专利名称：作为hm74调节剂的呋塞米衍生物以及它们用于治疗炎症的用途的制作方法
背景技术：
G蛋白偶联受体(GPCRs)是涉及细胞信号传递的整合膜蛋白。GPCRs应答多种细胞外信号，包括神经递质、激素、有气味的东西和光，并能够传递信号而在细胞内引起第二信使应答。许多治疗药物均以GPCRs为靶点，因为这些受体介导大量生理应答，包括炎症、血管舒张、心率、支气管扩张，内分泌和蠕动。
许多疾病，例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、牛皮癣以及类风湿性关节炎(RA)，通常被认为具有涉及T辅助细胞、单核细胞-巨噬细胞和嗜酸性粒细胞的炎性病因。目前所用的皮质类固醇抗炎症疗法在治疗哮喘方面是有效的，但也伴有代谢和内分泌方面的副作用。对于通过肺或鼻黏膜吸收的吸入型制剂，情况可能也是如此。目前尚缺乏令人满意的治疗RA或COPD的口服疗法。
人单核细胞的HM74的分子克隆预示HM74是一种趋化因子受体(Nomura等人，Int.Immunol.(1993)5(10)1239-1249)。HM74主要表达在骨髓、脾脏、扁桃体和气管中。HM74的配体尚未知晓。
人体细胞含有一种相关的但又是独特的受体HM74A。HM74和HM74A的氨基酸序列约95％同一的。但是，HM74A已被去孤儿化而HM74却没有。烟酸或尼克酸是HM74A的配体(Wise等人，J.Biol.Chem.2789869-9874，2003)。烟酸是HM74的一种较差的激活剂。
鼠基因组含有HM74A基因，但不含HM74基因。
在某些情况下，HM74和HM74A显示了共调节作用。本发明的申请人采用Taqman-PCR发现，HM74和HM74A的表达在粒细胞内被TNFα诱导上调了50倍，在单核细胞内被LPS或TNFα诱导上调了10至20倍。HM74的表达在正常的人支气管上皮细胞内也被TH2细胞因子、IL-4或IL-13(已知是哮喘病因的重要因素)诱导上调了4-5倍。HM74和HM74A的表达在人初级嗜酸性粒细胞内被IL-5上调。最后，在一种鼠实验性哮喘模型中，肺的HM74A表达也被上调。
HM74和HM74A的有限组织分布及其调节提示了HM74和HM74A在炎性过程例如哮喘、RA和COPD中的作用。
鉴于GPCRs在疾病中的作用和通过调节GPCRs活性来治疗疾病的能力，GPCR配体的发现和鉴定可供开发出新的用于治疗其中涉及GPCR活性的疾病状态的组合物和方法。本发明发现和鉴定了激活HM74的分子，并提供了将此发现用于发现和治疗有关疾病的组合物和方法。
发明概述本发明涉及激活HM74但不激活HM74A的分子。
该分子具有以下结构 其中R是氢；或者是C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合，其中当X是N时X和Y可被稠合进一个或一个以上的环，其中该环是可以是支链的和可含有侧基的C3-C18杂环，可以是支链的和可含有侧基的C3-C18杂芳基，可以是支链的和可含有侧基的被取代的C3-C18环烷基，或者可以是支链的和可含有侧基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
在本发明的另一方面，公开了鉴定HM74调节剂的方法。例如，所感兴趣的方法包括以下步骤提供一种化学基团，提供表达HM74的细胞以及确定该化学基团是否调节HM74的信号传递活性，包括确定这种调节在存在或不存在本发明的激动剂时是否发生。在一个相关的方面，该化学基团可包括但不限于肽类、抗体、激动剂、反激动剂和拮抗剂。或者，在竞争性分析中可使用已知的调节剂来鉴定其它调节剂。
所研究的碱取代的氨茴酸或呋塞米可激活HM74。那些化合物在表达HM74的细胞(例如人体细胞，如CHO细胞、293细胞和L1.2细胞)内引起选择性的剂量响应性钙动员。未被HM74编码序列转化的对照细胞则未显示这种钙响应现象。所研究的化合物还在酵母报道基因分析中激活HM74并在转染L1.2细胞内引起趋化现象。
所研究的化合物通常是激动剂。因此，所研究的化合物可作为候选药物来研究。所研究的化合物还可用于鉴定激活、结合和/或调节HM74的其它分子，例如通过竞争性分析来鉴定。
本发明的另一方面包括治疗组合物，这类组合物包括核酸、抗体、多肽、激动剂、反激动剂和拮抗剂。此外，本发明的方法还包括通过给需要治疗的患者施用这类治疗组合物来治疗疾病状态和调节HM74信号传递活性的方法。
通过参考下文的发明详述和附图
，本发明的这些和其它方面将变得显而易见。此外，下文列出了多篇更详细描述某些步骤或组合物的参考文献。这些参考文献在此各自引入本文作为参考，如同它们各自被单独引入。
发明详述本发明基于发现了激活HM74的分子。
HM74编码序列是已知的(Nomura等人，出处同上)。本发明提供了获取、制备和使用HM74的方法。只要HM74的已知功能活性不受到有害的影响，HM74编码序列和氨基酸的变化是可接受的。
此化合物调节HM74活性且是HM74的激动剂，因此是治疗以炎症为特征的疾病例如哮喘的候选药物。
此化合物还可用于筛选HM74的拮抗剂。例如，使表达HM74的细胞接触测试化合物，然后再接触本发明的激动剂。然后确定测试化合物对例如钙动员的作用，以确定测试化合物是否降低本发明的激动剂所诱导的钙动员水平。
其它鉴定例如激动剂和反激动剂的分析也被认为落入本发明的范围。
适宜的这类化合物包括氨磺酰氨茴酸，例如具有以下结构的那些 其中R是氢；或C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合，其中当X是N时X和Y可被稠合进一个或一个以上的环，其中该环是可以是支链的和可含有侧基的C3-C18杂环，可以是支链的和可含有侧基的C3-C18杂芳基，可以是支链的和可含有侧基的被取代的C3-C18环烷基，或者可以是支链的和可含有侧基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
在本发明的另一方面，公开了鉴定HM74调节剂的方法。例如，所感兴趣的方法包括以下步骤提供一种化学基团，提供表达HM74的细胞以及确定该化学基团是否调节HM74的信号传递活性，包括确定这种调节在存在或不存在本发明的激动剂时是否发生。在一个相关的方面，该化学基团可包括但不限于肽类、抗体、激动剂、反激动剂和拮抗剂。或者，在竞争性分析中可使用已知的调节剂来鉴定其它调节剂。
术语“烷基”指直链或支链的烃基。其代表性的实例为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基和己基。该烃可含有一条或一条以上的不饱和双键或三键，例如烯烃和炔烃。
术语“烷氧基”指与氧原子结合的烷基。其实例为甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基。
“芳基”是芳香烃环。其实例包括苯基和萘基。
“杂原子”通常是与分子内典型原子不同的原子。因此，对于烃而言，任何不是碳或氢的原子均是杂原子。常见的生物学可接受的杂原子包括氧、硫和氮。
术语“杂芳基”指其中一个或一个以上碳原子被杂原子代替的芳基。其实例为吡啶基、咪唑基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、吡喃基、嘧啶基、哒嗪基、吲哚基、喹啉基、二氮杂萘基和异唑基。
术语“环烷基”指环烃。其实例为环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
“杂环”是其中一个或一个以上碳原子被杂原子替换的环烷基。其实例为吡咯烷基、哌啶基和哌嗪基。
术语“杂烷基”是其中一个或一个以上碳原子被杂原子替换的烷基。醚就是一种杂烷基。
术语“取代”指具有一个或一个以上取代基的基本有机基团。因此，原子或基团取代分子内的其它原子或基团。代表性的取代基包括卤素、C1-C8烷基、-CN、-NO2、烷氧基、羟基、硫化物、硫酸酯基、氨磺酰、氨基和酰氨基。
“支链”指在一个或一个以上位点含有一个或一个以上支链的结构。支链可以是如上所定义的R基团或侧基。
术语“环”指一个环状结构、若干环状结构中的一个环状结构或者若干个环状结构，其中若干个环中的两个或两个以上的环可以稠合，其中若干个环中的一个或一个以上的环可以是芳香环、可含有杂原子、可以被取代或者是它们的组合情形。环可以是双环或多环。环可含有长度不等的桥基。
“卤素”例如是氯、氟或溴。
术语“侧基”指与另一结构连接的原子或分子。因此，侧基可以是以上所定义的R基团、烷基、链烯基、芳基和环烷基等等。
术语“桥基”指两个结构之间的连接基。例如可含有杂原子、可以被取代、可以是支链的或者是它们的组合情形的非环状烃(如烷基、链烯基等)可连接两个环烃，例如芳基或环烷基。桥基还可位于环状结构的内部，连接该环状结构的至少两个原子。分子内桥基可含有0、1、2、3、4或更多个原子。分子内桥基可以是直链的、支链的或是被取代的。
所研究的特定化合物是如下定义的那些1)当R是氢且Q是氧或硫时，则W不是氢，或者一个或两个Z基团不是氢；2)当两个Z基团、W和R是氢且Q是氧时，则X和Y被合并在环状结构内。
所研究的化合物含有这样的官能团，所述官能团可衍生形成本领域已知的前药，例如为了提高生物利用度。因此，本发明涉及所研究的活性化合物的变体，它们在给药后被代谢为生物活性形式。这类生物活性药物前体又称为生物可逆的载体、潜在药物、给药系统或前药。(“BioreversibleCarriers in Drug Design”E.B.Roche编辑，Pergamon，NY，1987；“Prodrugs as Novel Drug Delivery Systems”，Higuchi & Stella编辑，美国化学会，DC，1975)药物的化学修饰是针对药效学的某些特定方面，例如如何提高必须穿过脂质屏障的极性化合物的利用度，如何稳定通常在体内易降解的化合物等等。
制造前药的其它原因包括生物活性药物的毒性、缺乏特异性、不稳定性、在吸收部位被代谢、吸收过快、患者顺应性(例如味道差或注射部位疼痛)、医生接受程度差或配方问题。
一种常见的修饰是酯化，它并不限于羧基的衍生化。制造这类衍生物例如胺、亚胺、含硫取代基以及酰胺的化学理论是现成的。
对于酯类，可以添加多种取代基，包括直链的、环状的或支链的烃，它可被取代、可含有一条或一条以上的双键或三键、可含有环状结构，烃的主链可含有一个或一个以上的杂原子，例如氮、硫或氧，等等。
当考虑构建R基团的酯时，应考虑的另一因素是酶切的敏感性。因此，立体电荷和构象因素对生物利用度而言是决定性的。例如，支链烷基可对酯酶活性位点的可接近性产生立体位阻，从而降低水解速率。这种情况既可以是不大合乎希望的(生物利用度被延迟)，也可以是合乎希望的(生物利用度被延长)。
在其它情况下，希望提高药物的水溶性。可达到此目标的取代基的实例包括丁二酸盐、硫酸盐、半丁二酸盐、磷酸盐、氨基酸、醋酸盐、胺等。
酰胺、二酰亚胺、碳酸盐、乙内酰脲(hydrantoin)等化合物中的氮原子可以被衍生化。适于与氮反应的基团包括羟甲基，或通常而言是羟烷基，以及包括酰氧烷基和酰基。
羰基也是衍生化的位点。衍生物的实例包括席夫碱、喔星、缩酮、缩醛、唑烷、噻唑烷和烯醇酯。
虽然以上所讨论的衍生物含有与药物以共价键连接的取代基，取代基也可以以其它方式与药物连接，例如氢键、范德华力、静电力、疏水作用等等。
衍生化的另一手段是利用那些通过非酶催化的机理从前药上除去的取代基。其实例包括含有以下的前药(2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基酯、曼尼希碱、唑烷、催化分子内水解的含有碱性侧链的酯类，以及经历分子内亲核环消除反应的酯或酰胺。对于含有苯酚、醇和胺的药物，环化机理是可得到的。[“Prodrug Design”(前药设计)Testa & Mayer，在“Encyclopedia of Pharmaceutical Technology”(制药工艺百科全书)，第2版.V.3，Swarbrick & Boylan编辑，Marcel Dekker，2002]。
因此，本发明考虑了利用已知的合成方法对所研究的化合物进行任何进一步的修饰，以获得这样的化合物，它们一旦使用即在体内反应或起作用以得到调节HM74活性的化合物。
本文中的术语“等效氨基酸残基”指当把两个或两个以上的序列匹配进行分析时、在蛋白质序列内占据基本相同位置的氨基酸。本发明的优选HM74多肽具有与野生型HM74的氨基酸序列足够同一的氨基酸序列。“野生型”指存在于指定种群内的最普遍的形式或等位基因，无论是在局部或较大范围内。本文所用的术语“足够同一”指第一个氨基酸或核苷酸序列含有足够或最少数量的与第二个氨基酸或核苷酸序列等同或相当的(例如带有相似侧链)氨基酸残基或核苷酸，从而使得第一和第二个氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，含有具有与HM74活性至少96％同一性的共同结构域的氨基酸序列在本文中被定义为足够同一。
如本文可互换使用的“HM74活性”、“HM74的生物活性”或“HM74的功能活性”指按照标准技术在体内或体外所测定的由HM74蛋白、多肽或核酸分子施加在HM74表达细胞上的活性。HM74活性可以是直接活性，例如与第二种蛋白关联或作用于其上的酶活性；也可以是间接活性，例如通过HM74与第二种蛋白的相互作用来介导的细胞信号传递活性。在优选的实施方案中，HM74活性至少包括以下活性中的一种或多种(i)与HM74信号传递途径中的蛋白质相互作用的能力；(ii)与HM74配体相互作用的能力；(iii)当被激活时改变宿主细胞的能力；(iv)当结合本发明的分子时被激活；以及(v)与细胞内的目标蛋白相互作用的能力。
本发明的一个方面涉及在HM74被激活时显示应答的细胞内表达HM74。如本文所用的术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及采用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。此核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。
“被分离”核酸分子指与核酸天然来源中存在的其它核酸分子分离的核酸分子。优选“被分离”核酸不含有这样的序列其在核酸所来自的生物体的基因组DNA中天然位于编码HM74的核酸的两侧(即位于核酸的5′端和3′端的序列)。被分离HM74核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述序列在核酸所来自的细胞的基因组DNA内天然位于可读框核酸分子的两侧。而且，“被分离”核酸分子(如cDNA分子)当以重组技术产生时可基本不含其它细胞物质或培养基；或者当以化学方式合成时可基本不含化学前体或其它化学物质。
本发明的核酸分子，例如编码HM74的核酸分子，可采用标准的分子生物学技术和序列(Nomura等人，同上文)被分离出。利用全部或部分的HM74序列，HM74核酸分子可采用标准的杂交和克隆技术来分离(例如Sambrook等人编辑，“Molecular CloningA Laboratory Manual，”第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中所述)。
本发明的核酸分子可按照标准PCR扩增技术、采用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板和适宜的低聚核苷酸引物来扩增。如此扩增的核酸可被克隆进适宜的载体并以DNA序列分析法来鉴定。此外，与HM74核苷酸序列对应的低聚核苷酸可通过标准合成技术制备，例如采用自动化DNA合成仪。
而且，本发明的核酸分子可以只包括编码HM74的核酸序列的一部分，例如，编码当配体与之结合时将产生可检测细胞内事件的胞外域和/或胞内结构域的片段。优选可检测的细胞内事件是当HM74在正常宿主细胞中被激活时所观察到的事件。
编码“HM74的生物活性部分”的核酸片段可通过以下步骤来制备分离HM74中编码具有HM74生物活性的多肽的部分，表达HM74蛋白的被编码部分(例如通过体外重组表达)以及评估HM74被编码部分的活性。
本发明还包括这样的核酸分子它们由于遗传密码的简并性而不同于所公开的HM74的核苷酸序列，因此编码与先前所公开的HM74蛋白基本上相同的HM74蛋白。
本领域技术人员将会理解，导致HM74氨基酸序列变化的DNA序列多态现象可存在于一个种群(例如人群)内。由于天然等位基因变异，这种HM74编码序列的遗传多态现象可存在于一个种群的个体中。等位基因是这样一组基因，它在特定遗传位点替代出现。如本文所用的术语“基因”和“重组基因”指包含编码HM74蛋白、优选哺乳动物HM74蛋白的可读框的核酸分子。如本文所用的术语“等位基因变体”指出现在HM74位点的核苷酸序列或者核苷酸序列编码的多肽。可选等位基因可通过对大量不同个体中的有关基因进行测序来鉴定。这可通过使用用以鉴定不同个体的相同遗传位点的杂交探针来容易地进行。作为天然等位基因变异的结果且不改变HM74功能活性的任何及所有这类核苷酸变体以及所得的HM74中氨基酸的多态现象或变异均包括在本发明的范围内。
此外，编码源自其它物种的HM74蛋白(HM74同系物)并具有不同于人HM74但具有基本相同活性的核苷酸序列的核酸分子也包括在本发明的范围内。基于与本文所公开的人HM74核酸的同一性，采用人cDNA或其部分作为杂交探针，按照标准杂交技术在严格的杂交条件下分离对应于天然等位基因变体和本发明的HM74cDNA同系物的核酸分子。
如本文所用的术语“在严格条件下杂交”旨在描述这样的杂交和洗涤条件，在这些条件下核苷酸序列通常保持杂交状态。这样的严格条件对本领域技术人员而言是已知的，可在“分子生物学的现有方案”(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6)。严格杂交条件的非限制性优选实例是于约45℃在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中进行杂交，随后于50-65℃在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤一遍或多遍。优选本发明的在严格条件下杂交为HM74序列或其互补序列的被分离核酸分子是天然产生的核酸分子。如本文所用的“天然产生的”核酸分子指具有天然产生(例如编码天然蛋白)的核苷酸序列的RNA或DNA分子。
除了可存在于种群中的HM74序列的天然产生的等位基因变体，本领域技术人员将会进一步理解，变化可通过突变引入核苷酸序列，从而导致被编码HM74中氨基酸序列的变化，而基本不改变HM74蛋白的生物活性。因此，可以进行核苷酸的取代，使得在“非必需”氨基酸残基上发生氨基酸的取代。“非必需”氨基酸残基是这样一种残基，它可从HM74的野生型序列改变而来，而生物活性基本未改变。“必需”氨基酸残基是重要生物活性所需的氨基酸残基。例如，在各物种的HM74中未保守或仅半保守的氨基酸残基对活性而言可能是非必需的，因此很可能成为改变的靶点。或者，在各物种的HM74蛋白中保守的氨基酸残基对活性而言可能是必需的，因此不大可能成为改变的靶点。
因此，本发明的另一方面涉及编码HM74蛋白的核酸分子，其中所述HM74蛋白的对活性而言非必需的氨基酸残基中包含了变化。这样的HM74蛋白不同于已知的氨基酸序列但保留了生物活性。在一项实施方案中，被分离核酸分子包括编码这样的蛋白的核苷酸序列所述蛋白包括与已知的HM74氨基酸序列至少96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
通过在已知的HM74的核苷酸序列上引入一个或多个核苷酸的取代、添加或删除以使得一个或多个核苷酸的取代、添加或删除引入被编码蛋白内，可产生这样的被分离核酸分子，它编码具有不同于已知HM74的序列的HM74蛋白。
突变可通过标准技术引入，例如定点突变和PCR介导的突变。优选在一个或多个预期非必需氨基酸残基上进行保守氨基酸的取代。“保守氨基酸的取代”指氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已有所定义。该家族包括具有如下侧链的氨基酸碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)，β-分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)以及芳香侧链(例如酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。因此，HM74内的预期非必需氨基酸残基优选被其它来自同一侧链家族的氨基酸残基替换。或者，可以沿全部或部分HM74编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变来引入，可筛选所得突变体的HM74生物活性以鉴定保留活性的突变体。在诱变后，被编码蛋白可被重组表达，蛋白质的活性可以被测定。
可用于产生所研究核酸的被修饰的核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧基甲氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖queosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖queosine、5-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤等。
影响HM74功能的一种方式是影响HM74的表达。因此，可以操纵转录水平以使HM74mRNA的水平较低或较高，从而使细胞表面的HM74表达水平较低或较高。实现这种操纵的一种方式是利用可调节的启动子。该启动子可通过例如同源重组被引入基因组内靠近HM74编码序列的适宜位点。
因此，本发明的另一方面涉及抗HM74抗体。本文所用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原如HM74的抗原结合位点的分子。特异性结合HM74的分子指结合HM74但基本不结合样品(例如天然含有HM74的生物样品)中其它分子的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括F(ab)和F(ab′)2片段，它们可通过用酶如胃蛋白酶处理抗体而产生。本发明提供了结合HM74的多克隆和单克隆抗体。本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合”指这样的抗体分子群体，它们仅含有一类能够与HM74的特定表位发生免疫反应的独特型或抗原结合位点的克隆。因此，单克隆抗体组合通常显示出对特定HM74蛋白表位的单一结合亲合力。
如本领域内所知的，可以制备出各种其它抗原结合形式的抗体，包括片段、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体等。
本发明的另一方面涉及含有编码HM74(或其部分)的核酸分子的载体、优选是表达载体。如本文所用的术语“载体”指能够运载与它相连的其它核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它指其它DNA片段可以连接上去的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中其它DNA片段可连接到该病毒的基因组内。某些载体在宿主细胞内能自主复制(例如具有细菌复制起始区的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在被引入宿主细胞时被整合到宿主细胞的基因组内，因此与宿主基因组一起被复制。而且，某些载体(表达载体)能够指导与它们可操作性连接的基因的表达。一般而言，用于重组DNA技术的表达载体通常是质粒(载体)形式。但是，本发明还意在包括起等效作用的其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
本发明的重组表达载体包括本发明的核酸，它是适于在宿主细胞内表达核酸的形式。这意味着，重组表达载体包括以用于表达的宿主细胞为基础所选择的一种或多种调控序列，该调控序列与欲表达的核酸可操作地连接。在重组表达载体内，所谓“可操作地连接”旨在表示所考虑的核苷酸序列以便于该核苷酸序列表达(例如在体外转录/翻译系统内或当载体被引入宿主细胞时在宿主细胞内表达)的方式与调控序列连接。术语“调控序列”意在包括启动子、增强子以及其它表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。文献中描述了这类调控序列，例如Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology Vol.185，Academic Press，San Diego，CA(1990)。调控序列包括在许多类型的宿主细胞内指导核苷酸序列组成性表达的调控序列(例如组织特异性的调控序列)。本领域技术人员应理解表达载体的设计可取决于诸如欲转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白表达水平等因素。本发明的表达载体可导入宿主细胞，从而产生由如本文所述的核酸编码的蛋白质或肽(例如HM74、HM74的突变体形式、融合蛋白等)。
本发明的重组表达载体可设计用于HM74在原核或真核细胞内的表达，这些细胞为例如细菌细胞，如大肠杆菌，昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞。上文提到的Goeddel一文对于适合的宿主细胞作了进一步讨论。或者，重组表达载体也可以在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。
在另一实施方案中，HM74表达载体是酵母表达载体。在酵母，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)内表达的载体实例包括pYepSecl(Baldari等人，EMBO J.(1987)6229-234)、pMFa(Kurjan等人，Cell(1982)30933-943)、pJRY88(Schultz等人，Gene(1987)54113-123)、pYES2(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)，以及pPicZ(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)。
或者，可使用杆状病毒表达载体使得HM74在昆虫细胞中表达。可在经培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人，Mol.Cell.Biol.(1983)32156-2165)和pVL系列(Lucklow等人，Virology(1989)17031-39)。
在另一实施方案中，使用了哺乳动物表达载体使得本发明的核酸被表达在哺乳动物细胞里。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，Nature(1987)329840)和pMT2PC(Kaufman等人，EMBO J.(1987)6187-195)。当用于哺乳动物细胞里时，表达载体的控制功能通常是由病毒调控元件提供的。例如，常用的启动子是从多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿病毒40衍生而来的。关于其它原核细胞和真核细胞的适宜表达系统，参阅上文提及的Sambrook等人的第16章和第17章。
对于哺乳动物细胞的稳定转化，已知取决于所用的表达载体和转化技术，只有一小部分细胞可以将外源DNA整合进基因组。为了鉴别和选择整合体，通常将编码选择标记(例如对抗生素的抗性)的基因与目的基因一起导入宿主细胞。优选的选择标记包括那些赋予对某些药物例如G418、潮霉素和甲氨蝶呤的抗药性的选择标记。编码选择标记的核酸可导入宿主细胞内与编码HM74的载体相同的载体，或可导入不同的载体。用所导入核酸稳定地转染的细胞可通过药物选择来鉴定(例如整合了选择标记基因的细胞将存活，而其它的细胞则死亡)。
与HM74结合并激活HM74的调节剂为氨磺酰氨茴酸，又称为呋塞米类化合物。
该分子具有以下结构 其中R是氢；或C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合，其中当X是N时，X和Y可被稠合进一个或一个以上的环，其中该环是可以是支链的并可含有侧基的C3-C18杂环，可以是支链的并可含有侧基的C3-C18杂芳基，可以是支链的并可含有侧基的被取代的C3-C18环烷基，或者可以是支链的并可含有侧基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
术语“烷氧基”指与结合氧原子的烷基。其实例为甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基。
“芳基”是芳香烃。其实例包括苯基和萘基。
“杂原子”通常是与分子内典型原子不同的原子。因此，对于烃而言，任何不是碳或氢的原子均是杂原子。常见的生物学可接受的杂原子包括氧、硫和氮。
术语“杂芳基”指其中一个或一个以上碳原子被杂原子代替的芳基。其实例为吡啶基、咪唑基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、吡喃基、嘧啶基、哒嗪基、吲哚基、喹啉基、二氮杂萘基和异唑基。
术语“环烷基”指环烃。其实例为环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
“杂环”是其中一个或一个以上碳原子被杂原子替换的环烷基。其实例为吡咯烷基、哌啶基和哌嗪基。
术语“杂烷基”是其中一个或一个以上碳原子被杂原子替换的烷基。醚就是一种杂烷基。
术语“取代的”指基本有机基团具有一个或一个以上取代基。因此，原子或基团取代分子内的其它原子或基团。代表性的取代基包括卤素、C1-C8烷基、-CN、-NO2、烷氧基、羟基、硫化物、硫酸酯基、氨磺酰、氨基和酰氨基。
所研究的特定化合物是如下定义的那些1)当R是氢且Q是氧或硫时，则W不是氢，或者一个或两个Z基团不是氢；2)当两个Z基团、W和R是氢且Q是氧时，则X和Y组合在环结构内。
能够产生生物相容的盐的氨茴酸阳离子是钠、钾或铵基类的阳离子。
所研究的氨磺酰氨茴酸可按照美国第4,406,895和5,739,361号专利所提供的方法来制备。于是，按照本文所教导的方法制备了亚硝酸盐中间体，其水解而产生所研究的对应的羧酸。然后，该羧酸又转化为对应的盐。
此类呋塞米化合物就是通常所称的利尿剂。因此，使用这类化合物来调节HM74的做法是新颖且出乎意料的。
所研究的呋塞米类化合物能激活HM74，但不能激活HM74A。
本发明的呋塞米类化合物HM74调节剂，可掺入各种适合于给药方式的药物组合物。这类药物组合物通常含有该活性成分和可药用载体。如本文所用的术语“可药用载体”旨在包括适合于药物施用的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。将这样的介质和试剂用于医药活性物质的做法是本领域内众所周知的。除了那些常规的介质或试剂与活性化合物不兼容的情况，这类介质和试剂在组合物内的使用是所预期的。辅助的活性化合物也可掺入组合物内。
本发明的药物组合物是按照预定的给药途径而配制的。给药途径的实例包括胃肠道外途径，例如静脉内、皮内、皮下、口腔(例如吸入)、经皮(局部)、经粘膜和直肠给药。用于胃肠道外途径、皮内或皮下给药的溶液或悬浮液可包括以下组分无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如EDTA；缓冲剂，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及渗透压调节剂，例如氯化钠或葡萄糖。pH可用酸或碱，例如HCl或NaOH来调节。肠胃外制剂可密封于安瓿瓶、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶。
适合于注射用的药物组合物包括用于实时制备无菌注射液或分散剂的无菌水溶液(若为水溶性)或分散剂以及无菌粉末。对于静脉内给药，适合的载体包括生理盐水，抑菌水、Cremophor EL(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，该组合物都必须无菌而且应具有一定的流动性以便于注射。组合物在制造和储存条件下必须是稳定的，必须加以防腐以防止微生物例如细菌和真菌的污染。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其适宜混合物的溶剂或分散介质。为了维持适宜的流动性，可使用包衣，例如卵磷脂；若在分散剂的情况下，则可通过维持所需的颗粒大小来维持流动性；以及使用表面活性剂。为了预防微生物的作用，可使用多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞(thimerosal)等。在许多情况下，优选的是在该组合物内加入等渗剂，例如糖，多元醇，如甘露醇和山梨糖醇，以及氯化钠。可注射型组合物的延迟吸收，可通过在组合物内加入延迟吸收的试剂而达到，例如加入单硬酯酸铝和明胶。
无菌可注射溶液的制备是将所需量的该活性化合物根据需要与上述一种成分或几种成分的组合置入适宜的溶剂中，随后过滤除菌。通常，分散剂的制备是将该活性化合物掺入无菌载体，后者含有基本的分散介质以及所需的上面列举的其它成分。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥法和冷冻干燥法，此法从先前经灭菌过滤的溶液产生该活性成分的粉末，再加入任何其它所需的成分。
口服药物组合物一般含有惰性稀释剂或可食用的载体。组合物可被密封在明胶胶囊内或被压制成片剂。为了口服治疗给药的目的，该活性化合物可与赋形剂一起成型并以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。口服组合物也可用某种液态载体制备成糖浆或液体制剂而作为漱口液使用，其中，液态载体中的化合物是经口腔途径施用，或者漱口后吐出，或者咽下。
药学上兼容的粘合剂和/或佐剂材料可作为药物组合物的组成部分加入。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有以下任何成分或性质类似的化合物粘合剂，例如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如藻酸、Primogel(羟乙酸淀粉钠)或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
对于吸入给药方式，该化合物可从含有适宜推进剂(例如二氧化碳类的气体)的加压容器、分配器或喷雾器以气雾剂喷雾的形式给药。
系统性给药也可通过经粘膜或经皮给药的方式。对于经粘膜或经皮给药，在制剂中使用了透过渗透屏障的渗透剂。这样的渗透剂在本领域内是众所周知的，例如，用于经粘膜给药的渗透剂包括洗涤剂、胆汁盐，以及梭链孢酸衍生物。经粘膜给药可通过使用鼻腔喷雾或栓剂来完成。对于经皮给药，如本领域内众所周知的，可将活性化合物配入软膏、药膏、凝胶或乳膏。
该化合物也可制成栓剂的形式(例如使用常规的栓剂基料，如可可脂和其它甘油脂)，或制成保留灌肠剂的形式用于直肠递送。
在一个实施方案中，该活性化合物与某种防止该化合物过快地从体内清除的载体一起制成药剂，例如控制释放的剂型，包括植入物和微胶囊递送系统。可以使用生物降解、生物兼容性聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。
制备这类制剂的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。各种材料也可以通过商业途径从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.等公司购得。脂质体悬浮液(其含有与单克隆抗体一起靶向作用于被感染细胞的脂质体)也可用作为可药用载体。这些载体可按照本领域技术人员已知的方法制备，例如，按照美国第4,522,811号专利所述的方法制备。
为了给药方便和剂量一致，以剂量单位形式配制口服或胃肠道外给药的组合物是特别有利的。本文中所谓的剂量单位形式指适合作为待治疗患者的单位用量且物理上独立的单位，每个单位含有根据所需的药物载体而算出的预定量活性化合物，以产生所希望的治疗效果。取决于疾病的类型和严重性，给患者输入约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1至20mg/kg)的活性成分是一种可供选择的初始剂量，无论是一次或多次地分别给药，还是连续地注入。典型的日剂量范围可从约1μg/kg至100mg/kg或以上，取决于以上提到的各种因素。对于几天或更长时间的重复性给药，根据具体情况，应维持治疗直至出现所希望的抑制疾病症状的效果。但是，其它剂量方案也是有用的。治疗的进展情况可以容易地通过常规的技术和分析予以监测。WO 94/04188专利公开了一个示范性给药方案。本发明的单位剂量形式的规格受制于且直接依赖于该活性化合物的独特性质和所欲达到的具体治疗效果，以及用于治疗患者的这种活性化合物在配制技术方面的固有局限性。
该药物组合物可密封在容器、包装袋或分配器内，并附上使用说明。
所研究的HM74调节剂可用于各种筛选分析和治疗方法(例如治疗和预防)。所研究的HM74调节剂可用于筛选其它调节HM74活性或表达的药物或化合物，也可用于治疗其特征为炎症的疾病。所研究的调节剂还可用于因HM74蛋白的产生不足或过度、或所产生的HM74蛋白类型与野生型HM74蛋白相比活性下降或异常而引起的各种情况。本发明还涉及通过本文所述的筛选试验所鉴定的新颖HM74调节剂及其在治疗方面的应用。
本发明提供了一种鉴定调节剂的方法(本文中又称为“筛选分析”)。该调节剂也就是与HM74蛋白结合或对例如HM74的表达或HM74的活性具有刺激或抑制作用的候选或测试化合物或试剂，或测试化合物或试剂(例如肽、肽模拟物、小分子、抗体或其它药物)。
在一个实施方案中，本发明提供了分析方法，以筛选那些可结合HM74或可调节其活性的候选化合物或测试化合物。因此，这些筛选分析方法可用于鉴定其它调节HM74的呋塞米类化合物。这些调节剂也可用于竞争分析法以鉴定其它调节剂，例如HM74拮抗剂。
在一个实施方案中，分析是以细胞为基础而进行的。在该分析中，使在细胞表面表达膜结合形式HM74的细胞与测试化合物接触，然后测定该测试化合物激活HM74的能力。该细胞例如可以是酵母细胞或源自哺乳动物的细胞。可通过以下方式来测试该测试化合物激活HM74的能力例如，使该测试化合物与放射性同位素或酶标记偶联；这种偶联使得可通过检测与HM74形成的复合体中的标记化合物或HM74的定位来测定该测试化合物与HM74的结合。例如，可以用125I、35S、14C或3H直接地或间接地标记测试化合物，该放射性同位素可通过射电辐射(radioemission)直接计数或通过闪烁计数而测出。或者，该测试化合物可用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或萤光素酶等酶促标记，该酶促标记可通过测定适宜底物向产物的转化来检测。在优选的实施方案中，该分析包括使在细胞表面表达膜结合形式HM74的细胞与结合HM74的已知化合物以及测试化合物接触，然后确定该测试化合物与该已知化合物竞争性与HM74相互作用的能力。
在另一实施方案中，分析是基于细胞的分析。该分析包括使在细胞表面表达膜结合形式HM74的细胞与测试化合物接触，然后测定该测试化合物调节(例如刺激或抑制)HM74活性的能力。例如，可通过测定该测试化合物激活或抑制HM74的能力来确定该测试化合物调节HM74活性的能力。当激活的HM74与信号通路相关的胞内或胞膜靶分子相互作用时，这一点可能就很清楚了。如本文所用的“靶分子”是指实际上与HM74结合或相互作用的分子，例如表达HM74的细胞表面上的分子、另一细胞表面的分子、胞外环境中的分子、与细胞膜的内表面结合的分子或细胞质分子。HM74靶分子可以是非HM74分子。在一个实施方案中，HM74靶分子是信号转导通路的组分，它促进胞外信号(例如由于化合物与HM74的结合而产生的信号)经过细胞膜转导进入该细胞。又如，靶分子也可以是具有催化活性的另一中细胞间蛋白质或促进下游信号分子与HM74结合的蛋白质。
测定HM74与HM74靶分子结合或与HM74靶分子相互作用的能力，可以通过上述的一种测定直接结合的方法来实现。在优选的实施方案中，测定HM74与HM74靶分子结合或与HM74靶分子相互作用的能力，可以通过测定这些靶分子的活性来实现。例如，靶分子的活性可以通过以下方式来测定检测该靶分子对细胞第二信使(例如胞内Ca2+、甘油二酯、IP3等)的诱导，检测该靶分子对适宜底物的催化活性/酶活性，检测报道基因(例如与编码可检测标志例如萤光素酶的核酸可操作地连接的HM74应答调节元件)的诱导，或检测细胞的应答例如细胞分化或细胞增殖。
在另一实施方案中，本发明的分析是一种无细胞分析，包括使HM74与测试化合物接触，并确定该测试化合物与HM74结合的能力。如上所述，该测试化合物与HM74的结合可直接地或间接地测定。在优选的实施方案中，该分析包括使HM74与本发明的一种已知化合物和测试化合物同时接触，并确定该测试化合物影响上述已知化合物的HM74活性的能力。确定该测试化合物与HM74相互作用的能力，包括确定该测试化合物与上述已知化合物的结合相比优先与HM74结合的能力。
在另一实施方案中，该分析是一种无细胞分析，包括使HM74与测试化合物接触，并确定该测试化合物调节(例如刺激或抑制)HM74的活性的能力。确定该测试化合物调节HM74活性的能力，可利用上述的一种测定直接结合的方法，通过确定被激活的HM74与HM74靶分子结合的能力而实现。在备选实施方案中，确定该测试化合物调节HM74活性的能力，可通过确定HM74进一步调节HM74靶分子的能力来实现。例如，可按如上所述的方法来确定该靶分子对适宜底物的催化/酶促活性。
在另一实施方案中，该无细胞分析包括将HM74与可结合HM74已知化合物与测试化合物接触，并测定该测试化合物与HM74相互作用的能力，其中，确定该测试化合物与HM74相互作用的能力包括确定该HM74与HM74靶分子优先结合或优先调节HM74靶分子活性的能力。
受体可被非配体分子激活，这些非配体分子未必抑制配体的结合但可引起受体的结构变化，从而使得G蛋白结合，或受体的聚集、二聚化或群集，这可引起活化。
本发明的无细胞分析既适用于可溶形式的HM74，也适用于膜结合形式的HM74。就包括膜结合形式HM74的无细胞分析而言，使用某种增溶剂也许是可取的，从而可使膜结合形式的HM74保持在溶液中。这类增溶剂的实例包括非离子型洗涤剂，例如正辛基葡萄糖苷、正十二烷基葡萄糖苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡萄糖酰胺、癸酰基-N-甲基葡萄糖酰胺、Triton X-100、Triton X-114、Thesit、异十三烷基聚(乙二醇醚)n、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)或N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐。
在另一实施方案中，当HM74被表达在宿主细胞上时，它受到改变而处于恒定的激活状态。改变HM74可以使受体无需与配体结合即具有活性。使受体激活的一种方法是改变HM74，使的在未与配体结合的情况下即与G蛋白相互作用。这种改变模拟该受体在与配体结合时发生的构象变化，使得受体能够结合胞内G蛋白。WO 00/22129提供了这样的一种方法。
WO 00/22129教导了位于TM6和IC3区域中产生组成性活性的特定氨基酸。将这些特定氨基酸导入HM74的各种方法是本领域中已知的，例如定点诱变、亚克隆等方法。然后，被改变的HM74分子被表达在宿主细胞内，产生具有组成性活性的HM74。
被激活的细胞于是暴露于疑为HM74激动剂、拮抗剂、逆激动剂等的分子，即可改变HM74活性的分子。在药物开发过程中用已知的方法靶定改变G蛋白活性的分子用于治疗与HM74代谢改变相关的疾病。
在本发明上述分析方法的许多实施方案中，可能需要固定HM74或靶分子以促进其中任一种或两种蛋白质的复合形式与非复合形式的分离，并便于实现分析的自动化。测试化合物与HM74的结合，或在候选化合物存在或不存在的情况下HM74与靶分子的相互作用，可在任何适合于容纳该反应物的容器内实现。这类容器的实例包括微量滴定板、试管和微离心管。在一个实施方案中，可以提供融合蛋白，它增加了一个结构域使得上述任一种或两种蛋白均可与基质结合。例如，谷胱甘肽-S-转移酶/HM74融合蛋白、或谷胱甘肽-S-转移酶/靶融合蛋白可被吸附在谷胱甘肽Sepharose珠上(Sigma Chemical，St.Louis，MO)、或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上。然后，该复合体再与测试化合物和未被吸附的靶蛋白或HM74蛋白结合，该混合物在有利于复合体形成的条件(例如在盐和pH的生理条件)下温育。温育完毕后，洗涤Sepharose珠或微量滴定板孔，以除去任何未结合的组分，并例如按照如上所述的方法直接或间接地测量复合体的形成。或者，可将该复合体从基质上解离下来，并使用标准技术测定HM74结合或活性的水平。
其它将蛋白质固定在基质上的技术也可用于本发明的筛选分析中。例如，可利用生物素和链霉抗生物素蛋白的缀合固定HM74，或其靶分子。生物素化的HM74或靶分子可以用本领域内众所周知的技术(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)，从生物素-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)来制备，并固定在包被链霉抗生物素蛋白的96孔板(PierceChemicals)内。或者，可与HM74或靶分子反应但不干扰HM74蛋白与靶分子结合的抗体可在该板的孔内衍生，未结合的靶分子或HM74被抗体缀合而被捕获在孔内。检测这类复合体的方法，除了上述用于被谷胱甘肽-S-转移酶(GST)固定的复合体的方法以外，还包括使用易与HM74或靶分子反应的抗体所进行的复合体免疫检测法，以及依赖于检测HM74或靶分子相关酶活性的酶联分析。
在另一实施方案中，HM74表达的调节剂通过以下方法得到了鉴定将细胞与候选化合物接触，并测定HM74 mRNA或蛋白质在细胞中的表达。在该候选化合物存在和不存在这两种情况下，对HM74 mRNA或蛋白质的表达水平进行了比较。然后，在上述比较的基础上，该候选化合物即可被鉴定为HM74表达的调节剂。例如，如果该候选化合物存在时HM74mRNA或蛋白质的表达水平高于(统计学上显著地高于)该候选化合物不存在时的表达水平，则该候选化合物即可被鉴定为HM74 mRNA或蛋白质表达的刺激剂或激动剂。或者，如果该候选化合物存在时HM74 mRNA或蛋白质的表达水平低于(统计学上显著地低于)该候选化合物不存在时的表达水平，则该候选化合物即被鉴定为HM74 mRNA或蛋白质表达的抑制剂或拮抗剂。如果在配体或激动剂存在时，或在组成性HM74中，HM74的活性下降到基线以下，则该候选化合物即可被鉴定为逆激动剂。HM74mRNA或蛋白质在细胞内的表达水平，可通过本文所述的检测HM74mRNA或蛋白质的方法测定。
可以制备大量的纯HM74，也可确定可能的功能区的构象的物理特征，以用于合理的药物设计。例如，该分子的IC3区域和EC结构域都是特别值得注意的区域。一旦识别了某一区域的形状和离子构型，就可以设计与这些区域相互作用的候选药物，然后在完整的细胞、动物和患者中进行试验。可产生这种结构信息的方法包括X-射线晶体学、核磁共振、分子建模等等。该3-D结构还可导致其它已知蛋白中类似构象部位的识别，对于这些部位存在着针对某特定部位起作用的已知药物。这些药物或其衍生物，也许可用于HM74。
本发明还涉及通过上述筛选分析所鉴定的新颖试剂及其治疗用途。
对于与HM74的表达或活性异常相关的疾病，本发明为具有该疾病风险(或易患病的)人员或已经患有该疾病的患者提供了预防和治疗的方法。这类疾病包括但不限于炎性疾病，例如，哮喘、慢性阻塞性肺病和类风湿性关节炎。
本发明的一个方面提供了通过给患者施用调节HM74的表达或调节至少一种HM74活性的治疗剂，预防与HM74的表达或活性异常相关的疾病或状况的方法。对于具有因HM74的表达或活性异常所引起或所促成的疾病风险的受试者，可以通过例如本文所述的诊断或预测分析方法的一种或数种的组合来鉴别。可在以HM74异常为特征的症状表现前施用预防性治疗剂，从而可预防疾病或失调，或者延缓其进程。取决于HM74异常的类型，可用HM74激动剂或HM74拮抗剂对患者进行治疗。根据本文所述的筛选分析，可以确定合适的治疗剂。
本发明的另一个方面涉及出于治疗目的而调节HM74的表达或活性的方法。本发明的调节方法涉及让细胞接触可调节与细胞结合的HM74的一种或多种活性的试剂。调节HM74活性的试剂可以是本文所述的试剂，例如呋塞米、核酸或者蛋白质、HM74蛋白的天然存在的同源配体、肽、HM74肽模拟物或其它小分子。在一个实施方案中，该试剂能刺激HM74的一种或多种生物学活性。在另一实施方案中，该试剂能抑制HM74蛋白的一种或多种生物学活性。这种抑制性试剂的实例包括抗HM74抗体。这些调节方法可以在体外实现(例如将细胞与该试剂一起培养)，或备选地也可以在体内实现(例如对患者施用该试剂)。同样地，本发明提供了对患有以HM74的异常表达或异常活性为特征的疾病或失调的患者进行治疗的治疗方法。在一个实施方案中，该方法涉及施用调节(例如上调或下调)HM74的表达或活性的试剂(例如通过本文所述的筛选分析方法鉴定的试剂)或多种试剂的组合。
在HM74被异常下调的情况下和/或在HM74活性的提高可能产生有益效果的情况下，刺激HM74的活性是可取的。反之，在HM74被异常上调情况下和/或在HM74活性的降低很可能产生有益效果的情况下，抑制HM74的活性是可取的。
本发明将通过以下实施例进一步说明，但它们不应被解释为是限制性的。本申请自始至终引用的所有文献、专利和公开的专利申请均引入本文作为参考。
实施例1-表达HM74的哺乳动物细胞的制备编码hHM74的cDNA被克隆入表达载体并转染入哺乳动物细胞，例如CHO细胞或293细胞。
为了制备过表达HM74的哺乳动物细胞，将哺乳动物细胞接种于6孔35mm组织培养板中(每孔3×105个哺乳动物细胞(美国典型培养物保藏中心(ATCC)目录号CRL-1573))，每孔加2ml含10％胎牛血清(Gibco/BRL公司，目录号1600-044)的DMEM培养基(Gibco/BRL公司，目录号11765-054)。
然后，将细胞置于CO2培养箱中37℃下培育，直至细胞为50-80％汇合。将所克隆的HM74cDNA核酸序列插入pcDNA3.1克隆载体中(Invitrogen公司，目录号V790-20)。用100μl无血清F12 Ham培养基稀释2μg DNA。另取25μl Lipofectamine试剂(Life Technologies公司，目录号18324-020)，用100μl无血清F12 Ham培养基稀释。然后将DNA溶液和Lipofectamine溶液缓缓混合，于室温下培养45分钟，以形成DNA-脂质复合体。
将细胞用2ml无血清F12 Ham培养基洗涤一次。对于每一次转染(每块6孔板上共6次转染)，分别将0.8ml无血清F12 Ham培养基加入含有DNA-脂质复合体的溶液(总体积0.2毫升)中，并缓缓混匀。然后将所产生的混合物(以下称为“转染混合物”)覆盖(0.8ml+0.2ml)在洗涤过的细胞上。不加抗细菌试剂。再将细胞与脂质-DNA复合体一起置于CO2培养箱中于37℃共同培养16小时以发生转染。
培养结束后，保留该转染混合物，并在细胞上覆盖1ml含10％胎牛血清的F12 Ham培养基。转染18小时后，吸出覆盖在细胞上的培养基。然后用pH 2-4的PBS(Gibco/BRL公司，目录号10010-023)洗涤细胞，弃去PBS再加入含5％血清的F12 Ham培养基(“选择培养基”)。转染后72小时后，用含有400μg/ml抗细菌剂遗传霉素(Life Technologies公司，目录号11811)的选择培养基将细胞稀释10倍。
实施例2-激动剂分析为了筛选人HM74的激动剂，可将HM74以人工方式偶联Gq机制。Gq机制的激活可刺激Ca2+从细胞内部肌质网囊泡的释放。Ca2+被释放进细胞质后，可用Ca2+螯合染料检测。用萤光成像板读数器(FluorometricImaging Plate Reader)或FLIPR装置(Molecular Devices公司)监测所产生的任何荧光变化。激动剂的活性通过荧光强度的增加得到反映。
表达HM74的CHO-Kl细胞预先工程化为表达某种无差别形式的Gq蛋白(Gα16)。为了制备这种细胞，购买了Gα16-偶联的CHO细胞(MolecularDevices公司的LIVEWARETM细胞，目录号RD-HGA16)，并遵循实施例1的方案，使得在这些细胞中表达HM74。
将细胞置于含10％胎牛血清、100IU/ml青霉素(Gibco/BRL公司，目录号15140-148)、100μg/ml链霉素(目录号15140-148，Gibco/BRL公司)、400μg/ml遗传霉素(G418)(Gibco/BRL公司，目录号10131-035)和200μg/ml zeocin(Invitrogen公司，目录号R250-05)的F12 Ham培养基(Gibco/BRL公司，目录号11765-054)内，并于37℃和5％CO2的条件下维持在对数生长期。在进行分析前一天，使用96/384孔多点加样器(Multidrop device)(Labsystems公司，832型)将CHO-K1细胞按照12,500细胞/孔接种于每孔体积为50μl的384孔透明底分析板上(Greiner/Marsh公司，目录号N58102)。将细胞置于37℃含5％CO2的加湿培养箱中培养(Forma Scientific公司3110型水夹套CO2培养箱)。
制备以下储备液1M Hepes储备液(pH 7.5)(Gibco/BRL公司，目录号15630-080)；用1N NaOH配制的250mM羧苯磺胺储备液(Sigma公司，目录号P8761)；以及用DMSO(Sigma公司D2650)配制的1mM Fluo4-AM染料储备液(Molecular Probes公司，目录号Fl 4202)。反应缓冲液用1000ml的Hank′s平衡盐溶液(Fisher/Mediatech公司，目录号MT21023)、20ml的1M Hepes储备液以及10ml的250mM羧苯磺胺储备液配制。加样缓冲液的配制将1.6ml的1mM Fluo 4-AM染料储备液与0.32ml的普鲁兰尼克酸(pluronic acid)(Molecular Probes公司，目录号P6866)混合，然后与400ml上述反应缓冲液以及4ml胎牛血清混合。
在进行分析前1小时，用96/384孔多点加样器吸取新制备的加样缓冲液，按每孔50μl加入384孔板中。将细胞置于37℃加湿培养箱中培养以达到最大染料吸收。在即将开始分析的前，用384孔EMBLA细胞洗涤器(Skatron公司，型号12386)于每孔加90μl反应缓冲液洗涤细胞2次。洗涤时吸头至少高于板底10mm，每孔保留45μl缓冲液。
将FLIPRII仪器(Molecular Devices公司)上CCD摄像机(PrincetonInstruments公司)的光圈刻度(f-stop)调到2.0，曝光时间调到0.4秒。该摄像机是用于监测细胞板染料负荷的精确度。
在生理盐缓冲液中以每孔约为10μM的浓度条件下，检验可能含有呋塞米类化合物的化合物库。在加入化合物前10秒测量荧光的变化。加入化合物的后，第一分钟每秒测量一次荧光，然后，每6秒钟曝光一次，总的实验分析时间为3分钟。第10次扫描后，按5μl等份试样加入100μM化合物储备液，使细胞上最终的化合物浓度为10μM。记录最初80次扫描的最大荧光变化值，作为激动剂活性的测量，并与以10μM ATP(Sigma公司A9062)诱导的最大荧光变化值进行比较。
经发现，多种呋塞米类化合物均可激活HM74。
实施例3-拮抗剂分析为了筛选人HM74的拮抗剂，可将HM74以人工方式偶联到Gq机制。与实施例2一样，可用FLIPR仪器监测荧光的变化。拮抗剂的活性通过荧光强度的减小得到反映。
如同实施例2所述，表达HM74的CHO-Kl细胞预先工程化为可表达无差别形式的Gq蛋白(Gα16)。将细胞置于含10％胎牛血清、100lU/ml青霉素(Gibco/BRL公司，目录号15140-148)、100μg/ml链霉素(目录号15140-148，Gibco/BRL公司)、400μg/ml遗传霉素(G418)(Gibco/BRL公司，目录号10131-035)和200μg/ml zeocin(Invitrogen公司，目录号R250-05)的F12Ham培养基(Gibco/BRL公司，目录号11765-054)内，并于37℃和5％CO2的条件下维持在对数生长期。在进行分析前一天，使用96/384孔多点加样器将CHO-K1细胞按照12,500细胞/孔接种于每孔体积为50μl的384孔黑色透明底分析板上(Greiner/Marsh公司，目录号N58102)。将细胞置于37℃含5％CO2的加湿培养箱中培养。
制备以下储备液1M Hepes储备液(pH 7.5)(Gibco/BRL公司，目录号15630-080)；用1N NaOH配制的250mM羧苯磺胺储备液(Sigma公司，目录号P8761)；用DMSO(Sigma公司D2650)配制的1mM Fluo 4-AM染料储备液(Molecular Probes公司，目录号Fl4202)；以及配体或拮抗剂的储备液。反应缓冲液用1000ml的Hank′s平衡盐溶液(Fisher/Mediatech公司，目录号MT21023)、20ml的1M Hepes储备液以及10ml的250mM羧苯磺胺储备液以及1mM CaCl2配制。加样缓冲液的配制将80μl的1mM Fluo 4-AM染料储备液与16μl普鲁兰尼克酸(pluronicacid)(Molecular Probes公司，目录号P6866)混合，然后与20ml上述反应缓冲液以及0.2ml胎牛血清混合。
在进行分析前30分钟，用96/384孔多点加样器吸取新制备的加样缓冲液，按每孔30μl加入384孔板中。将细胞置于37℃加湿CO2培养箱中培养以达到最大染色吸收。在即将开始分析的前，用384孔EMBLA细胞洗涤器于每孔加100μl反应缓冲液洗涤细胞3次。洗涤时吸头至少高出板底40mm，每孔保留45μl缓冲液。
用Platemate 384移液器(Matrix公司)吸取5μl的100μM拮抗剂化合物储备液加入细胞中。在培养过程中，该化合物浓度约为10μM。将细胞置于FLIPRII中，第一分钟每秒测量一次培养板的荧光，然后，每6秒钟曝光一次，总的实验分析时间为3分钟。在第10次扫描的后，加入拮抗剂或配体(10μM)。每次加样后，384移液器加样头用20μl的0.01％DMSO水溶液洗涤10次。
在用候选拮抗剂检验，可以使M74细胞接触或不接触已鉴定的激动剂。
实施例4-受体结合分析为了制备包含HM74的细胞膜级分，在含有1mM EDTA的磷酸盐缓冲盐水(10ml)中培养后收集表达HM74的CHO细胞系。在重新悬浮于5ml缓冲液A(50mM Tris-HCl(pH 7.8)(Sigma公司T6791)、5mM MgCl2(Sigma公司M8266)以及1mM EGTA(Sigma公司0396))前，用含有1mMEDTA(10ml)的磷酸盐缓冲盐水再洗涤细胞3次。
然后，用组织匀浆器(Polytron公司，Kinemetica，PT 10/35型)将细胞打碎1分钟。将所产生的匀浆用Sorvall Instruments公司的RC3B冷冻离心机以49,000Xg于4℃离心20分钟。将所产生的沉淀物重新悬浮于25ml缓冲液A中，并重复离心步骤3次。最后一次离心后，将该沉淀物再次重新悬浮于5ml缓冲液A中，等分试样并储存于-70℃。
用细胞膜级分并以放射性标记的所研究的激动剂作为示踪剂进行受体结合分析。分析在96孔板(Beckman仪器公司)中进行。该结合反应物为18μg的CHO细胞制备物，在放射性激动剂(0.01nM-25nM)存在的条件下，最终体积为0.2ml的含有0.1％牛血清白蛋白(Sigma公司，目录号34287)的缓冲液A组成(参阅Im等人，J.Biol.Chem.(2000)275(19)14281-14286)。在室温下温育该反应物1小时。通过用多通道收集器(Brandell)上的Whatman GF/C过滤器进行过滤而终止反应，该多通道收集器预先用0.3％聚乙烯亚胺(Sigma公司，目录号P3143)和0.1％牛血清白蛋白(BSA)处理1小时。将混合物加入过滤器并培养1小时。过滤器用1ml pH值为7.6的冰冷50mM Tris-HCl溶液洗涤6次。基于对于每种示踪剂浓度，通过放射性测定的总结合与非特异性结合(背景)间的差异计算特异结合。取8至16个浓度数据点，以确定在激动剂与受体间的平衡状态下实现的激动剂与受体的结合(平衡结合参数)。在竞争性分析试验中，将试验性化合物加入该混合物，在与受体上放射性激动剂的结合竞争(竞争结合值)。绘制抑制曲线以确定实现结合的50％抑制所需的浓度(IC50)。
实施例5-小分子激动剂如上所述，使一系列呋塞米类分子接触表达HM74的细胞。对靶分子进行标记以确定是否发生与HM74的结合。通过测定细胞洗涤后的标记程度来检测这种结合。还通过二维凝胶电泳法分离HM74以及测定与该蛋白质相关的标记程度来确定这种结合。这种结合评估后，或独立于这种结合评估，确定了候选激动剂激活HM74的能力。FLIPR分析用于评价当靶分子与HM74结合时胞内的钙动员。如此鉴定了引起钙动员的分子。
现在已经描述了本发明，技术人员将会知道，可以对本文的教导做出多种改变和修改，而不背离本文教导的本发明的精神和范围。
本文中所引用的所有文献均以其整体引用作为参考。
权利要求
1.在需要治疗的患者体内调节HM74信号传导活性或信号转导的治疗方法，其包括对所述患者施用具有以下结构的分子 其中R是氢；或者是C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合，其中当X是N时X和Y可被稠合进一个或一个以上的环，其中所述环是可以是支链的和可含有侧基的C3-C18杂环，可以是支链的和可含有侧基的C3-C18杂芳基，可以是支链的和可含有侧基的被取代的C3-C18环烷基，或者可以是支链的和可含有侧基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
2.鉴定HM74激动剂的方法，其包括用表达HM74的细胞接触潜在的激动剂，并确定在所述潜在的激动剂存在的情况下，相对于所述潜在的激动剂不存在的情况，HM74的信号传递活性是否增加，其中上述潜在的激动剂具有以下结构 其中R是氢；或者是C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合，其中当X是N时X和Y可被稠合进一个或一个以上的环，其中所述环是可以是支链的和可含有侧基的C3-C18杂环，可以是支链的和可含有侧基的C3-C18杂芳基，可以是支链的和可含有侧基的被取代的C3-C18环烷基，或者可以是支链的和可含有侧基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
3.鉴定HM74逆激动剂的方法，其包括用表达HM74的细胞接触潜在的逆激动剂，并确定在所述潜在的逆激动剂存在的情况下，HM74的活性相对于所述潜在的逆激动剂不存在的情况下HM74的活性是否下降，以及在激动剂存在的情况下是否下降，其中所述潜在的逆激动剂具有以下结构 其中R是氢；或者是C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合，其中当X是N时X和Y可被稠合进一个或一个以上的环，其中所述环是可以是支链的和可含有侧基的C3-C18杂环，可以是支链的和可含有侧基的C3-C18杂芳基，可以是支链的和可含有侧基的被取代的C3-C18环烷基，或者可以是支链的和可含有侧基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
4.鉴定HM74拮抗剂的方法，其包括用表达HM74的细胞接触潜在的拮抗剂，并确定在所述潜在的拮抗剂存在的情况下，相对于激动剂存在的情况下HM74的活性，HM74的信号传递活性是否下降，其中所述潜在的拮抗剂具有以下结构 其中R是氢；或者是C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合，其中当X是N时X和Y可被稠合进一个或一个以上的环，其中所述环是可以是支链的和可含有侧基的C3-C18杂环，可以是支链的和可含有侧基的C3-C18杂芳基，可以是支链的和可含有侧基的被取代的C3-C18环烷基，或者可以是支链的和可含有侧基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
5.下式的化合物 其中R是氢；或者是C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合，其中当X是N时X和Y可被稠合进一个或一个以上的环，其中所述环是可以是支链的和可含有侧基的C3-C18杂环，可以是支链的和可含有侧基的C3-C18杂芳基，可以是支链的和可含有侧基的被取代的C3-C18环烷基，或者可以是支链的和可含有侧基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
6.调节炎症的方法，其包括将需要治疗的患者接触炎症调节量的药物组合物，该组合物包含下式的化合物 其中R是氢；或者是C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18链烯基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C1-C18炔基，其可以是支链的、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；C3-C18芳基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或C5-C18环烷基，其可含有侧基、可含有桥基、可含有杂原子或可以被取代或者是它们的组合情形；或它们的组合，其中当X是N时X和Y可被稠合进一个或一个以上的环，其中所述环是可以是支链的和可含有侧基的C3-C18杂环，可以是支链的和可含有侧基的C3-C18杂芳基，可以是支链的和可含有侧基的被取代的C3-C18环烷基，或者可以是支链的和可含有侧基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
全文摘要
对HM74受体有激动剂活性的呋塞米类分子，其具有以下结构式(I)；和它们治疗炎性疾病的用途。
文档编号C07D333/20GK1921845SQ200580005457
公开日2007年2月28日 申请日期2005年2月10日 优先权日2004年2月20日
发明者A·明尼希, T·孔茨韦勒, H·埃辛德雷罗, M·安格斯特罗, H-J·朗 申请人:安万特药物公司, 塞诺菲-安万特德国有限公司