一种芳香族醛/壳聚糖非共价修饰的碳纳米管复合材料的制作方法

本发明涉及一种芳香族醛/壳聚糖非共价修饰的碳纳米管复合材料，属于纳米材料科学领域。

背景技术：

酶是具有催化功能的大分子，与无机催化剂相比，具有催化效率高、专一性强等优点，广泛应用于食品、医药、化工和环境保护等领域。固定化酶相比于游离酶具有更广阔的实际应用空间，具有能重复利用、稳定性好、有利于生产的连续化和自动化等优点，载体材料的结构和性能对固定化酶的催化性能有着很大的影响，设计、开发和制备性能更加优异的载体材料已成为固定化酶研究的重点内容。

碳纳米管(CNT)管束具有非常大的比表面积，体系内碳原子形成高度离域的π电子体系，故其易于与含有π电子体系的化合物(如苯系化合物)发生非共价结合，具备优异的吸附性能。但是，由于碳纳米管之间具有非常强的范德华力，碳纳米管非常容易团聚，这种团聚行为严重限制了碳纳米管的应用，所以对碳纳米管进行表面修饰以改善其分散性显得非常重要。

目前，对碳纳米管表面修饰方法主要分为共价修饰和非共价修饰。共价修饰是指通过化学反应破坏碳纳米管结构，在碳纳米管表面引入新的基团。非共价修饰即为通过物理吸附作用，在碳纳米管表面引入有机高分子。共价修饰一般需要浓硫酸或浓硝酸作为氧化剂，反应条件苛刻，且破坏碳纳米管刚性结构。

壳聚糖(CS)是甲壳素脱乙酰作用后的产物，作为一种天然的有机高分子，其分子链中存在着大量的氨基和羟基，这种结构特性使其具有良好的生物相容性，成纤成膜性，吸附性，也为壳聚糖改性提供了条件，因而在众多领域应用广泛。另外，自然界中天然存在的很多芳香族醛具有特定的功能性质并可应用于食品中，例如，肉桂醛(CA)是GB2760-2011规定的允许使用的食品用合成香料，大量存在于肉桂等植物体内，分子结构为一个丙烯醛上连接上一个苯基。

技术实现要素：

本发明的目的是为制备一种对蛋白酶大分子负载性能好，且能高比率保持蛋白酶活性的载体材料。为此，本发明提供了一种制备芳香族醛/壳聚糖非共价修饰的碳纳米管复合载体材料的方法。

所述方法是首先采用芳香族醛对壳聚糖进行修饰，得到芳香族醛/壳聚糖交联产物，再应用芳香族醛/壳聚糖交联产物对碳纳米管进行非共价修饰得到碳纳米管复合载体。

在本发明的一种是实施方式中，芳香族醛接枝化壳聚糖之前，先对壳聚糖进行溶胀处理。对壳聚糖溶胀的醇类溶剂可以是甲醇、乙醇、丙醇等短链醇类。

在本发明的一种是实施方式中，所述芳香族醛包括肉桂醛、水杨醛或香草醛。

在本发明的一种是实施方式中，用芳香族醛对壳聚糖进行修饰，是将浓度为10％～50％的肉桂醛的醇溶液加入到浓度为1％～5％的壳聚糖的乙酸溶液中，在40～55℃恒温水浴条件下反应6～12h时间后，洗涤干燥得到肉桂醛接枝化壳聚糖。肉桂醛与壳聚糖游离氨基的物质的量比为0.5:1～6:1。

在本发明的一种是实施方式中，用芳香族醛对壳聚糖进行修饰时，优选肉桂醛与壳聚糖游离氨基的物质的量比为4:1。

在本发明的一种是实施方式中，对碳纳米管进行非共价修饰是将碳纳米管加入肉桂醛接枝化壳聚糖的乙酸溶液中，在超声条件下反应1.5～2h，离心分离，洗涤干燥得到肉桂醛/壳聚糖非共价修饰碳纳米管。肉桂醛接枝化壳聚糖与碳纳米管的质量比为1:1～4:1。

在本发明的一种是实施方式中，肉桂醛接枝化壳聚糖与碳纳米管的质量比为1:1。

在本发明的一种是实施方式中，具体合成方法如下：

1)壳聚糖前处理：取0.5～5g壳聚糖粉末置于10～50mL甲醇溶液中，超声0.5～1h，磁力搅拌溶胀10～14h。

2)肉桂醛接枝化壳聚糖：量取与壳聚糖中游离氨基的物质量比为0.5:1～6:1的肉桂醛于乙醇中，得到浓度为50％的肉桂醛的乙醇溶液，混合均匀后逐滴滴加到壳聚糖的甲醇溶液中，40～55℃恒温水浴条件下反应6～12h，抽滤，无水乙醇洗涤3次，真空干燥24h，所得产物即为肉桂醛接枝化壳聚糖。

3)肉桂醛/壳聚糖非共价修饰碳纳米管：取50～100mg上述肉桂醛接枝化壳聚糖分散于100ml、1～2％的乙酸溶液中，搅拌10～30min，按肉桂醛接枝化壳聚糖与碳纳米管的质量比为1:1～4:1加入碳纳米管，超声1.5～2h，磁力搅拌2h，溶液呈黑色均一相，离心去除底部未参与反应的沉淀，取上清液调节其pH至弱碱性，静置10min，溶液分层，抽滤，去离子水洗涤、真空干燥，所得产物即为肉桂醛/壳聚糖非共价修饰碳纳米管。可以用氨水或氢氧化钠溶液调节pH。

本发明的优点在于：

1)该方法工艺简单，制备周期短，反应条件温和，对设备要求不高，能耗低，适合工业化生产应用。

2)原料中肉桂醛、壳聚糖均为天然有机物，廉价易得，可生物降解，且不会对环境造成二次污染。

3)肉桂醛对壳聚糖改性所需条件温和，无需催化剂和交联剂，反应接枝度高，改性后的壳聚糖支链上存在苯基，增加了改性壳聚糖与碳纳米管的结合作用力。

肉桂醛/壳聚糖接枝产物对碳纳米管表面修饰，改善了碳纳米管的团聚性，增加了碳纳米管的分散性，壳聚糖分子中存在的羟基和氨基增加了复合载体材料对酶蛋白分子的固载能力，且有助于稳定酶分子构象，减少酶分子活性的损失。

附图说明

图1为CS、CA与CA/CS的红外吸收图谱。横坐标为波数(cm^-1)，纵坐标为吸光度。

图2为CNT、CA/CS与CA/CS/CNT的红外吸收图谱。横坐标为波数(cm^-1)，纵坐标为吸光度。

图3为CS与CA/CS的X射线衍射图谱，横坐标为角度(°)，纵坐标为接收器检测到的计数。

图4为CNT的透射电镜图。标尺为100nm。

图5为CA/CS/CNT的透射电镜图。标尺为100nm。

图6为CA/CS/CNT的透射电镜图。标尺为20nm。

具体实施方式

实施例1壳聚糖前处理。

取1g壳聚糖粉末置于20mL醇溶液中，超声1h，磁力搅拌溶胀12h。

实施例2肉桂醛接枝化壳聚糖。

肉桂醛接枝化壳聚糖：量取与壳聚糖中游离氨基的物质量比为4:1的肉桂醛于乙醇中，混合液浓度为50％，混合均匀后逐滴滴加到壳聚糖的甲醇溶液中，45℃恒温水浴条件下反应8h，抽滤，无水乙醇洗涤3次，真空干燥24h，所得产物即为肉桂醛接枝化壳聚糖。

实施例3肉桂醛接枝化壳聚糖的表征。

曲线CS显示了壳聚糖的红外光谱图，3200-3600cm^-1的宽峰是O-H键伸缩振动峰与-N-H键伸缩振动峰的重合峰；1642cm^-1属于残留乙酰中C＝O键的伸缩振动,是酰胺I谱带；1600cm^-1属于N-H键的弯曲振动；1153cm^-1和1068cm^-1处为C-O-C的伸缩振动；896cm^-1处为壳聚糖的结构摇摆峰。

曲线CA显示了肉桂醛的红外图谱，1681cm^-1属于醛基中C＝O键的伸缩振动，1625cm^-1处弱峰为C＝C键的伸缩振动峰，1495cm^-1和1449cm^-1处为苯环的特征吸收峰。

曲线CA/CS显示了肉桂醛接枝化壳聚糖的红外图谱，通过与壳聚糖红外图谱对比，可以看到肉桂醛接枝化壳聚糖的红外图谱在1600cm^-1处峰基本消失，这是由于壳聚糖中-NH₂与肉桂醛中-CHO反应导致N-H减少产生的，1633cm^-1为反应新生成的C＝N键的伸缩振动峰，750cm^-1和689cm^-1处为苯环取代基上C-C的伸缩振动峰，表明肉桂醛已成功接枝在壳聚糖上(参见图1)。

由于壳聚糖分子中存在-OH，-NH₂等基团，分子内以及分子间存在很强的氢键作用，使得壳聚糖分子排列有序，容易形成结晶体，结晶峰主要在2θ＝20.0°，峰强并且尖锐，从肉桂醛接枝化壳聚糖的X射线衍射图中，可以看到2θ＝20.0°的峰强明显减弱，变得较为平缓，且在2θ＝5.0°和2θ＝12.0°出现新的结晶峰，说明肉桂醛的接枝化导致壳聚糖分子内以及分子间的氢键作用力被破坏，结晶性能改变(参见图3)。

实施例4肉桂醛/壳聚糖非共价修饰碳纳米管。

取50mg上述肉桂醛接枝化壳聚糖分散于100ml、1％的乙酸溶液中，磁力搅拌15min，按肉桂醛接枝化壳聚糖与碳纳米管的质量比为1:1加入碳纳米管，超声1.5～2h，磁力搅拌2h，溶液呈黑色均一相，2000rpm离心3min，去除底部未参与反应的沉淀，取上清液滴加碱溶液调节溶液pH至弱碱性，静置10min，溶液分层，抽滤，去离子水洗涤3次，50℃真空干燥，所得产物即为肉桂醛/壳聚糖非共价修饰碳纳米管。

实施例5肉桂醛/壳聚糖/碳纳米管复合载体材料的表征。

通过与肉桂醛/壳聚糖和碳纳米管的红外图谱对比，可知在肉桂醛/壳聚糖/碳纳米管复合载体材料的红外图谱中1567cm^-1处为肉桂醛接枝化壳聚糖中C＝N键在碳纳米管共轭作用下的特征峰，1151cm^-1和1067cm^-1为缠绕在碳纳米管表面的壳聚糖希夫碱中C-O-C键的伸缩振动，由此可以推断肉桂醛接枝化壳聚糖与碳纳米管发生了非共价结合(参见图2)。

肉桂醛/壳聚糖/碳纳米管复合载体材料在不同倍数下的透射电镜下的检测结果表明，肉桂醛/壳聚糖分子均匀包裹在碳纳米管表面，管束之间缠绕现象不明显，团聚现象明显改善(参见图4-图6)。

实施例6脂肪酶的固定化及活力测定结果

取一定量的脂肪酶粉溶解于PBS缓冲液(pH＝7)中，配置5mg/ml的脂肪酶溶液，分别称取20mg肉桂醛/壳聚糖/碳纳米管和壳聚糖/碳纳米管加入20ml上述脂肪酶溶液中，置于振荡器中室温振荡4h，5000r/min离心3min，测定上清液中酶浓度，酶浓度测定方法采用Bradford法^[20]测定。可依据下列公式计算载体固定化酶的负载量：

式子中W表示每克载体负载酶的质量(mg/mg载体)；C1表示反应前的酶浓度；C2表示反应后的酶浓度(mg/ml)；V表示反应体系的体积(mg/ml)；M表示载体的质量(mg)。

酶活力测定方法采取中国药典中提供的方法，酶活力单位为指定条件下每分钟催化水解橄榄油生成1μmol脂肪酸所需的酶量。

结果表明：壳聚糖/碳纳米管的最大负载量为178mg/g，酶活性为6554U/g，肉桂醛/壳聚糖/碳纳米管的最大负载量为248mg/g，酶活性为8064U/g。肉桂醛对壳聚糖的修饰作用增加了体系对脂肪酶的负载量，原因可能是肉桂醛的改性作用下改变了壳聚糖空间立体结构，疏水性基团缠绕在碳纳米管管束内表面，亲水性羟基暴露在碳纳米管管束外表面，增加了蛋白与载体的结合作用力。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。