专利名称：表达sars冠状病毒核蛋白重组病毒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种重组病毒，尤其涉及一种能够在昆虫细胞中表达SARS冠状病毒核蛋白的苜蓿银蚊夜蛾核多角体病毒及其制备方法和应用。
背景技术：
严重急性呼吸道综合症(severe acute respiratory syndrome，SARS)是新出现的人类病毒性传染病。人类对SARS-CoV(SARS冠状病毒)具有高度的易感性。大量SARS-CoV感染者表现为隐形感染或一过性非典型肺炎症状。同时，种种迹象表明动物，特别是野生动物可能是该病毒的自然储藏宿主或传播宿主。开展广泛、严密的血清学调查，对流行病学监测、查清自然或传播宿主SARS-CoV源意义重大。
SARS-CoV的操作受严格生物安全要求限制。采用重组病毒结构蛋白取代细胞培养全病毒作为检测抗原具有重要意义。冠状病毒N蛋白较其它结构蛋白在病毒感染细胞具更高的丰度(Hiscox JA.et al.Quantification of individualsubgenomic mRNA species during replication of the coronavirs transmissiblegastroenteritis virus.Virus.Res.1995.36119-130.)，基因相对保守(Qin ED.et al.A complete sequence and comparative analysis of a SARS-associated virus.Chin.Sci.Mull.2003.48941-948.)，为优势抗原蛋白。SARS-CoV的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，简称N蛋白)存在多个B细胞优势抗原表位，基于E.coli表达N蛋白为抗原的ELISA方法和免疫斑点方法已被证明具有良好的敏感性和特异性(Patrick CY Woo，Suanna KP Lau，Hoi-wah Tsoi，et al.Relative rates ofnon-pneumonic SARS coronavirus infection and SARS coronavirus infection.Lancet.2004；363841-45.；Li ST，Lin L，Wang H.et al.The epitope study on theSARS-CoV nucleocapsid protein.2003.Geno.，Prot&Bioinfo.Vol.1.No.3.August；Ho-sheng Wu，Shu-Chun chiu，Tsan-chang Tseng.Serologic and Molecularbiologic methods for SARS-associated coronavirus infection，Taiwan.Emerginginfectious diseases.2004.Vol.10.No.2.February.)，但该方法同时存在表达产物翻译后的加工修饰与空间构象与SARS-CoV差别较大，制备过程繁琐，在亲和纯化过程中存在诸多繁琐和不利的变性条件以致不利于保持N蛋白的天然构型等缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够在昆虫细胞中表达SARS-CoV核蛋白的苜蓿银蚊夜蛾核多角体重组病毒(hvri-bh-bsn)。该苜蓿银蚊夜蛾核多角体重组病毒的保藏号为CGMCCNo.1279，保藏时间2004年12月27日，保藏地点中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。
本发明所要解决的另一技术问题是提供一种在昆虫细胞中表达SARS-CoV核蛋白的方法。
本发明所要解决的另一技术问题是通过以下技术方案来实现的将SARS-CoV NP(Nucleocapsid protein)基因(NS)亚克隆至pFastBac1，构建转移载体pFastBac1-NS，继续转化DH10Bac，挑取阳性重组病毒转染昆虫细胞，将所感染的昆虫细胞裂解，取上清即得。
本发明重组病毒感染昆虫细胞后能够高效表达SARS-CoV核蛋白(N蛋白)，所表达的重组SARS-CoV N蛋白与灭活SARS-CoV全病毒高免血清和感染耐过病人阳性血清均具有良好的免疫反应原性，进一步证实了N蛋白为SARS-CoV主要免疫原结构蛋白之一。
将本发明病毒感染昆虫细胞后所表达的重组SARS-CoVN蛋白(rSN)作为ELISA包被抗原与VeroE6生长全病毒包被抗原相比，不仅制备过程不受严格的P3+生物安全条件限制，而且具有更好的敏感性和特异性；与已报道的E.coli原核表达SARS-CoV重组N蛋白相比，不仅表达产物翻译后的加工修饰与空间构象与SARS-CoV更加接近，而且制备过程简化，只需加入PBS超声裂解重组病毒感染细胞即可，避免了亲和纯化过程中的繁琐和不利的变性条件，有利于保持rSN的天然构型。
表达rNS的sf9细胞可用于IFA，快速检测血清特异抗体反应，同样表现为良好的敏感性和特异性，显示出良好的应用前景。
总之，本发明苜蓿银蚊夜蛾核多角体重组病毒感染昆虫细胞后所表达的重组SARS-CoV N蛋白具有免疫反应原性好、制备简便、来源丰富等优点，可以替代VeroE6细胞生产的SARS-CoV全病毒抗原，制备安全经济、敏感特异的ELISA和IFA诊断试剂，应用于检测动物或人类SARS-CoV特异抗体的流行病学监测。
图1rSN Western-Blot检测。
图2rSN为ELISA抗原检测鸡抗SARS-CoV N蛋白特异血清IgY抗体。
图3rSN作为抗原IFA检测鸡高免血清。
图4rSN为ELISA抗原检测SARS-CoV感染耐过病人血清N蛋白特异IgG抗体。
以下通过实施例来进一步描述本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
具体实施例方式本发明苜蓿银蚊夜蛾核多角体重组病毒的制备及在昆虫细胞中的表达试验材料质粒pFastBacl和DH10Bac购自Invitrogen公司；SARS-CoV N蛋白基因cDNA克隆质粒pBSN(本发明人实验室保存)、sf9昆虫细胞(本发明人实验室保存)。鸡抗SARS-CoV高免阳性血清经由SARS-CoV BJo1株Vero E6细胞培养裂解上清反复免疫SPF鸡制备而成(哈尔滨兽医研究所制备提供)。
试验方法将NP基因亚克隆至pFastBac1(见invitrogen说明书，Bac-to-BacBaculovirus Expression System)。利用酶切和PCR鉴定阳性后，将其转化(参照下述文献的制备方法萨姆布鲁克，E·F·弗里奇，T·曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南(第二版)[M].北京科学出版社，1993，26674-683.)至DH10Bac，PCR筛选阳性重组克隆Bacmid-SS J(参照下述文献的制备方法萨姆布鲁克，E·F·弗里奇，T·曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南(第二版)[M].北京科学出版社，1993，26674-683.)。制备阳性重组克隆DNA(参照下述文献的制备方法萨姆布鲁克，E·F·弗里奇，T·曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南(第二版)[M].北京科学出版社，1993，26674-683.)，转染sf9细胞(见Invitrogen转染剂说明书)，待细胞病变阳性后进行重组病毒(rBac-SN)蚀斑纯化和病毒扩增(Cho-Hua Wan，Michael I，Riley，Reuel R.et al.Expression of Sendai VirusNucleocapsid Protein in a Baculovirus expression system and application todiagnostic assays for sendai virus infection.Journal of Clinical.Microbiology，Auguest，1995，p.2007-11.)，蛋白酶K-SDS-酚/氯仿抽提病毒基因组DNA，合成下述引物sn-f5’taaacgaattcgccacaatgtctgataatggacc3’和sn-r5’gcccatctgcagtgtgtggtcatcatgagt3’(下划线分别为EcoRI和PstI位点)，以sn-f、sn-r、M13+和M13-为引物PCR验证重组阳性病毒，重组阳性病毒即为本发明苜蓿银蚊夜蛾核多角体重组病毒(rBac-SN)，将重组病毒4℃保存备用。
rBac-SN种毒按1∶10体积比感染sf9细胞，72小时后1000g离心收获感染细胞，PBS离心洗涤两次，按10∶1用PBS重悬，三次冻融后超声波裂解细胞，离心后收获上清，将上清进行SDS-PAGE。将上清用12％的分离胶进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，估测N蛋白相对表达水平；测定细胞裂解物总蛋白质含量，计算N蛋白含量。同时，细胞裂解物SDS-PAGE电转印至尼龙膜(Ameresco)，5％脱脂乳封闭、PBST(0.05％ Tween20)洗涤，1∶500倍PBST稀释鸡抗SARS-CoV高免阳性血清为一抗，1∶10000倍PBST稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鸡IgG(Sigma)为二抗，DAB显色3～5分钟后用去离子水终止。
结果本发明苜蓿银蚊夜蛾核多角体重组病毒感染sf9细胞，所表达的重组蛋白产物约47KD，大小与预期值相符。以鸡抗SARS-CoV高免阳性血清为一抗，Western-Blot显示出特异的47KD检测蛋白(图1)。
实验结果说明本发明苜蓿银蚊夜蛾核多角体重组病毒在sf9细胞中获得高效表达，所表达的重组SARS-CoV N蛋白(rSN)的表达量约占全细胞总蛋白10％左右。
试验例1 rSN为间接ELISA抗原检测鸡抗SARS-CoV N蛋白特异血清IgY抗体试验一、试验材料1、供试样品本发明实施例所制备的rSN。
2、鸡抗SARS-CoV高免阳性血清经由SARS-CoV BJo1株Vero E6细胞培养裂解上清反复免疫SPF鸡制备，哈尔滨兽医研究所制备提供。
二、试验方法及结果分别以NaHCO3(pH＝9.6)缓冲液1∶100和1∶200稀释，按每孔100ul，即供试样品为每孔0.2ug和0.1ug，4℃包被96孔ELISA板(Nunc)过夜。5％脱脂乳PBST(0.05％Tween20)封闭，1∶250和1∶500稀释鸡抗SARS-CoV高免阳性血清为一抗，另设相同稀释倍数SPF鸡血清为对照；1∶10000倍PBST稀释HPR标记兔抗鸡IgG(Sigma)为二抗，PBST洗涤，底物OPD和TMB(Sigma)作用25min，2M硫酸终止反应后，测定OD值(Bio-Rad，Benchmark plus)，每个包被条件或血清稀释度至少设3个平行孔，取平均值计算P/N值。
试验结果包被rSN 0.1ug，250和500倍稀释鸡抗血清为被检一抗的OD490nm平均值分别为0.423和0.235，SPF鸡对照血清为0.064和0.056，P/N值分别为6.64和4.2；rSN包被量为0.2ug时，一抗血清250和500倍稀的OD490nm平均值分别为0.49和0.265，SPF鸡对照血清为0.064和0.06，P/N值分别为7.7和4.4(图2)。
试验结果说明，本发明重组病毒所表达的SARS冠状病毒核蛋白作为间接ELISA包被抗原具有良好的免疫反应原性。
试验例2 rSN为间接ELISA抗原检测SARS-CoV感染耐过病人血清N蛋白特异IgG抗体供试样品本发明实施例所制备的重组SARS冠状病毒核蛋白(rSN)。
试验材料SARS-CoV全病毒包被ELISA板、已稀释SARS-CoV感染耐过病人阳性血清和健康人阴性对照血清来自SARS-CoV特异IgG抗体检测试剂盒(国药试字S20030004，军事医学科学院微生物流行病研究所和中国科学院北京基因组研究所研制)。
试验方法及结果SARS-CoV包被的ELISA板检测人抗SARS-CoV康复病人阳性血清特异IgG抗体按试剂盒说明书进行，HRP标记抗人IgG为二抗，TMB为底物显色，测定OD450nm值。
将供试样品分别以NaHCO3(pH＝9.6)缓冲液1∶100和1∶200稀释，按每孔100ul，即重组N蛋白抗原量为每孔0.2ug和0.1ug，4℃包被96孔ELISA板(Nunc)过夜。5％脱脂乳PBST(0.05％Tween20)封闭，以已稀释SARS-CoV感染耐过病人阳性血清为一抗，另设相同稀释倍数的健康人血清为对照；1∶10000倍PBST稀释HRP酶标记抗人IgG为二抗，PBST洗涤，底物OPD和TMB(Sigma)作用25min，2M硫酸终止反应后，测定OD值(Bio-Rad，Benchmark plus)，每个包被条件或血清稀释度至少设3个平行孔，取平均值计算P/N值。
试验结果0.1ug、0.2ug rSN包被孔阳性被检血清OD450nm均值分别为2.3和2.8，健康人阴性对照被检血清OD450nm均值均为0.01；SARS-CoV全病毒包被孔阳性被检血清OD450nm均值为0.52，阴性对照血清OD450nm均值均为0.01；(图4)0.1ug rSN、0.2ug rSN和SARS-CoV全病毒三种包被抗原P/N值分别为46、57和10.4(阴性对照值为0.01按0.05计算)。试剂盒中提供的cutoff值为0.13+阴性对照血清的OD450nm均值。rSN为包被抗原OD450nm值均大于cutoff值。试验结果表明，rSN作为包被抗原用于检测人类SARS-CoV阳性血清的敏感性优于SARS-CoV全病毒包被抗原。
试验例3rSN作为抗原IFA检测SARS-CoV抗体试验材料鸡抗SARS-CoV高免阳性血清经由SARS-CoV BJo1株Vero E6细胞培养裂解上清反复免疫SPF鸡制备，哈尔滨兽医研究所制备提供；试验方法及结果以本发明重组病毒感染sf9细胞悬液制备涂片，1∶100倍稀释鸡抗灭活SARS-CoV全病毒高免血清为被检抗体。
具体方法如下将本发明实施例所制备的苜蓿银蚊夜蛾核多角体重组病毒感染细胞PBS洗涤后重悬滴于玻片上，自然晾干后用70％甲醇固定。分别以已1∶100稀释鸡抗SARS-CoV高免性血清和相应稀释的SPF鸡阴性血清为一抗。PBST洗涤后加入1∶5000稀释荧光素(FITC)标记的二抗，作用15min，PBST洗涤后荧光显微镜(Leica DMIRES2)观察结果。
试验结果鸡抗高免血清显示强阳性荧光信号(见图3a)，而1∶100稀释SPF鸡对照血清则荧光信号阴性(见图3b)，试验结果说明表达rSN昆虫细胞应用于IFA检测具有良好的敏感性和特异性。
权利要求
1.一种在昆虫细胞中表达SARS冠状病毒核蛋白的苜蓿银蚊夜蛾核多角体重组病毒(hvri-bh-bsn)CGMCC No.1279。
2.用权利要求1所述的重组病毒转化的宿主细胞。
3.按照权利要求2所述的宿主细胞，所述的宿主细胞为昆虫细胞。
4.按照权利要求3所述的宿主细胞，所述的昆虫细胞为sf9细胞。
5.制备权利要求1的苜蓿银蚊夜蛾核多角体重组病毒CGMCC No.1279的方法，步骤如下1)将SARS冠状病毒核蛋白基因亚克隆至pFastBacl，构建转移载体pFastBacl-SN，2)将步骤1)所得的转移载体转化DH10Bac，挑取阳性重组病毒即得。
6.一种重组SARS冠状病毒核蛋白，由下述方法制备而成将权利要求1的苜蓿银蚊夜蛾核多角体重组病毒CGMCC No.1279转染昆虫细胞，将所感染的昆虫细胞裂解，取上清即得。
7.按照权利要求6所述的方法，所述的裂解昆虫细胞的方法为超声裂解。
8.权利要求1的苜蓿银蚊夜蛾核多角体重组病毒CGMCC No.1279在制备动物或人类SARS-CoV特异抗体的流行病学监测药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种能够在昆虫细胞中表达SARS冠状病毒核蛋白的苜蓿银蚊夜蛾核多角体重组病毒，该重组病毒的保藏号为CGMCC No.1279，该重组病毒由下述方法制备而成将SARS冠状病毒核蛋白基因亚克隆至pFastBac1，构建转移载体pFastBac1－SN，将所得的转移载体转化DH10Bac，挑取阳重组病毒即得。试验证明，本发明重组病毒CGMCC No.1279能够在昆虫细胞中高效表达SARS冠状病毒核蛋白，所表达的核蛋白作为包被抗原用于检测人类SARS－CoV阳性血清的敏感性不亚于SARS－CoV全病毒。
文档编号C07K1/00GK1796564SQ20041010294
公开日2006年7月5日 申请日期2004年12月30日 优先权日2004年12月30日
发明者步志高, 胡森 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所