一种生物菌肥及其制备方法和防治白绢病、改良土壤环境的应用与流程

本发明属于微生物技术领域，涉及一种生物菌肥及其制备方法和防治白绢病、改良土壤环境的应用。

背景技术：

白绢病是农业中发病频率高、危害大的一类土传病害。引起白绢病的病原菌无性态为齐整小核菌(sclerotiumrolfsii)。该病原菌于1891年美国首次在番茄感染白绢病中发现，此后全世界范围内陆续有不同作物感染白绢病的报道。已有的研究表明，白绢病菌植物寄主多种多样，涉及近600种植物，广泛分布于作物、蔬菜、花卉和中药材。已报道的寄主包括玉米、大豆、花生、棉花、棉花、马铃薯、附子、茄子、蝴蝶兰等。齐整小核菌在10～35℃下均可生长，其中25～35℃时，菌丝生长速度快。低于10℃时，生长很慢。其菌丝主要在土壤表面或表层生长扩展，最适条件下每天的生长扩展距离达2.9cm，可导致植物茎基部腐烂而引起死亡。当入夏温度升高，湿度增加时，齐整小核菌生长异常迅速，植物之间传染速度加快。如果不能及时防治，可能导致绝收。加之齐整小核菌(sclerotiumrolfsii)以菌核或菌丝在土壤中或者植物病残体中越冬，菌核在土壤中存活期长，高达5～6年，具有危害时间长、越冬场所快、防控难度大的特点。因此如何有效防治齐整小核菌引发的白绢病是目前农业生产中面临的一大难题。

目前农业中防治齐整小核菌引发的白绢病的手段有多种。主要包括以下几类。(1)化学防治。目前报道单施一种或联合使用几种化学药剂成功防治不同植物白绢病的报道。这些化学药剂包括苯菌灵、百菌清、代森锰锌、氟硅唑、恶霉灵等。也有化学药剂与肥料混合使用成功防治白绢病的报道。该方法操作简单，防治效率高，但容易引起土壤和植物的农药残留，污染环境。(2)农业防治。包括及时清除病残枝条、使用不同的肥料、合理轮作与套作等。该方法虽然操作简单，对环境友好，但整体防治白绢病的效果一般。(3)生物防治。目前报道的对齐整小核菌有很好防治效果的生防菌包括哈茨木霉(trichodermaharzianum)、木霉(trichodermasp.)、解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)等。此外也有将氮肥和哈茨木霉合理搭配后可以很好防治白绢病的报道。生物防治具有专一性强、绿色环保的优点，因此生防菌防治白绢病一直是的研究与应用的热点。在专利号为cn106854098a公开了一种防治甜叶菊白绢病的菌肥添加剂及制备方法，包括甜叶菊渣、茶渣、紫草、地榆、南瓜藤、豌豆麸、石灰、草木灰、芽孢杆菌、木霉菌、绿黏帚霉菌。利用芽孢杆菌、木霉菌、绿黏帚霉菌等也可有效防治花生白绢病。但目前这些生防菌肥防治白绢病存在一些不足，导致其防治效果难以达到预期。正如前面所提及的，齐整小核菌的寄主植物种类多，菌核在土壤中存活期长。用化学药剂防治后，土壤中农药与重金属残留量大。在后期种植中，施用目前报道的这些生防菌的过程中，土壤中残留的大量的农药与重金属可以抑制这些生防菌的存活，从而降低其生防效果。加之不同的生防菌之间简单复配后，在合适的温度与湿度条件下，相互之间能产生很强的拮抗效果，也会降低生防菌肥的效果。研发既能降低土壤农药与重金属残留量，又能提高防治白绢病的生物菌肥具有重要的现实意义。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种生物菌肥及其制备方法和防治白绢病、改良土壤环境的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开的一种生物菌肥，以质量份数计，包括：40份包埋菌体a和60份包埋混合菌体b；

所述包埋菌体a是以海藻酸钠包埋巨大假单胞菌制成，海藻酸钠与巨大假单胞菌的质量比为3:1；

所述包埋混合菌体b是以聚乙烯醇和海藻酸钠包埋lysobacteryanansissnnu513和解淀粉芽孢杆菌的混合菌制成，聚乙烯醇、海藻酸钠以及lysobacteryanansissnnu513和解淀粉芽孢杆菌的混合菌的质量比为7:6:1。

本发明还公开了上述生物菌肥的制备方法，包括以下步骤：

1)分别取巨大假单胞菌、lysobacteryanansissnnu513菌和解淀粉芽孢杆菌，分别接种于lb培养基中，培养制备种子液；

2)按10％的接种量，将巨大假单胞菌种子液接种于发酵液a中，经培养制得含有巨大假单胞菌的发酵液，再经离心处理，制得巨大假单胞菌；

按10％的接种量，将lysobacteryanansissnnu513菌接种于发酵液b中，经培养制得含有lysobacteryanansissnnu513的发酵液，然后向该发酵液中按10％的接种量继续接种解淀粉芽孢杆菌，经培养制得含有两种菌的发酵液，再经离心处理，制得混合菌；

3)按1g:100ml的用量比，将巨大假单胞菌与3％海藻酸钠溶液混合均匀后，加入4％cacl2溶液，边滴边搅拌，形成固化小球，将固化小球在4℃交联固化24h，获得包埋巨大假单胞菌颗粒，将包埋巨大假单胞菌颗粒接种于发酵液a中，增殖培养，制得包埋菌体a；

4)配制3.5％聚乙烯醇与3％海藻酸钠混合液，然后与步骤2)制得的混合菌按照100ml:1g的用量比混合均匀，滴入饱和硼酸中，形成固化小球，4℃交联固化24h，获得包埋混合菌颗粒，将包埋混合菌颗粒接种于发酵液b中，增殖培养，制得包埋菌体b；

5)将包埋菌体a和包埋菌体b干燥后，按质量比4:6混匀，制得生物菌肥。

优选地，发酵液a中包含蔗糖10g/l、酵母膏5g/l和mgso41g/l；发酵液b中包含蔗糖33g/l、酵母提取物4g/l、胰蛋白胨4.5g/l、(nh4)2so49g/l、co(nh2)22g/l。

优选地，步骤1)中，三种菌株的培养条件均为37℃、180r/min培养18～20h；步骤2)中，巨大假单胞菌的培养条件为37℃、180r/min培养2d；lysobacteryanansissnnu513菌的培养条件为37℃、180r/min培养18h；加入解淀粉芽孢杆菌后，培养条件为37℃、180r/min培养1d；步骤3)和步骤4)中，增殖培养条件为30℃、180r/min培养3d；步骤2)中，离心是在4℃下，以6000r/min离心30min。

优选地，步骤3)中，按照(5～10)g:1l的接种量，将包埋巨大假单胞菌颗粒接种于发酵液a中；步骤4)中，按照(5～10)g:1l的接种量，将包埋混合菌颗粒接种于发酵液b中。

本发明还公开了上述生物菌肥在改善土壤环境中的应用。

优选地，所述生物菌肥能够吸附土壤中的重金属cr²⁺、cu²⁺和pb²⁺。

优选地，所述生物菌肥能够将土壤中难溶性磷化合物转化为可溶性磷酸盐。

本发明还公开了上述生物菌肥在防治植物白绢病中的应用，该生物菌肥能够防治由齐整小核菌(sclerotiumrolfsii)引起的植物白绢病。

优选地，在播种期采用穴施的方法将所述生物菌肥施于种子附近。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的生物菌肥属于多功能的菌肥，菌肥中的巨大假单胞菌既能吸附土壤中的cr²⁺、cu²⁺和pb²⁺重金属离子，又能将难溶性磷转化为可溶性磷提供给植物使用，改良土壤环境的同时还可降低磷肥的施用量，促进植物生长。菌肥中的lysobacteryanansissnnu513(cgmccno.8375，atccbaa-2621)是本实验室在植物远志根部分离获得的一株生防菌，能通过分泌胞外蛋白抑制多种病原菌的生长，具有很好的生防效果。解淀粉芽孢杆菌是目前研究和使用较多的一类广谱生防细菌。lysobacteryanansissnnu513和解淀粉芽孢杆菌对齐整小核菌(sclerotiumrolfsii)均有很强的拮抗效果，二者联合使用，因此本发明的生物菌肥对齐整小核菌引发的白绢病的防治效果更佳。

2、本发明提供的生物菌肥的生防菌能分段缓释，达到优先改良土壤环境再进行生物防治的效果。巨大假单胞菌包埋的薄，首先释放于土壤环境，而lysobacteryanansissnnu513和解淀粉芽孢杆菌混合菌包埋的厚，后释放于环境，因此能够有效改善土壤重金属含量高而影响生防菌的存活率的问题。

3、本发明采用包埋的方法克服实际生产过程中微生物损失比较大、不易保存、有效菌含量过低等问题，提高了菌肥的使用效率。与传统的化学农药防治相比，本发明的菌肥无农药与重金属残留，对环境友好。

附图说明

图1为齐整小核菌与解淀粉芽孢杆菌、lysobacteryanansissnnu513平板对峙结果；图中，中间白色菌丝体为齐整小核菌，a/c：lysobacteryanansissnnu513对齐整小核菌的拮抗；b/d：解淀粉芽孢杆菌对齐整小核菌的拮抗；

图2为解淀粉芽孢杆菌和lysobacteryanansissnnu513不发生相互拮抗的效果图；图中，a为解淀粉芽孢杆菌，b为lysobacteryanansissnnu513；

图3为lysobacteryanansissnnu513生长曲线；

图4为解淀粉芽孢杆菌生长曲线；

图5为巨大芽孢杆菌溶磷能力；

图6为包埋颗粒在土壤中降解释放过程；

图7为本品对难溶性磷转化为可溶性磷的情况。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

实施例1：解淀粉芽孢杆菌、lysobacteryanansissnnu513与齐整小核菌拮抗试验

1、试验过程

(1)将供试齐整小核菌转接到pda培养基上，分别将解淀粉芽孢杆菌和lysobacteryanansissnnu513接到lb培养基上进行活化培养，3d后进行平板对峙培养试验。

(2)用直径5mm的打孔器分别将培养好的解淀粉芽孢杆菌、lysobacteryanansissnnu513和齐整小核菌打成菌碟。

(3)将齐整小核菌菌碟置于pda平板(d＝88mm)中央，在其周围等距离放置解淀粉芽孢杆菌菌碟/lysobacteryanansissnnu513(解淀粉芽孢杆菌菌碟/lysobacteryanansissnnu513菌碟与齐整小核菌菌碟相距2cm)。每个处理设置3个重复，倒置于30℃恒温培养箱中培养。

(4)逐日观察各菌株的生长情况(连续观测3d)。

2、实验结果

齐整小核菌与解淀粉芽孢杆菌、lysobacteryanansissnnu513平板对峙结果如图1。图1中，b/d：解淀粉芽孢杆菌对齐整小核菌的拮抗；a/c：lysobacteryanansissnnu513对齐整小核菌的拮抗。由图1可知，解淀粉芽孢杆菌和lysobacteryanansissnnu513对齐整小核菌有明显的拮抗效果。

实施例2：解淀粉芽孢杆菌和lysobacteryanansissnnu513拮抗试验

1、试验过程

(1)分别将解淀粉芽孢杆菌和lysobacteryanansissnnu513接于lb液体培养基中，37℃、180r/min培养18～20h，制备种子液。

(2)将平板一分为二，中间划线，一边涂100mllysobacteryanansissnnu513菌液，另一边涂100ml解淀粉芽孢杆菌液，观察是否发生拮抗。

2、实验结果：

如图2所示，解淀粉芽孢杆菌和lysobacteryanansissnnu513不发生拮抗，可以一起培养。

实施例3：解淀粉芽孢杆菌和lysobacteryanansissnnu513混合培养接种顺序的筛选

1、试验过程

(1)将解淀粉芽孢杆菌和lysobacteryanansissnnu513分别接于lb培养基中，得种子液。

(2)取1ml解淀粉芽孢杆菌菌液加入100mllb液体培养基中。取1mllysobacteryanansissnnu513菌液加入100mllb培养基中，并充分震荡均匀。

(3)将步骤(2)中培养的菌液，37℃、180r/min培养，每隔一定时间(2h/12h)移100ul菌液到96孔板中，波长620nm下测od值。

(4)绘制菌株生长曲线。

2、实验结果

如图3和图4所示，lysobacteryanansissnnu513生长较慢(图3)，解淀粉芽孢杆菌生长较快(图4)，所以，向发酵液中先接种lysobacteryanansissnnu513，再接种解淀粉芽孢杆菌，二者在同一培养体系里，能在近乎同一时间达到最大生物量，该发酵方法比二者单独发酵培养成本更低。

实施例4：巨大芽孢杆菌吸附重金属试验

1、试验过程

(1)取实施例1活化好的巨大芽孢杆菌单菌落，接种于lb液体培养基，37℃，180r/min，过夜培养。菌液od＝0.8时，6000r/min离心10min，弃上清，称量湿菌重量。

(2)将0.1g巨大芽孢杆菌加入100ml含cr²⁺质量浓度分别为10、50、50mg/l，cu²⁺质量浓度分别为20、100、100mg/l，pb²⁺质量浓度分别为40、200、200mg/l的3个梯度的溶液中。37℃，180r/min震荡培养1h，6000r/min离心10min，弃沉淀。icp-ms测定上清液中三种重金属离子的质量浓度。以未接种的溶液作空白对照，每个处理设置3个重复。

(3)细菌对重金属离子的吸附率计算公式为：β＝(ρ0-ρ1)/ρ0×100％。式中：ρ0为溶液中重金属离子的初始质量浓度，mg/l；ρ1为吸附反应后溶液中重金属离子质量浓度，mg/l。

2、实验结果

巨大芽孢杆菌对cr²⁺、cu²⁺和pb²⁺的最大吸附率分别达到92％、88.4％、84.6％(表1)，说明巨大芽孢杆菌对这三种重金属离子有很好的吸附效果。

表1巨大芽孢杆菌对cr²⁺、cu²⁺、pb²⁺的吸附效果

实施例5：巨大芽孢杆菌溶磷试验

1、试验过程

(1)配制液体培养基，配方包括：每升水中包含葡萄糖10g，mgso4.7h2o0.4g，nacl1g，cacl2.2h2o0.2g，nh4no31.5g，kcl0.2g，酵母膏0.5g，羟基磷4g。高温高压灭菌，备用。

(2)按照实施例2培养细菌种子液，取od＝0.8的种子液1ml加入第一步准备好的培养基，37℃，180r/min震荡培养。分别在48、72、96和120h取样10ml，4℃6000r/min离心10min，取上清液，钼锑抗比色法测定菌株溶解无机磷能力。以未接种的溶液作空白对照，每个处理设置3个重复。

2、实验结果

如图5所示，随着发酵时间延长，发酵液中有效磷质量分数逐渐增加，至第4d达到最大值(439mg/kg)。由此说明，巨大芽孢杆菌具有很强的溶磷能力。

实施例6：菌体a包埋剂浓度初步筛选

1、试验过程

(1)培养巨大假单胞菌种子液，按10％的接种量将巨大假单胞菌接种于灭菌液体培养基(包括：蔗糖10g/l、酵母膏5g/l和mgso41g/l)中，37℃、180r/min培养2d。4℃6000r/min离心30min，弃上清，获得菌体，称重。

(2)配制不同浓度(1％、2％、3％和4％，w/v)海藻酸钠溶液。菌体分别与不同浓度的海藻酸钠溶液(1g:100ml)混合均匀。再将海藻酸钠-菌体混合液慢慢加入至4％cacl2溶液中，边滴边搅拌，形成固化小球，将固化小球在4℃交联固化24h，获得菌体a。常规方法测定包埋效果。操作性分为：难、较难、易三个等级。成球性分为：+、++，+++、++++三个等级。

2、实验结果

结果如表2所示，包埋剂海藻酸钠溶液1％浓度无法成球，2％可成球，但操作性弱，3％和4％成球性好，操作容易。因此，选择3％～4％海藻酸钠溶液对巨大假单胞菌包埋。

表2巨大假单胞菌包埋溶液浓度筛选

实施例7：混合菌体b包埋浓度筛选

1、试验过程

(1)分别取lysobacteryanansissnnu513(cgmccno.8375，atccbaa-2621)、解淀粉芽孢杆菌接种于lb培养基，37℃、180r/min培养18～20h，制备种子液。

(2)按10％的接种量将lysobacteryanansissnnu513(cgmccno.8375，atccbaa-2621)接种于蔗糖33g/l、酵母提取物4g/l、胰蛋白胨4.5g/l、(nh4)2so49g/l、co(nh2)22g/l发酵液中，37℃、180r/min培养18h，取出，按10％的接种量将解淀粉芽孢杆菌接种于发酵液中，37℃、180r/min培养1d。

(3)以4℃、6000r/min离心30min，获得混合菌体b。

(4)分别配配浓度(w/v)为1％、2％、3％、4％的聚乙烯醇与2％、3％、4％(w/v)的海藻酸钠混合液，每1g混合菌体b与100ml上述混合液，混合后慢慢滴入饱和硼酸中，形成固化小球，4℃交联固化24h，获得混合菌体b。

2、实验结果

结果参见表3。整体来说，在海藻酸钠3～4％，聚乙烯醇1～4％对混合菌体进行包埋效果好。

表3混合菌体b包埋浓度筛选

实施例8：菌体a和混合菌体b包埋颗粒活菌、包埋率、包埋后活菌数测定

1、试验过程

称取实例6、7的新鲜包埋颗粒和经过增殖培养的颗粒各1.0g，分别加入柠檬酸钠溶液中，无菌水定容至10ml，充分振荡至颗粒完全溶解，使菌体释放完全，用稀释平板法于30℃培养3d，菌落计数。

按下列各式计算各项指标：

单位质量颗粒活菌数(个/g)＝(一定稀释度的活菌数×稀释倍数×菌液量)/颗粒重；

包埋率(％)＝颗粒中包埋的活菌数/总活菌数。

2、实验结果

结果表明，菌体a与海藻酸钠包埋最佳比为1:3，增殖后活菌数可高达63.4×10¹⁰个/g(表4)。混合菌体b：海藻酸钠：聚乙烯醇包埋最佳比为1:6:7，增殖后活菌数可高达64.2×10¹⁰个/g(表5)。

表4菌体a包埋颗粒活菌、包埋率、包埋后活菌数

表5混合菌体b包埋颗粒活菌、包埋率、包埋后活菌数

实施例9：包埋颗粒土壤降解释放效果

1、试验过程

分别取20颗实施例8中最优组合的包埋颗粒a、b，分别埋在深度为10cm的土壤中，每两天通过直径变化测定菌肥颗粒降解情况。

2、实验结果

结果表明，包埋颗粒a降解快，在第5天被完全降解，巨大芽孢杆菌先释放。包埋颗粒b降解稍慢，在第16天被完全降解，lysobacteryanansissnnu513(cgmccno.8375，atccbaa-2621)、解淀粉芽孢杆菌后释放(图6)。

实施例10：应用本品防治附子白绢病盆栽试验

1、试验过程

(1)病原菌的活化：将齐整小核菌接种到pda培养基中，于28℃培养5d，进行活化。

(2)病原菌的扩繁：将齐整小核菌接种到灭菌的pda液体培养基中，置于30℃，180r/min，振荡4d。

(3)6000r/min离心10min，用无菌水清洗3次，得病菌菌丝，配1g/ml菌悬液备用。

(4)病原菌接种：附子种植于带土的塑料盆，将10ml病原菌悬液接种于附子周围，然后盖上一层薄土。

(5)本生物菌肥的接种：分别在附子移栽时分别按照以下几种方式施入菌肥或灌根单独细菌发酵液：本生物菌肥；实施例6的巨大芽孢杆菌发酵液；参照实施例7的方法培养获得的解淀粉芽孢杆菌发酵液；参照实施例7的方法培养获得的lysobacteryanansissnnu513发酵液；本生物菌肥(用实施例8方法中包埋方法配制包埋菌体a40份、包埋混合菌体b60份)。每个处理10盆。每盆浇稀释100倍的单独发酵液100ml，采用穴施的方法将1g本品施于附子附近。浇灌清水作为空白对照。每天观察附子发病情况，种植60天后调查白绢病的发病情况。附子每3天浇水1次。

(6)白绢病5级分级标准：0级：植株无症状；1级：病斑仅在茎基部产生；2级：茎基部产生缢缩症状，表现系统症状(枯萎、死亡、萎蔫等)的染病部位占整株的三分之一以下；3级：表现系统症状的染病部位占整株的三分之二以下；4级：表现系统症状的染病部位占整株的三分之二以上，死亡植株按4级计算。

病株率＝发病株数/总株数×株数×％

病情指数＝∑(情发病级代表值×各级病株数)/(调查总株数×最高级发病代表值)×％

防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×％

2、实验结果

结果表明，本品对室内盆栽附子白绢病的防治效果达88.6％，显著高于单独应用解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、lysobacteryanansissnnu513发酵菌液的效果(表6)。

表6应用本品对附子白绢病的室内防治效果

实施例11：田间施用本品对附子白绢病的防治作用试验

1、试验过程

(1)试验在陕西省汉中城固试验农田进行，为附子连作田，白绢病等发生严重。采用随机区组设计，附子每小区100m²，重复5次。清水为空白对照，市场购置的某品牌复合微生物菌剂为阳性对照。

(2)在播种期采用灌根的方法，在附子根系周围施用以下处理作为对照：100ml清水；100ml实施例6的巨大芽孢杆菌发酵液(稀释100倍)；100ml参照实施例7的方法培养获得的lysobacteryanansissnnu513发酵液；100ml参照实施例7的方法培养获得的解淀粉芽孢杆菌发酵菌液(稀释100倍)；100ml市购复合微生物菌剂(稀释100倍)；采用穴施的方法将1g本品施于附子附近。

采用穴施的方法将以下几种处理施于种子附近：实施例8中优选的包埋lysobacteryanansissnnu513与解淀粉芽孢杆菌混合菌体b100份；包埋菌体a50份、包埋混合菌体b60份；包埋菌体a60份、包埋混合菌体b40份；包埋菌体a40份、包埋混合菌体b60份；

(3)其他田间管理同正常生产，附子收获前每小区调查中间一行，每小区查20株，共调查100株，白绢病的发病情况。

2、实验结果

田间用包埋菌体a40份+包埋混合菌体b60份(以下简称本品)处理附子，对附子白绢病的防治效果为88％，显著高于市售复合生物菌剂，也显著高于解淀粉芽孢杆菌发酵菌液、巨大芽孢杆菌发酵菌液、lysobacteryanansissnnu513发酵菌液单独应用。

防治效果：本品>包埋混合菌体b>菌液单剂，本品>包埋菌体a50份+包埋混合菌体b50份>包埋菌体a60份+包埋混合菌体b40份，说明本品中包埋菌体a与包埋混合菌体b40份：60份(即2:3)时防治附子白绢病效果最佳(表7)。

表7应用本品对附子白绢病的田间防治效果

实施例12：田间施用本品对花生白绢病的防治作用试验

1、试验过程

(1)试验在陕西省西安市长安区大兆乡试验农田进行，为花生连作田，白绢病等发生严重。采用随机区组设计，花生每小区70m²，重复4次。清水为空白对照，市售复合微生物菌剂为阳性对照。

(2)在播种期，采用与实施例11完全相同的对照、菌肥等的处理。

(3)其他田间管理同正常生产，花生收获前每小区调查中间一行，每小区调查40株，共调查160株白绢病的发病情况。

2、实验结果

田间用本品处理花生，对花生白绢病的防治效果为55.5％，显著高于市售复合生物菌剂，也显著高于解淀粉芽孢杆菌发酵菌液、巨大芽孢杆菌发酵菌液、lysobacteryanansissnnu513发酵菌液单独应用。

防治效果：本品>包埋混合菌体b>菌液单剂，本品>包埋菌体a50份+包埋混合菌体b50份>包埋菌体a60份+包埋混合菌体b40份，说明本品中包埋菌体a与包埋混合菌体b40份：60份(即2:3)时防治花生白绢病效果最佳(表8)。

表8应用本品对花生白绢病的田间防治效果

实施例13：田间施用本品对附子样地重金属元素含量影响试验

1、试验过程

(1)在实施例11中的试验田中，设置10个面积为10m²的附子样方。样方选取避免设在田边、路边、沟边等特殊地形的部位以及堆过肥料的地方，并确保选择样方内研究附子物盖度大于85％。每种样方内采用s型布点选择9株，取其根际土混合，并按照四分法取一部分土壤挖取有完整根系的土体(体积大小视根系的范围而定)，先轻轻抖落大块不含根系的土壤作为非根际土；然后，将根表面(1mm)附着的土壤全部抖落或用毛刷轻轻刷下，即得到根际土壤，将采集的土样混合，密封后带回室内。

(2)仔细除去其中可见植物残体，风干，磨碎过100目土壤筛后待测。

(3)称取研磨后的土样，用icp-ms测定元素全量。

2、实验结果

经施加实施例11优选的包埋菌体a40份与包埋混合菌体b60份(以下简称本品)后，土壤cr²⁺、cu²⁺、pb²⁺污染情况得到改善(表9)，说明该复合菌剂可以吸附土壤中这3种重金属离子。

表9施用本品对附子田间样地重金属元素含量影响

实施例14：施用本品对盆栽土壤溶磷影响试验

1、试验过程

(1)供试土壤取自陕西省西安市大兆乡田间。土壤有机碳13.2g/kg，全氮1.26g/kg，有效磷12.8mg/kg，ph值7.4。采用口径为16cm，深为15cm的塑料盆钵进行试验，每盆装土1kg。

(2)试验设置对照处理组：分别施用磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁、磷酸锌、磷矿粉；接种实施例11优选的埋菌体a40份与包埋混合菌体b60份(以下简称本品)处理组：分别施用磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁、磷酸锌、磷矿粉。每种处理6个重复。

(3)取10g本品穴施到土壤中，每盆每种难溶磷源以1g/kg的用量与土壤充分混匀。选取大小相近的附子种植于盆中，每盆1株，80d后，测定土壤有效磷含量。

2、实验结果

结果表明，施用本品生物菌肥后，土壤有效磷含量均显著高于对照组。在施用磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁、磷酸锌和磷矿粉的土壤中有效磷含量分别比相应的对照提高512.5％、308.8％、212.7％、414.9％和111.2.7％，本品对土壤中不同难溶磷源的溶解能力大小为磷酸钙>磷酸锌>磷酸铝>磷酸铁>磷矿粉，在以磷酸钙为磷源条件下其溶磷效果最好(图7)。

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