其制备方法①寡核苷酸与5nm粒径胶体金摩尔浓度比200比I加入IOmM磷酸缓冲液中，室温 300rpm摇24小时；②加入终浓度O.1M NaCl，室温300rpm摇48小时；③4°C，15000rpm离心10分钟,弃上清；④加入IOmM磷酸缓冲液，终浓度O.1M NaCl清洗两次；⑤加入IXTE ；10mM Tris-HCl，ImM EDTA, pH = 8. 0，4°C保存；⑥5nm粒径胶体金探针浓度利用520nm波长紫外吸收峰测定。
4.根据权利要求1所述的纳米颗粒在DNA折纸芯片上的可控分布方法，其特征是，所述的杂交是指5nm粒径胶体金探针与IOnt DNA短链摩尔浓度比I比I混合，50°C水浴杂交I 小时。
5.根据权利要求1所述的纳米颗粒在DNA折纸芯片上的可控分布方法，其特征是，所述的连接是指5nm粒径胶体金探针与非对称二维图形DNA折纸芯片摩尔浓度比2比I混合， 37°C水浴杂交I小时。
6.根据权利要求1所述的纳米颗粒在DNA折纸芯片上的可控分布方法，其特征是，所述的原子力显微镜成像是指吸取2-5 μ I样品滴到新切云表面，吸附2分钟后即可拿到原子力显微镜下成像。
全文摘要
本发明涉及一种纳米颗粒在DNA折纸芯片上的可控分布方法，其包括如下步骤第一步，利用DNA折纸术构造一个非对称二维图形，制备DNA折纸芯片；第二步，制备胶体金探针；第三步，DNA短链与胶体金探针杂交；第四步，粒径胶体金探针与非对称二维图形DNA折纸芯片连接；第五步，原子力显微镜成像；所述的非对称二维图形，在特定位置附近伸出三条订书钉链末端修饰寡核苷酸捕获探针，让它们与同一个末端修饰5nm粒径胶体金颗粒的报告探针链三对一杂交；本发明在极微量生化检测芯片研制，纳米器件开发，纳米粒子基本性质研究等学科领域具有广泛的应用空间。
文档编号C40B50/06GK103014145SQ201210362900
公开日2013年4月3日 申请日期2010年10月12日 优先权日2010年10月12日
发明者贺林, 李璨, 冯晓录, 陈培华 申请人:上海交通大学