专利名称：抗癌多肽体的制作方法
抑制毛细血管内皮细胞的生长是治疗癌症等血管增生疾病的一个新的技术领域。生物工程技术在当代制药工业中被广泛应用，许多基因制品被规模化生产。而如何浓缩高分子量基因产物的功能于极小的多肽体，即进行多肽体疗法，是现代生物医药的一个技术追求。本发明是多肽体技术和抗血管增生技术领域的结合。
癌症是目前世界上最难征服的疾病之一。在没有血管的情况下，肿瘤只能生长至1～2毫米，不会对人体构成致命威胁。肿瘤组织的恶性生长起因于从肿瘤组织周围的业已存在的血管产生新的毛细血管。这些新生的毛细血管向肿瘤组织内部侵入并延伸，向肿瘤细胞提供生长所必要的氧气和养料，导致肿瘤组织的恶性发展(1，2)。毛细血管的异常增生还可引起软骨组织的损伤和关节膜炎(3)。老年斑点性失明和糖尿病起因的视网膜镜疾病也是血管增生的直接后果(4)。抗血管增生疗法被认为是医治这些疾病的有效途径(5～7)。
已经有数种抗血管内皮细胞生长剂或因子被开发应用于血管增生疾病(8)。但是有的显示人体毒性如suramin等。有的只有很弱的抗血管内皮细胞生长活性如干扰素和抗雌激素等。有的抗血管内皮细胞生长因子不易用基因工程方法生产如血管生长抑素(sngiostatin)(9)和内皮生长抑素(endostatin)(10)。
多肽体很容易被合成和大量生产。人体同源性的多肽体通常不引起免役反应。筛选具有抗血管内皮细胞生长活性的人体同源性多肽体是本发明的探求目的。3. 圆饼状结构体及具有抗毛细血管内皮细胞活性的多肽体圆饼状结构体含有3对内部二硫键形成有内环和外环的圆饼形状的构造。它最早被发现于凝血素(thrombin)(11)。圆饼状结构体所担当的基本功能为分子与分子之间的相互作用。目前所知它与两大生物机能有关。其一为凝血及溶栓系统。组织型纤溶酶激活剂中的圆饼状结构对血栓的识别功能是发挥定向特异性溶栓效果的重要因素(12，13)。另一为血管生成调节系统。含有圆饼状结构体的纤溶酶原水解物具有抗血管生长功能(14)。
组织型纤溶酶激活剂含有两个圆饼状结构体。因其第二圆饼状结构体和血栓有很强的结合能力，所以它是目前从凝血及溶栓角度上最被广泛研究的圆饼状结构体之一(15)。但是其抗血管生长功能尚未知。发明人首次发现其抗毛细血管内皮细胞功能并由此筛选出具有活性的多肽体。
药物对毛细血管内皮细胞增殖的抑制活性使用BCE细胞测量(16)。BCE细胞的培养液含90％DMEM，10％血清(FBS)及2ng/mL碱性成纤维生长因子(bFGF)。用24孔板培养。每孔殖入8,000～10,000只细胞和0.5mL培养液。12小时后试验区换成含有药物的培养液，在37℃继续培养3～5天后计数。药物对BCE生长抑制的程度显示抗内皮细胞活性大小。相对于对照组生长的半抑制率称为IC50。
多肽体由Fmoc方法合成(17，18)，并通过C-18高压液相色谱分离仪(HpLC)提纯。多肽体及氨基酸皆采用国际常规IUPAC-IUB符号表示(19)。Ac和NHEt分别表示醋酸基和乙氨基，担任多肽体N-端及C-端的保护作用。
多肽体的分子组成如下A肽Ac-Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp-NHEtB肽Ac-Tyr-Phe-Gly-Asn-Gly-Ser-Ala-Tyr-Arg-Gly-Thr-His Ser-Leu-Thr-Glu-Ser-Gly-Ala-Ser-NHEtC肽Ac-Leu-Pro-Trp-Asn-Ser-Met-Ile-Leu-Ile-Gly-Lys-Val-Tyr-Thr-Ala-Gln-Asn-Pro-Ser-ala-Gln-Ala-Leu-Gly-Leu-Gly-Lys-His-Asn-Tyr-NHEtD肽Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Ala-Lys-Pro-Trp-NHEtE肽Ac-His-Val-Leu-Lys-Asn-Arg-Arg-Leu-Thr-Trp-Glu-Tyr-NHEtF肽Ac-Asp-Val-Pro-Ser-NHEtG肽Ac-Ser-Thr-NHEt这些多肽体的大小长短不一，并非无规则性选择。它们有个共同点即它们是圆饼状结构体的每两个相邻的半胱氨酸之间的氨基酸序列。所以它们不含半胱氨酸，不形成分子间或内部二硫键。
通过对这些多肽体的抗毛细血管内皮细胞活性分析发现A肽，B肽，C肽，F肽及G肽都几乎没有活性，D肽和E肽则显示很强的活性。尤其D肽最强(图1)。活性的D肽和E肽的理论分子量分别为1223Da和1682Da。它们的质量图谱分别如图2和图3所示。实际测量值符合理论计算的分子量。
组织型纤溶酶激活剂第二圆饼状结构体的二级构造已经被分析确定(18)，6个半胱氨酸组成的3对二硫键形成有内环和外环的典型的圆饼状结构体构造(图4)。极有意义的是对照二级结构D肽和E肽皆存在于圆饼状结构体的内环上。A肽，B肽，C肽，F肽及G肽都在外环。根据这些结果推测圆饼状结构体的内环可能为抗毛细血管内皮细胞的活性区域。
D肽和E肽的活性位点通过合成变异多肽体，即置换多肽体中的氨基酸进行探索。
D肽组修饰多肽体的组成如下D(原始) Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Ala-Lys-Pro-Trp-NHEtD(RlA) Ac-Ala-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Ala-Lys-Pro-Trp-NHEtD(N2A) Ac-Arg-Ala-Pro-Asp-Gly-Asp-Ala-Lys-Pro-Trp-NHEtD(P3A) Ac-Arg-Asn-Ala-Asp-Gly-Asp-Ala-Lys-Pro-Trp-NHEtD(D4A) Ac-Arg-Asn-Pro-Ala-Gly-Asp-Ala-Lys-Pro-Trp-NHEtD(G5A) Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Ala-Asp-Ala-Lys-Pro-Trp-NHEtD(D6A) Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Ala-Ala-Lys-Pro-Trp-NHEtD(K8A) Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Ala-Ala-Pro-Trp-NHEtD(P9A) Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Ala-Lys-Ala-Trp-NHEtD(W10A) Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Ala-Lys-Pro-Ala-NHEtD(K8R) Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Ala-Arg-Pro-Trp-NHEt这些多肽体中的每一个氨基酸都被丙胺酸逐个置换。数字所示为从多肽体N-末端的第一个氨基酸开始的位置。第七位本为丙胺酸，故该位置无置换体。在这些置换体当中，第八位的赖氨酸所被置换的多肽体D(K8A)的活性和其它相比有显著下降。而在此位置上的赖氨酸被精氨酸的置换多肽体(K8R)的活性则无显著变化。这些结果表明存在于D肽C-末端的带正电荷氨基酸对该多肽体的活性发挥有极重要的作用。并且在同浓度下D肽的活性明显大于最近发现的TSP-1肽(20)(图5)。
E肽组多肽体的修饰群体(N-端为醋酸基，C-端为乙氨基)E(原始) His-Val-Leu-Lys-Asn-Arg-Arg-Leu-Thr-Trp-Glu-TyrE(H1A) Ala-Val-Leu-Lys-Asn-Arg-Arg-Leu-Thr-Trp-Glu-TyrrE(V2A) His-Ala-Leu-Lys-Asn-Arg-Arg-Leu-Thr-Trp-Glu-TyrE(L3A) His-Val-Ala-Lys-Asn-Arg-Arg-Leu-Thr-Trp-Glu-TyrE(K4A) His-Val-Leu-Ala-Asn-Arg-Arg-Leu-Thr-Trp-Glu-TyrE(N5A) His-Val-Leu-Lys-Ala-Arg-Arg-Leu-Thr-Trp-Glu-TyrE(R6A) His-Val-Leu-Lys-Asn-Ala-Arg-Leu-Thr-Trp-Glu-TyrE(R7A) His-Val-Leu-Lys-Asn-Arg-Ala-Leu-Thr-Trp-Glu-TyrE(L8A) His-Val-Leu-Lys-Asn-Arg-Arg-Ala-Thr-Trp-Glu-Tyr
E(T9A) His-Val-Leu-Lys-Asn-Arg-Arg-Leu-Ala-Trp-Glu-TyrE(W10A)His-Val-Leu-Lys-Asn-Arg-Arg-Leu-Thr-Ala-Glu-TyrE(E11A)His-Val-Leu-Lys-Asn-Arg-Arg-Leu-Thr-Trp-Ala-TyrE(Y12A)His-Val-Leu-Lys-Asn-Arg-Arg-Leu-Thr-Trp-Glu-AlaE(H1W) Trp-Val-Leu-Lys-Asn-Arg-Arg-Leu-Thr-Trp-Glu-TyrE(N5P) His-Val-Leu-Lys-Pro-Arg-Arg-Leu-Thr-Trp-Glu-TyrE(W1P5)Trp-Val-Leu-Lys-Pro-Arg-Arg-Leu-Thr-Trp-Glu-Tyr内皮细胞生长抑制试验显示在以上的多肽体当中，第一位置的组氨酸和第五位置的天冬醯胺酸同时被色氨基酸和比咯氨酸置换的肽E(W1P5)的活性有显著提高(图5)。可是，组氨酸及天冬醯胺酸分别被色氨基酸及比咯氨酸的置换体多肽体E(H1W)和E(N5P)的活性则无根本性变化。
为了进一步的缩小活性区域，合成了多肽体e肽Ac-Trp-Val-Leu-Lys-Pro-Arg-Arg-NHEt。
该多肽体是E(W1P5)的一部分，包含组氨酸及天冬醯胺酸同时被色氨基酸及比咯氨酸置换体的区域。抑制试验显示e肽可继承多肽体E(W1P5)的生物活性(图5)。e肽只含7个氨基酸。e肽和上述D肽同时作用时的效果更佳(如图6)。
通过以上试验，发明人发现了两个具有抑制内皮细胞生长活性的多肽体Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Ala-Lys-Pro-Trp-NHEt(D肽)和Ac-Trp-Val-Leu-Lys-Pro-Arg-Arg-NHEt(e肽)。这两个多肽体的长度分别只有7和10个氨基酸，易于制造，是治疗肿瘤等疾病的新的血管抑制素。4. 参考文献(1) Folkman J.ProceedingsTumor angiogenesis factor.Cancer Research.1974；342109-2113.(2) Folkman J.Tumor angiogenesisapossible control point in tumor growth.
Annals of Internal Medicme.1975；8296-100.(3)Walsh DA.Angiogenesis and arthritis.Rheumatology(Oxford).1999；38103-112.(4)Cursiefen C.Schonherr U.Angiogenesis and inbition of angiogenesis in theeye.Klinische Monatsblatter fur Augenheilkunde.1997；210341-351.(5)Folkman J.Anti-angiogenesisnew concept for therapy of solid tumors.Annals ofSurgery.1972；175409-416.(6)Ballara SC.Miotla JM.Paleolog EM.New vessels，new approachesangiogenesisas a therapeutic target in musculoskeletal disorders.International Joumal ofExperimental Pathology.1999；80235-250.(7)TolentinoMJ.AdamisAP.Angiogenic factors in the development of diabetic irisneovascularization and retinopathy.Intemational Ophthalmology Clinics.1998；3877-94.(8)Grasparini G.Harris AL.Clinical importance of the determination of tumorangiogenesis in breast carcinomamuch morethan a newprognostic tool.Journalof Clinical Oncology.1995；13765-782.(9)O‘Reilly MS.HolmgrenL.ShingY.Chen C.Rosenthal RA.MosesM.LaneWS.CaoY.Sage EH.Fokman J.Angiostatinanovel augiogenesis inhibitor thatmediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma.Cell1994；79315-328.(10) O’Reilly MS.Boehm T.Shing Y.FukaiN.Vasios G.Lane WS.Flynn E.
Birkhead JR.Olsen BR. Folkman J.EndostatinAn endogenous inhibitor ofangiogenesis and tumor growth.Cell.1997；88277-285.(11) Magnusson S.Petersen TE.Scottmp-Jensen L.Claeys H. Proteases andBiological Controls(Reich E.Rifkin DB Shaw E eds).Cold Spring HarborLaboratory，Cold SpringHarbor，NewYork 1975；123-149.(12) deMunk GA.Caspers MP.Chang GT.Pouwels PH.Enger-ValkBE.VerheijenJH.Binding of tissue-type plasminogen activator to lysine，lysine ahalogues，andfibrin fragments.Biochemistry.1989；287318-7325.(13) Nesheim M.Fredenburgh JC.Larsen GR.The dissociation constants and
stoichiometries of the interactions of Lys-plasminogen and chloromethyl ketonederivatives of tissue plasminogen activator and the variant delta FEIX with intactfibrin.Journal of Biological Chemistry.1990；2652154121548.(14) Cao Y.Ji RW.Davidson D.Schaller J.Marti D.Sohndel S.McCance SG.
O’Reilly MS.Llinas M.Folkman J.Kringle domain of human angiostatin.
Characterization of the anti-proliferative activity on endothelial cells.Journal ofBiological Chemistry.1997；27129461-29467.(15) Bakker BHF.Van der Greef W.Rehberg EF.Marotti KR.Verheijen JH.
Introduction of lysine and clot binding properties in the kringle one domain oftissue-type plasminogen activator.The Joumal of Biological Chemistry.1993；26818496-18501.(16) Folkman J.Haudenschild CC.Zetter BR.Long-term culture of capillaryendothelial cells.Proceedings of the National Academy of Sciences USA.1979；765217-5221.(17) Meienhofer J.Hormonal Proteins and Peptides.Academic Press，New York.
1973.Schrodet G.Lupke K.The Peptides.Acacemic Press，New York.1965.(18) Vlahos CJ.Wilhelm OG.Hassell T.Jaskunas SR.Bang NU.Disulfide pairing ofthe recombinant kringle-2 domain of tissue plasminogen activitor produced inEscherichia coli.The Joumal of Biological Chemistry.1991；26610070-10072.(19) Anonymous.IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature(JCBN).Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides.EuropeanJoural of Biochemistry.1984；1389-37.(20) Dawson DW.Volpert OV.Pearce SF.Schneider AJ.Silverstein RL.Henkin J.
Bouck NP.Three distinct D-amino acid substitutions confer potent antiangiogenicactivity on an inactive peptide derived from a thrombospondin-1 type 1 repeat.
Molecular Pharmacology.1999；55332-338.
图1. 圆饼状结构体的抗BCE细胞活性区域的定位左侧展示多肽体所对应的圆饼状结构体的位置。6个半胱氨酸为各多肽体的分界点。右侧为各多肽体抗毛细血管内皮细胞活性。
纵柱为圆饼状结构体的氨基酸序列。横柱为抗内皮细胞活性。图中所示为各多肽体所对应的区域及活性(IC50)。图2. 具有抗毛细血管内皮细胞活性的D肽的分子质量图谱横柱为质(M/Z)，纵柱为计数值(counts)。加速电压是20,000伏特。D肽的质量为1223.01 Da。一个质量1245.13 Da的波峰是D肽和钠离子的结合体。它和D肽的质量差约为22 Da(Na+)。图3. E肽分子质量图谱横柱为质量(M/Z)，纵柱为计数值(counts)。加速电压20,000伏，低质量及阴离子不计。E肽及其钠离子结合体的实测质量分别为1682.07 Da和1704.16 Da。图4. 圆饼状结构体的示意图组织型纤溶酶激活剂第二个圆饼状结构体由90个氨基酸组成。
氨基酸用单字母表示。有3对内部二硫键形成有内环和外环的圆饼状结构体。内环存在二个抗毛细血管内皮细胞活性区。图5. 多肽体中的活性氨基酸图中展示D肽和E肽及其变异多肽体的活性。D(K8R)和D(K8A)为D肽中的赖氨酸被置换成精氨酸或丙胺酸。E(H1W)和E(N5P)表示E肽中的组氨酸和天冬醯胺酸分别被色氨基酸和比咯氨酸置换。E(W1P5)表示色氨基酸和比咯氨酸的同时置换体。e肽为含有色氨基酸和比咯氨酸置换区的精简多肽体。TSP-1肽为Ac-Gly-Val-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg-NHEt。各多肽体浓度为100nM。图6. D肽和e肽的相加作用图中所示不同浓度的D肽和e肽分别添加时的生物活性以及同时添加时的效果。
权利要求
具有抗毛细血管内皮细胞增生的两个微小多肽体D肽(10个氨基酸)和e肽(仅含7个氨基酸)的制造及其应用于治疗癌症和防治糖尿病诱发性失明或其它与血管增生有关的疾病。1. 多肽体D肽的组成组成为X1-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Ala-Z1-Pro-Trp-X2。Z1是一个带正电荷的氨基酸如赖氨酸或精氨酸等。X1是醋酸基或其它N-末端保护基如formyl，propionyl，pivaloyl，2-chloroacetyl，2-bromoacetyl，trifluoroacetyl，trichloroacetyl，phthalyl，o-nitro-phenoxyacetyl，benzyloxy-carbonyl，p-chlorobenzyl-oxycarbonyl，benzyloxy-carbonyl，p-chlorobenzyloxycarbonyl，p-bromobenzyloxycarbonyl，p-nitro-benzyloxycarbonyl，p-methoxybenzyloxycarbonyl，2-nitrobenzyloxycarbonyl，2-nitro-4，5-dimethoxybenzyloxy-carbonyl，2，4-dimethoxybenzyloxycarbonyl，4-methoxy-benzyloxy-carbonyl，1-(p-biphenylyl)-1-methylethoxycarbonyl，benzhydryloxy-carbonyl，t-butyloxycarbonyl，diisopropylmethoxycarbonyl，isopropyloxy-carbonyl，ethoxycarbonyl，methoxycarbonyl等。X2是氨基，乙醇氨基或其它C-末端保护基如phenethyl，alkoxy-benzyl，alkanoyloxyalkyl acetoxymethyl，butyryl-oxymethyl，1-methyl-1-(propionyloxy)-1-ethyl，pivaloyloxymethyl，cyclopropylcarbonyloxymethyl，cyclobutylcarbonyloxymethyl，cyclopentylcarbonyloxymethyl，cyclohexyl-carbonyloxymethyl，benzoyloxymethyl，benzoyloxyethyl，benzylcarbonyl-oxymethyl，2-benzylcarbonyloxyethyl，methoxycarbonylmethyl，cyclohexyl-oxycarbonylmethyl，1-methoxycarbonyl-1-ethyl，methoxycarbonyloxymethyl，1-ethoxycarbonyloxy-1-ethyl，1-cyclohexyloxycarbonyloxy-1-ethyl，t-butyl-oxycarbonylamino-meoyl 2-(phenoxycarbonyloxy)ethyl，2-(5-indanyloxy-carbonyloxy)ethyl，2-(1-methoxy-2-methylpropan-2-oyloxy)ethyl，2-(bcnzyl-oxycarbonyloxy)ethyl等。
2. 对第1项所言及分子中之氨基酸进行改造如削减，增加或者置换所产生的多肽体。
3. 在第1项和第2项的多肽体中使用D-形氨基酸。
4. 把第1项，第2项和第3项的多肽体两端的保护基摘除或者改造所产生的修饰分子。
5. 多肽体e肽的组成为X1-F1-Val-Leu-Lys-Pro-Z1-Z2-X2。F1是色氨基酸或乾酪胺酸或其它芳香族氨基酸。Z1和Z2是任意两个带正电荷的氨基酸如赖氨酸或精氨酸等。X1是醋酸基或其它N-末端保护基。X2是氨基，乙醇氨基或其它C-末端保护基。
6. 对第5项所言及分子中之氨基酸进行改造如削减，增加或者置换所产生的多肽体。
7. 在第5项和第6项的多肽体中使用D-形氨基酸。
8. 把第5项，第6项和第7项的多肽体两端的保护基摘除或者改造所产生的修饰分子。
9. 第1至8项所述的任何多肽体的氨基酸逆排列分子。
10. 医药制品中含第1至9项所述的任何多肽体。
全文摘要
圆饼状结构体含有3对内部二硫键形成有内环和外环的圆饼形状的构造。这里探索到圆饼状结构体的内环上存在两个抗毛细血管内皮细胞活性区,其活性能够转达到相对应的多肽体上。由此发明人发现了两个具有抑制内皮细胞生长活性的微小多肽体。它们的长度分别仅为7和10个氨基酸。这些多肽体易于被制造和大量生产,是治疗肿瘤和防治糖尿病所致失明等疾病的新的血管抑制素。
文档编号C07K7/00GK1336380SQ0010995
公开日2002年2月20日 申请日期2000年7月28日 优先权日2000年7月28日
发明者窦德献 申请人:窦德献