专利名称：白花败酱草中几种高纯度药用物质的快速制备方法
技术领域：
本发明涉及中药有效成分的分离纯化方法，更具体地说，本发明涉及的是白花败酱草中高纯度金色酰胺醇酯、异荭草苷和异牡荆苷高速逆流色谱快速分离制备方法。
背景技术：
白花败酱草(Patrinia Villosa Juss)又名苦菜、苦斋、鹿肠，系败酱科多年生草本植物，分布于我国华东、华中、华南及西南各地。因其含有多种氨基酸、维生素和矿物质等有益成份而被人们广泛食用，它也是一种常用中药，始载于《神龙本草经》，后又被《中国药典》(1977版)收载，具有清热利湿、解毒排脓、活血化瘀、清心安神、促进肝细胞再生、改善肝功能、增强抑菌和抗病毒等作用，临床上常用于治疗阑尾炎、痢疾、肝炎、扁桃体炎、流行性腮腺炎、痈肿等症。现代研究表明白花败酱草主要含有三萜类与环烯醚萜类化合物如白花败酱醇甙(villosolside)、白花败酱醇(villosol)、番木别甙(loganin)、莫诺甙(morroniside)、白花败酱甙(villoside)等，此外还有以败酱烯与异败酱烯为主的挥发油、内酯、香豆素等，但很多未见文献报道，也未见相关专利，更未见有从白花败酱草分离得到具有多种药理活性的金色酰胺醇酯、异荭草苷和异牡荆苷[F.U.Afifi，E.Khalil，S.Abdalla，Journal of Ethnopharmacology，65(1999)，173-177；Didem Deliorman Orhan，Mustafa Alsan，Goknur Aktay ect，LifeScience，72(2003)，2273-2283.]的报道，它们的结构式如下
金色酰胺醇酯 异荭草苷 异牡荆苷采用柱色谱法和重结晶等传统的分离制备方法分离植物中的有效单体，费时费力、污染环境[C.L Ky，M.Noirot，S.Hamon，J.Agric.Food.Chem.1997，45786；W.M.Yan，Acta Botanica Sinica，1979，2054；J.J Liu，G.L.Zhao，H.Wang，X.H.Zhang，J.Cent.South.Univ.T.2002，9246]，而且所用固定相对样品有不可逆性吸附作用等不足之处。
发明内容
因此，人们对采用效果更好的分离技术来解决上述问题存在需求。
本发明的目的是提供一种从白花败酱草中分离纯化高纯度金色酰胺醇酯、异荭草苷和异牡荆苷的方法，以克服现有技术中存在的上述问题。
高速逆流色谱(High-speed counter-current chromatography HSCCC)是一种较新的液液分配色谱技术，它不用任何固体支撑体或载体而克服了传统分离方法对样品的不可逆性吸附作用，因而样品回收率高，同时还具有应用范围广、仪器操作简单、分离量大等优点，因此被广泛应用于天然产物的分离制备当中。
本发明提供的从白花败酱草中分离纯化高纯度金色酰胺醇酯、异荭草苷和异牡荆苷的方法具体包括药材提取、粗提物制备及粗提物的分离纯化三道工序，其特征在于工序(1)采用不同浓度的乙醇依次提取药材获取提取物，工序(2)采用有机溶剂对提取物分段萃取并结合硅胶柱层析得到粗提物，工序(3)采用高速逆流色谱法对粗提物进行分离纯化，它包括配制构成固定相、流动相的溶剂体系，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱内，由进样阀进入制备好的粗提物样品，根据检测图谱接收目标组分。
1.药材提取取白花败酱药材适当粉碎后，先用40％乙醇回流提取，过滤后的药渣再用95％乙醇回流提取，合并提取液，减压浓缩至无醇味。
2.部位获取取提取所得浸膏，加适量水混悬后，先用石油醚萃取，静止分取石油醚层，再向水层中加入正丁醇萃取，静止后分取正丁醇层，减压浓缩石油醚和正丁醇萃取物，真空干燥。
取石油醚萃取物进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯剃度洗脱，接收石油醚∶乙酸乙酯(5∶1)洗脱流份，以此为进一步分离纯化样品。
3.部位的分离纯化应用高速逆流色谱分离纯化，它包括步骤(1)配制构成固定相、流动相的溶剂体系，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱内，由进样阀进样，根据检测谱图接收目标成分，(2)石油醚萃取物的硅胶柱初分物所用溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成，(3)正丁醇萃取物所用溶剂体系由乙酸乙酯、正丁醇、水组成。
其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的用量比为1∶1∶1∶1，乙酸乙酯、正丁醇、水的用量比为2∶1∶3。
4.分离物的纯度检测与结构鉴定采用高效液相色谱法对分得组分进行纯度检测(峰面积归一化法)，挥干溶剂后进行MS、1HNMR和13CNMR分析，根据所得数据进行结构确认。
本发明是采用高速逆流色谱对中药粗提物进行分离纯化，简便、快速，同时也避免了样品损失。克服了传统制备方法操作繁琐、分离周期长等缺点，并具有制备量大、分离效率高、产品纯度好、简便易行等优点，易于推广使用。
图1为石油醚萃取物的半制备型高速逆流色谱(HSCCC)的色谱2为正丁醇萃取物的半制备型高速逆流色谱(HSCCC)的色谱3为为石油醚和正丁醇粗提物及各分离部分的高效液相色谱(HPLC)的色谱图
具体实施例方式
下面结合具体实施例及附图对本发明进行说明实施例11.称取白花败酱草药材粗粉6.0kg，用10倍量40％乙醇回流提取两次，每次1.5h，过滤，向滤渣中加入8倍量95％乙醇再次回流提取2次，每次1.5h，过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏约2000ml。
2.取浓缩后的浸膏，加1000ml水混悬后，置于5000ml分液漏斗中，加石油醚1000ml充分振摇后静止分层，分取石油醚层，如此萃取三次，合并石油醚萃取液。再向水层中加入1000ml正丁醇，充分振摇后静止分层，分取正丁醇层，如此萃取三次，合并正丁醇萃取液。减压浓缩萃取液(浓缩温度60度)后减压干燥得石油醚萃取物150g，正丁醇萃取物25g。
3.取石油醚萃取物150g进行硅胶柱层析(8.0×120cm，硅胶量2500g，200-300目)，依次用石油醚∶乙酸乙酯(20∶1-1∶1)剃度洗脱，接收石油醚∶乙酸乙酯(5∶1)洗脱液，减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得固体量600mg。
4.应用高速逆流色谱(深圳同田生化有限公司)分离纯化石油醚萃取物的硅胶柱初分物和正丁醇萃取物。
(1)石油醚萃取物的硅胶柱初分物的高速逆流色谱分离纯化溶剂体系及用量体积比为正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶1∶1∶1，逆流色谱柱体积为300ml，上样量600mg，转速800rpm，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0ml/min，固定相保留率54％，检测波长254nm，在此情况下记录的色谱图见图1。
具体的操作步骤是按上述溶剂体积比配制溶剂体系，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，分取上下相，上相为固定相，下相为流动相。先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，再泵入流动相，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成份，结果分离得到1个部分，即流份“I”。
对该部分进行高效液相分析表明“I”为单一色谱峰，峰纯度为99.2％。
(2)正丁醇萃取物的高速逆流色谱分离纯化溶剂体系及用量体积比为乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3，逆流色谱柱体积为300ml，上样量250mg，转速800rpm，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0ml/min，固定相保留率49％，检测波长254nm，在此情况下记录的色谱图见图2。
具体的操作步骤同(1)，结果分离得到2个部分，即“II”和“III”。
对这两部分进行高效液相分析表明“II”和“III”均为单一色谱峰，峰纯度分别为98.3％和99.1％。
HPLC分析条件色谱柱Lichrospher C18(6.0×150mmi.d.5μm)，石油醚萃取物的硅胶柱初分物流动相为CH3CN∶H2O∶HAC＝70∶30∶1，流速1.0ml/min，检测波长254mn，在此条件下石油醚萃取物的硅胶柱初分物及HSCCC分离部分色谱图见图3。正丁醇萃取物流动相为CH3CN∶H2O∶HAC＝20∶80∶1，流速1.0ml/min，检测波长254nm，在此条件下正丁醇萃取物及各分离部分的色谱图见图3。其中图3-1为石油醚萃取物的硅胶柱初分物色谱图，图3-2为石油醚萃取物的硅胶柱初分物的HSCCC分离部分(金色酰胺醇酯)色谱图，图3-3为正丁醇萃取物色谱图，图3-4为异荭草苷色谱图，图3-5为异牡荆苷色谱图，峰1为金色酰胺醇酯，峰2为异荭草苷，峰3为异牡荆苷。
结构鉴定对分离得到的金色酰胺醇酯、异荭草苷和异牡荆苷在VarianINOVA-500型核磁共振仪和Varian MAT-212型质谱仪上，进行1HNMR、13CNMR和MS分析，所得数据如下。
金色酰胺醇酯白色针状结晶(乙酸乙酯)，UVλmax(nmMeOH)254nm。TOF-MS467.16[M+Na]+，911.29[2M+Na]。HR-TOF/MS444.1947，分子式为C27H28N2O4。13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ166.03、170.14、171.05为三个羰基碳信号，三个季碳信号(138.21、137.92、134.01)，15个处于较低场且对称的次甲基信号(131.16～126.11)，两个处于较高场的次甲基碳信号(54.76、49.06)，三个亚甲基碳信号(64.54、37.16、36.52)，一个甲基碳信号(20.50)。
在1HNMR(500MHz，DMSO-d6)中，δ8.25(d，J＝8.5Hz)和7.91(d，J＝8.1Hz)为N原子上连接的H信号，δ7.87～7.12为15个对称的芳基质子信号，δ4.82和4.30为两个次甲基质子信号，δ3.15、3.09、4.55、3.98、2.84为亚甲基碳上质子信号。
异荭草苷黄色粉末，UVλmax(nm MeOH)348，270，255。TOF-MS447[M+1]-，895[2M-1]-，471[M+Na]+，919[2 M+Na]+，449[M+1]+，487[M+K]+。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.55(1H，brs，5-OH)，7.44(1H，dd，J＝2.5Hz，9.0Hz，6′-H)，7.38(1H，d，J＝2.5Hz，2′-H)，6.90(1H，d，J＝9.0Hz，5′-H)，6.64(1H，S，3-H)，4.58(1H，d，J＝10.0Hz，1″-H)。13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ163.44(C-2)，102.38(C-3)，181.45(C-4)，160.59(C-5)，108.88(C-6)，163.44(C-7)，93.73(C-8)，156.27(C-9)，102.79(C-10)，121.56(C-1′)，112.92(C-2′)，145.95(C-3′)，150.44(C-4′)，116.00(C-5′)，118.82(C-6′)，73.18(C-1″)，70.50(C-2″)，78.95(C-3″)，70.19(C-4″)，81.35(C-5″)，61.34(C-6″)。
异牡荆苷 黄色粉末，UVλmax(nm MeOH)334，270，302i。TOF-MS455[M+Na]+，433[M+1]+，471[M+K]+，887[2M+Na]+，903[2M+K]+。
1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.46(1H，brs，5-OH)，7.85(2H，d，J＝8.5Hz，3′，5′-H)，6.94(2H，d，J＝8.4Hz，2′，6′-H)，6.71(1H，s，3-H)，6.42(1H，s，8-H)，4.56(1H，d，J＝9.8Hz，1″-H)。13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ163.32(C-2)，102.60(C-3)，181.73(C-4)，160.64(C-5)，108.95(C-6)，163.32(C-7)，93.79(C-8)，156.31(C-9)，102.95(C-10)，121.00(C-1′)，128.35(C-2′，6′)，116.01(C-3′，5′)，161.32(C-4′)，73.13(C-1″)，70.52(C-2″)，78.93(C-3″)，70.20(C-4″)，81.38(C-5″)，61.37(C-6″)。
权利要求
1.一种从白花败酱草中分离纯化高纯度金色酰胺醇酯、异荭草苷和异牡荆苷的方法，具体包括药材提取、粗提物制备及粗提物的分离纯化三道工序，其特征在于工序(1)采用不同浓度的乙醇依次提取药材获取提取物，工序(2)采用有机溶剂对提取物分段萃取并结合硅胶柱层析得到粗提物，工序(3)采用高速逆流色谱法对粗提物进行分离纯化，它包括配制构成固定相、流动相的溶剂体系，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱内，由进样阀进入制备好的粗提物样品，根据检测图谱接收目标组分。
2.按照权利要求1所述的一种从白花败酱草中分离纯化高纯度金色酰胺醇酯、异荭草苷和异牡荆苷的方法，其特征在于工序(1)中不同浓度乙醇为40％和95％的药用乙醇，先用40％乙醇提取药材后再用95％乙醇提取，合并提取液，减压浓缩至浸膏
3.按照权利要求1所述的一种从白花败酱草中分离纯化高纯度金色酰胺醇酯、异荭草苷和异牡荆苷的方法，其特征在于工序(2)中提取液萃取所用的有机溶剂为石油醚(60-90℃)和正丁醇，先用石油醚萃取，再用正丁醇萃取，得到石油醚和正丁醇萃取物。
4.按照权利要求1或3所述的一种从白花败酱草中分离纯化高纯度金色酰胺醇酯、异荭草苷和异牡荆苷的方法，其特征在于石油醚萃取物首先进行硅胶柱初分，用石油醚-乙酸乙酯剃度洗脱，接收石油醚∶乙酸乙酯(5∶1)洗脱流份，以此为进一步分离纯化样品。
5.按照权利要求1所述的一种从白花败酱草中分离纯化高纯度金色酰胺醇酯、异荭草苷和异牡荆苷的方法，其特征在于采用高速逆流色谱法对所得粗提物进行分离纯化，石油醚萃取物的硅胶柱分离物的高速逆流色谱法中所用的两相溶剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水。
6.按照权利要求1或5所述的一种从白花败酱草中分离纯化高纯度金色酰胺醇酯、异荭草苷和异牡荆苷的方法，其特征在于高速逆流色谱法中所用溶剂体系正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水的最佳配比为1∶1∶1∶1，上相为固定相，下相为流动相。
7.按照权利要求1或3所述的一种从白花败酱草中分离纯化高纯度金色酰胺醇酯、异荭草苷和异牡荆苷的方法，其特征在于对正丁醇部位粗提物的高速逆流色谱法进行分离纯化所用的两相溶剂系统为乙酸乙酯∶正丁醇∶水。
8.按照权利要求1或7所述的一种从白花败酱草中分离纯化高纯度金色酰胺醇酯、异荭草苷和异牡荆苷的方法，其特征在于高速逆流色谱法中所用两相溶剂系统乙酸乙酯∶正丁醇∶水的最佳配比为2∶1∶3，上相为固定相，下相为流动相。
全文摘要
本发明提供白花败酱草几种高纯度药用物质的快速制备方法。它包括(1)药材提取，(2)粗提物制备，(3)所得粗提物的高速逆流色谱分离纯化，它包括配制构成固定相、流动相的溶剂体系，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱内，由进样阀进样，根据检测谱图接收目标成分，所构成的两相溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水和乙酸乙酯、正丁醇、水组成。由该法经一步洗脱得到纯度高于98％的金色酰胺醇酯、异荭草苷和异牡荆苷。本方法具有制备量大、操作简便、快速、样品无损失等优点，易于推广使用。
文档编号C07C231/22GK1634875SQ20041006801
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月11日 优先权日2004年11月11日
发明者范国荣, 彭金咏, 洪战英, 柴逸峰, 吴玉田, 汪学昭 申请人:中国人民解放军第二军医大学