一种败酱草悬浮细胞的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种败酱草悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞培养、细胞悬浮体系的优化等步骤。本发明方法所制备的败酱草悬浮细胞中含有较高含量的次生代谢产物，本发明有助于败酱草资源的充分利用和保护败酱草种质资源的可持续生长，并且有利于建立败酱草悬浮细胞的大规模工厂化生产。
【专利说明】一种败酱草悬浮细胞的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组培条件下败酱草悬浮细胞的培养，属于植物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]败酱草，arvense Zi/?/?,又名:苏败酱、遏蓝菜，多年生草本，生于山坡草地、路旁。主产江苏、浙江、湖北、安徽。含白花败酱甙(villoside)、莫罗忍冬甙(morroniside)、番木鳘式(1ganin)等。性味性凉,味辛、苦。功能主治:清热解毒，祛瘀排脓。用于阑尾炎、痢疾、肠炎、肝炎、眼结膜炎、产后瘀血腹痛、痈肿疔疮。目前败酱草主要使用种子繁殖，每年6月种子成熟后进行采收、阴干，选取籽粒饱满无病虫害的种子装袋并存于冰箱。来年3月下旬春播。组培方法研究目前尚处于起步阶段，悬浮细胞培养还无人研究，悬浮细胞具有操作简单可控，生产成本低，繁殖率高等优点。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供败酱草悬浮细胞培养的快速繁殖方法，并通过硝酸镨对悬浮细胞调控获得生长良好、次生代谢物质含量高的悬浮细胞。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案:
选用败酱草幼嫩的叶片，用漂白粉浸泡三分钟，自来水冲洗55分钟，在超净工作台上用0.1 %的升汞消毒8分钟，无菌水冲洗5-6次，接种在MS+NAA0.4mg/L+2,4-D4.0mg/L+KT0.4mg/L愈伤组织诱导培养基上，培养条件为光照15001x，暗室培养，温度25-28°C，湿度70%-80%。将诱导出来的愈伤组织接入液体培养基MS+NAA0.2mg/L+2,4-D1.5mg/L+TDZ0.08mg/L+200g/L马铃薯汁培养基上进行悬浮细胞培养30天，待悬浮细胞生长稳定，在培养基中附加30硝酸镨进行败酱草悬浮细胞的调控。
[0005]采用本发明制备的败酱草悬浮细胞，生长速度快，能耗小，污染小，次生代谢物含量高。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007]实施例1
选用败酱草幼嫩的叶片，用漂白粉浸泡三分钟，自来水冲洗55分钟，在超净工作台上用0.1 %的升汞消毒8分钟，无菌水冲洗5-6次，接种在MS+NAA0.4mg/L+2,4-D4.0mg/L+KT0.4mg/L愈伤组织诱导培养基上，培养条件为光照15001x，暗室培养，温度25-28°C，湿度70%-80%。将诱导出来的愈伤组织接入液体培养基MS+NAA0.lmg/L+2,4-Dlmg/L+TDZ0.06mg/L+200g/L马铃薯汁培养基上进行悬浮细胞培养30天，待悬浮细胞生长稳定，在培养基中附加20硝酸镨进行败酱草悬浮细胞的调控。
[0008]实施例2选用败酱草幼嫩的叶片，用漂白粉浸泡三分钟，自来水冲洗55分钟，在超净工作台上用0.1 %的升汞消毒8分钟，无菌水冲洗5-6次，接种在MS+NAA0.4mg/L+2,4-D4.0mg/L+KT0.4mg/L愈伤组织诱导培养基上，培养条件为光照15001x，暗室培养，温度25-28°C，湿度70%-80%。将诱导出来的愈伤组织接入液体培养基MS+NAA0.2mg/L+2,4-D1.5mg/L+TDZ0.12mg/L+200g/L马铃薯汁培养基上进行悬浮细胞培养30天，待悬浮细胞生长稳定，在培养基中附加40硝酸镨进行败酱草悬浮细胞的调控。
[0009]实施例3
选用败酱草幼嫩的叶片，用漂白粉浸泡三分钟，自来水冲洗55分钟，在超净工作台上用0.1 %的升汞消毒8分钟，无菌水冲洗5-6次，接种在MS+NAA0.4mg/L+2,4-D4.0mg/L+KT0.4mg/L愈伤组织诱导培养基上，培养条件为光照15001x，暗室培养，温度25-28°C，湿度70%-80%。将诱导出来的愈伤组织接入液体培养基MS+NAA0.2mg/L+2,4-D1.5mg/L+TDZ0.06mg/L+200g/L马铃薯汁培养基上进行悬浮细胞培养30天，待悬浮细胞生长稳定，在培养基中附加 30硝酸镨进行败酱草悬浮细胞的调控。
【权利要求】
1.一种败酱草悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:败酱草的叶片经消毒处理，接种在MS+NAA0.4mg/L+2，4-D4.0mg/L+KT0.4mg/L愈伤组织诱导培养基上，将诱导出来的愈伤组织接入液体培养基 MS+NAA0.1-0.2mg/L+2,4-Dl-l.5mg/L+TDZ0.06-0.12mg/L+200g/L 马铃薯汁培养基上进行悬浮细胞培养30天，待悬浮细胞生长稳定，在培养基中附加20-40硝酸镨进行败酱草悬浮细胞的调控。
2.根据权利要求1所述的一种败酱草悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:所述的消毒处理为:选用败酱草幼嫩的叶片，用漂白粉浸泡三分钟，自来水冲洗55分钟，在超净工作台上用0.1 %的升汞消毒8分钟,无菌水冲洗5-6次。
3.根据权利要求1所述的一种败酱草悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:诱导愈伤组织的条件为光照15001x，暗室培养，温度25-28°C，湿度70%_80%。
4.根据权利要求1所述的一种败酱草悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:悬浮细胞培养中加入了马铃薯汁，可以缓冲PH的变化，且为悬浮细胞提供营养物质。
5.根据权利要求1所述的一种败酱草悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:在悬浮细胞中加入了 20-40硝酸镨，既可促进悬浮细胞的生长和增殖，又可调控其次生代谢物的含量。
【文档编号】C12N5/04GK104178449SQ201410462965
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】杨存 申请人:南京通泽农业科技有限公司