本发明涉及一种腐植酸钾的制备方法。
背景技术：
：海藻中不但含有植物所需的大量元素、微量元素和多种矿物质，而且含有陆生植物少有的海藻酸以及天然植物生长调节物质等有效成分，以海藻为原料经过特殊生化工艺处理，提取并保留海藻天然活性成分，精炼浓缩而形成海藻肥料具有提高作物产量和品质，抵抗病虫害及不良环境以及改良土壤保持水土的功效，其应用于农业生产有巨大的市场需求和良好的发展前景。决定海藻肥质量的一个关键因素是提取工艺。不同的提取工艺对海藻肥活性成分的种类和含量影响巨大。目前，海藻活性成分的提取方法主要有化学法、物理法以及生物法。化学法主要是利用酸、碱及有机溶剂处理海藻细胞，使细胞消解或内源物质增溶，该方法操作简单，容易实现，也是国内外绝大多数海藻肥生产企业采用的方法。但是，化学试剂对海藻细胞内的活性物质成分的破坏是相当大的，并且残留的有机试剂对环境也是潜在的危害。物理法的原理是控制压力，温度等物理环境条件，利用机械力使海藻细胞破碎，内容物释放。该方法虽然工艺清洁、环境友好，但是对于仪器设备的要求严苛，反应条件变化剧烈，成本较高，难以实现大规模生产。生物法包括酶法降解和微生物发酵两种方法，其主要原理是破坏海藻细胞壁结构并降解大分子物质为植物容易吸收利用的小分子物质，该方法反应温和，产物多元化，整个生产过程安全环保无污染，是理想的海藻肥生产方法。利用微生物发酵法生产海藻肥料的研究相对较少，仅有的几例研究是选用多种微生物对海藻原料进行类似堆肥发酵或好氧发酵处理，存在发酵过程可控性差，发酵周期长，目标产物不明确等问题，难以满足工业化生产要求的统一，稳定，可控的标准，产品的质量难以保障。腐植酸是动植物遗骸经过微生物的分解和转化，以及地球化学的一系列过程积累起来的一类有机物质。腐植酸广泛存在于泥炭、褐煤、风化煤中，其主要元素组成为碳、氢、氧、氮、硫和少量的磷。腐植酸类物质具有改良土壤理化性能、提高肥料利用效率、刺激作物生长、增强作物抗逆性、改善农产品品质的功能。腐植酸钾采用天然含腐植酸的风化煤经化学提炼而成，它是多功能的高分子化合物，含有羟基，醌基，羧基等较多的活性基团，具有很大的内表面积，有较强的吸附，交换，络合，螯合能力。在农业中作为复合肥料，可改变土壤结构，对农作物起到防病抗病增产增收的效果。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是，提供一种含海藻活性成分的腐植酸钾的制备方法，制备过程稳定可控，发酵周期短，产物功效显著，适于规模化生产。该方法将海藻中活性成分与肥料、腐植酸钾结合，可提高作物抗病、抗逆性，提高作物产量。本发明生产的腐植酸钾水溶性好，质量稳定，水不溶物小于0.5%，水溶性腐植酸含量大于70%，可以用作多种水溶性肥料的原料。为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种含海藻活性成分的腐植酸钾的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行：1）、制备海藻粉末：将烘干后的海藻磨成粉末；2）、制备产品A和种子液：将海藻粉末与水按照质量比1～10:100分别装入发酵罐中，在100～150℃条件下灭菌15～35min，得到产品A；将巨大芽孢杆菌活化与扩培，制备巨大芽孢杆菌种子液X；将嗜糖芽孢杆菌活化与扩培，制备嗜糖芽孢杆菌种子液Y；3）、制备产品B：将种子液X接种到产品A中，种子液X用量为产品A质量的1%～10%，发酵温度为30～37℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为5～8，发酵时间为8～24h，得到产品B；4）、制备产品C：调整产品B的pH至4.0～5.5，发酵罐内温度至0℃～5℃，保存2～5天，然后将温度调整至20℃～35℃，得到产品C；5）、制备产品D：将种子液Y接种到产品C中，种子液Y用量为产品C质量的1%～10%，发酵温度为30～34℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为5～8，发酵时间为8～24h，得到产品D；6）、制备产品E：调整产品D的pH至4.0～5.5，发酵罐内温度至0℃～5℃，保存2～7天，然后将温度调整至25℃～35℃，得到产品E；7）、制备海藻提取液：将产品E压滤得到海藻渣及滤液，其中滤液为海藻提取液；8）、制备含腐植酸钾的海藻提取液：将腐植酸原料和硫酸钾分别加入海藻提取液中，腐植酸原料与海藻提取液固液比为2~5:10，硫酸钾与海藻提取液固液比为1~2:10，用氢氧化钾调整混合反应体系pH值至7.5~9.5；在1.5~2.0个标准大气压、58~62℃恒温条件下，搅拌反应2~3h，过滤除渣得到含腐植酸钾的海藻提取液；9）、制备含海藻活性成分的腐植酸钾：含腐植酸钾的海藻提取液经浓缩、干燥、粉碎之后得到含海藻活性成分的腐植酸钾。步骤2）中巨大芽孢杆菌的活化与扩培：液体培养基按照以下质量比配成：羧甲基纤维素钠10份、胰蛋白胨10份、磷酸氢二钾3份、磷酸二氢钠3份、氯化铁3份、氯化钠0.5份和蒸馏水1000份；巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为5:100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为20h；步骤2）中嗜糖芽孢杆菌的活化与扩培：液体培养基按照以下质量比配成：海藻酸钠5份、硫酸铵5份、硫酸镁1份、磷酸氢二钾2份、硫酸亚铁0.01份和蒸馏水1000份；嗜糖芽孢杆菌接种至液体培养基中，嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为5:100，，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为20h。步骤2）中所述海藻粉末和水的质量比为4:100，灭菌温度115℃，灭菌时间25min。步骤4）中，调整产品B的pH至5.0，发酵罐内温度至5℃，保存3天，然后将温度调整至20℃。步骤6）中，调整产品D的pH至5.0，发酵罐内温度至5℃，保存3天，然后将温度调整至25℃。所述的酸碱调节剂为柠檬酸，草酸，醋酸，磷酸氢二钾，碳酸钠，醋酸钠中的一种或任意比例的两种以上。所用的腐植酸原料是腐植酸含量大于50%的风化煤、褐煤，且粉碎至60-80目的煤粉。步骤1）中的海藻为铜藻、海带、鼠尾藻和马尾藻中的一种或者任意比例的两种以上。所述巨大芽孢杆菌是巨大芽孢杆菌YIC～BM1，保藏号为CGMCCNo.12156。所述嗜糖芽孢杆菌是嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3，保藏号为CGMCCNo.12155。发明具有以下有益技术效果：本产品海藻活性成分采用生物提取，所得海藻成分破坏少，提取率高，产品中所含海藻酸能够对土壤中重金属起到钝化作用，微生物降解产生的褐藻寡糖具有促生长与诱导植物抗逆的活性，能够在植物生长调节与诱导植物抗逆领域发挥重要作用，此寡糖分子量较小，能够在自然界中自行降解，不会对环境造成污染，而且此寡糖的有效剂量很低，适宜大范围使用。本发明还具有以下特点：1、本发明采用巨大芽孢杆菌YIC～BM1以及嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3对海藻发酵，能够破坏海藻细胞壁结构促使海藻体内更多营养物质得以释放，嗜糖芽孢杆菌具有降解褐藻酸的能力，能够降解褐藻酸生成小分子量的褐藻寡糖等易于植物吸收利用的营养成分，发酵过程稳定可控，发酵周期短，产物功效显著，适于规模化生产。2、本发明采用复合菌种发酵，各类菌株发挥协同作用，效果肥效均明显优于单一的菌种发酵，而且纯生物发酵，保证了海藻活性成分不受破坏。3、本发明采用的复合菌种发酵不同于简单的将不同的菌种种子液混合发酵，而是根据微生物的作用不同，按照先后次序依次分级发酵，避免了微生物菌群间的相互竞争拮抗，减少内耗，将各自菌群的作用发挥到最大化，保证了最好的效果。4、该产品将肥料、腐植酸钾与海藻有效成分结合，在提高作物的抗逆性和抗病性方面有显著效果，另外该产品全水溶，可以满足现代农业需求。具体实施方式下面结合具体实例进一步说明本发明。实施例1将洗净烘干后的新鲜鼠尾藻磨成50～60目粉末。海藻粉末与水按照质量比4:100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌25min，得到产品A。并制备种子液：种子液X的制备实例：将产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1接种至液体培养基，巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为5:100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为20h；活化之后按同样操作步骤扩培，得到种子液X；种子液Y的制备实例：将嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基，嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为5:100，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为20h；活化之后按同样操作步骤扩培，得到种子液Y；将种子液X加入到产品A中，其中种子液X与产品A的质量比为5:100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h，得到产品B；调整产品B的pH至5.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存3天，以每小时3℃的温度变化调整产品的温度至20℃，得到产品C；然后补充种子液Y，补充的种子液Y与产品C的质量比为5:100，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h，得到产品D；调整产品D的pH至5.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度温度至5℃，保存3天，以每小时3℃的温度变化调整产品D的温度至25℃，得到产品E；将产品E压滤后得到海藻提取液；向海藻提取液中加入液体比例20%的风化煤粉，10%的硫酸钾，用氢氧化钾调节pH至8.0，在1.5个标准大气压下搅拌反应2.5小时，经过滤浓缩干燥后粉碎即为本发明产品。所得腐植酸钾产品：腐植酸含量为77.82%,K2O为13.55%，水不溶物为0.27%。实施例2将洗净烘干后的新鲜铜藻磨成50～60目粉末；海藻粉末与水按照质量比4:100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌25min，得到产品A。并制备种子液：种子液X的制备实例：将产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1接种至液体培养基，巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为5:100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h；活化之后按同样操作步骤扩培，得到种子液X；种子液Y的制备实例：将嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基，嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为5:100，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h；活化之后按同样操作步骤扩培，得到种子液Y；将种子液X加入到产品A中，其中种子液X与产品A的质量比为5:100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h，得到产品B；调整产品B的pH至5.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存3天，以每小时3℃的温度变化调整产品的温度至20℃，得到产品C；然后补充种子液Y，补充的种子液Y与产品C的质量比为5:100，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h，得到产品D；调整产品D的pH至5.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度温度至5℃，保存3天，以每小时3℃的温度变化调整产品D的温度至25℃，得到产品E；将产品E压滤后得到海藻提取液；向海藻提取液中加入液体比例30%的风化煤粉，10%的硫酸钾，用氢氧化钾调节pH至8.5，在1.5个标准大气压下搅拌反应2.5小时，经过滤浓缩干燥后粉碎即为本发明产品。所得腐植酸钾产品：腐植酸含量为79.66%,K2O为13.72%，水不溶物为0.25%。实施例3将洗净烘干后的新鲜铜藻和新鲜马尾藻按照质量比1:1复配，磨成50～60目粉末；海藻粉末与水按照质量比4:100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌25min，得到产品A。并制备种子液：种子液X的制备实例：将产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1接种至液体培养基，巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为5:100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h；活化之后按同样操作步骤扩培，得到种子液X；种子液Y的制备实例：将嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基，嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为5:100，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h；活化之后按同样操作步骤扩培，得到种子液Y；将种子液X加入到产品A中，其中种子液X与产品A的质量比为5:100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h，得到产品B；调整产品B的pH至5.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存3天，以每小时3℃的温度变化调整产品的温度至20℃，得到产品C；然后补充种子液Y，补充的种子液Y与产品C的质量比为5:100，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h，得到产品D；调整产品D的pH至5.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度温度至5℃，保存3天，以每小时3℃的温度变化调整产品D的温度至25℃，得到产品E；将产品E压滤后得到海藻提取液；向海藻提取液中加入液体比例40%的风化煤粉，15%的硫酸钾，用氢氧化钾调节pH至8.5，在1.5个标准大气压下搅拌反应2.5小时，经过滤浓缩干燥后粉碎即为本发明产品。所得腐植酸钾产品：腐植酸含量为82.32%,K2O为13.93%，水不溶物为0.37%。实施例4将洗净烘干后的海带磨成50～60目粉末；海藻粉末与水按照质量比4:100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌25min，得到产品A。并制备种子液：种子液X的制备实例：将产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1接种至液体培养基，巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为5:100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h；活化之后按同样操作步骤扩培，得到种子液X；种子液Y的制备实例：将嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基，嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为5:100，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h；活化之后按同样操作步骤扩培，得到种子液Y；将种子液X加入到产品A中，其中种子液X与产品A的质量比为5:100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h，得到产品B；调整产品B的pH至5.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存3天，以每小时3℃的温度变化调整产品的温度至20℃，得到产品C；然后补充种子液Y，补充的种子液Y与产品C的质量比为5:100，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20%，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h，得到产品D；调整产品D的pH至5.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度温度至5℃，保存3天，以每小时3℃的温度变化调整产品D的温度至25℃，得到产品E；将产品E压滤后得到海藻提取液；向海藻提取液中加入液体比例50%的风化煤粉，20%的硫酸钾，用氢氧化钾调节pH至9.0，在1.5个标准大气压下搅拌反应3小时，经过滤浓缩干燥后粉碎即为本发明产品。所得腐植酸钾产品：腐植酸含量为86.22%,K2O为14.25%，水不溶物为0.33%。上述实施例中所用富含腐植酸原料为腐植酸含量为52%的风化煤。本发明所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的保藏号为CGMCCNo.12156；保藏单位名称是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2016年3月2日；拉丁文分类命名为：Bacillusmegaterium。所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的生物特性如下：YIC～BM1菌株在纤维素培养基平板上生长48h后，菌落圆形，白色，表面平整。显微镜观察菌株为革兰氏阳性，杆状，能运动，产芽孢。生长温度范围20～40℃，PH范围6-10，NaCl浓度范围0～20%，菌株最适生长温度37℃，最适生长pH7.5。触酶，氧化酶，半乳糖苷酶阳性，吲哚，VP实验阴性，不还原硝酸；能够利用葡萄糖，甘露糖，乳糖，棉子糖，蔗糖，阿拉伯糖，木糖，甘露醇，山梨醇。根据其生理生化特征，基因序列及系统发育树信息，将该菌株鉴定为巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium。本发明所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的保藏号为CGMCCNo.12155；保藏单位名称是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2016年3月2日；拉丁文分类命名为：Bacillushalosaccharovorans。所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的生物特性如下：YIC～Alg3菌株在褐藻酸唯一碳源平板上生长48h后，菌落不规则，淡黄色，中间不透明，边缘半透明，表面褶皱。显微镜观察菌株为杆状，在末端或近末端可产生芽孢，革兰氏阳性，能运动，生长后期菌体易聚集成团。生长温度范围20～45℃，PH范围6～9，NaCl浓度范围0～15%，菌株最适生长温度37℃，最适生长pH7.5。触酶，氧化酶，VP试验阳性，能够利用葡萄糖，甘露糖，甘露醇，果糖，乳糖，半乳糖，淀粉；不能利用山梨醇，纤维素。根据其生理生化特征，基因序列及系统发育树信息，将该菌株鉴定为嗜糖芽孢杆菌Bacillushalosaccharovorans。生化特性结果生化特性结果触酶+乳糖～氧化酶+半乳糖～VP试验+淀粉～葡萄糖+山梨醇～甘露糖+维生素～甘露醇+果糖+注：+表示可以利用，～表示不能利用。当前第1页1 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