专利名称：白菜育性相关基因BcMF6及其分离方法
技术领域：
本发明涉及白菜育性相关基因BCMF6及其分离方法，属于生物技术领域。
背景技术：
cDNA-AFLP方法可以用于分析同一基因表达上的差异，获得与重要农艺性状相关的标记探针。结合文库筛选、染色体步移、RACE技术等实验手段，能够得到与重要农艺性状相关的全长基因序列。本发明采用cDNA-AFLP技术对‘矮脚黄’白菜(Brassciacampestris L.ssp.chinensis Makino var.communis Tsen et Lee cv.Aijiaohuang)核不育两用系表达差异分析，发现可育株系与不育株系的表达差异主要存在于花药，配合RACE技术分离获得与花药发育相关基因BCMF6，但其确切的生物学功能还不清楚。在后基因组时代，基因组研究的重点已经从基因序列的获得转移到基因具体功能的分析，而反义遗传学已成为分析基因功能的重要手段。为了明确BCMF6在花粉育性决定过程中的作用，有必要采用反义遗传学的方法和手段对其功能进行分析，为阐明植物雄性不育发生的分子机制提供依据，进而为人工创建不育材料提供理论指导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白菜育性相关基因BCMF6及其分离方法。
本发明提供的白菜育性相关基因BCMF6，其特征在于具有SEQ ID No.1的序列；包含3个内含子和4个外显子，内含子的长度依次为81bp、95bp和127bp；最大ORF从第115位碱基开始，1308位碱基终止，1194个碱基编码398个氨基酸，该氨基酸具有SEQ ID No.5的序列。
本发明提供的白菜育性相关基因BCMF6的分离方法，其特征在于包括以下步骤1)可育株系特异BCMF-A4T17基因片段的获得设计两条AFLP引物A4和T17，用A4和T17引物对‘矮脚黄’白菜核雄性不育两用系的不育株系与可育株系的表达差异进行cDNA-AFLP分析，将能在可育株系的中蕾、大蕾和开放花中特异表达，而在不育株系中完全不表达的基因片段命名为BCMF-A4T17；2)将差异片段BCMF-A4T17进行回收、克隆和测序，得到大小为357bp，具有SEQID No.2序列的BCMF-A4T17基因片段；3)根据BCMF-A4T17基因片段的序列，设计两条特异引物SP1和SP2，将SP1和SP2分别与3’RACE锚定引物进行配合，以反转录的可育中蕾的双链cDNA为模板进行巢式PCR扩增，获得与BCMF-A4T17片段相关基因的cDNA的3’末端序列，该序列具有SEQ ID No.3的序列；4)根据BCMF-A4T17基因片段的序列，设计两条特异引物SP3和SP4，将SP3和SP4与5’RACE锚定引物通过嵌套式PCR进行扩增，获得与BCMF-A4T17片段相关基因的cDNA的5’末端序列，该序列具有SEQ ID No.4序列；5)将三次测序结果拼接，得到与BCMF-A4T17片段相关基因的全长序列，基因全长为1514bp，并将其命名为BCMF6基因，该基因具有SEQ ID No.1的序列。
本发明步骤1)中，所设计的引物A4GAC TGC GTA CCTAAT GG；T17GAT GAG TCCAGA CCG ACA。
本发明步骤3)中，所设计的特异引物SP15’-GTT GAG TCG TAC TTG GGAAGG C-3’；SP25’-TTG AGT ACA ACA ACC GTG GAC CAG G-3’。
本发明步骤4)中，所设计的特异引物SP35’-GAC TCC AAC ACT CCT TCC CAC-3’；SP45’-CGT CAA AGA TAC CAC CTC C-3’。
本发明的有益效果在于从白菜中获得了一个新的多聚半乳糖醛酸酶基因，表达分析表明其与花粉的育性决定存在密切的关系，其在花粉发育的晚期即花粉成熟和萌发过程中起作用。对其功能的转基因研究表明，其表达与花药的绒毡层存在密切的联系，且其表达模式可能是配子体表达模式。当其表达受到抑制时花粉数量减少，花粉发育异常，花粉萌发率降低，花粉畸形。这对理解多聚半乳糖醛酸酶基因在花粉发育和花粉育性决定过程中所起的作用有重要的参考价值，并为人工创造雄性不育系提供了理论依据。
图1是BCMF6在pBI35S-AMF6和pBIA9-AMF6菜心转基因KanR植株开放花表达情况的northern杂交检测；图2是BcMF6反义载体菜心转基因植株花器官与非转基因对照花器官的比较，其中A图和B图为BcMF6基因反义载体转基因植株花器官；C为非转基因菜心的花器官；D为反义载体转基因植株花器官和对照花器官的比较；图3是BcMF6菜心转基因植株的花粉萌发，其中A，pBI35S-AMF6(×160)；B，pBIA9-AMF6(×160)；C，35S-pBI121空载体(×160)；D，A9-pBI121空载体(×160)；图4是BcMF6反义载体菜心转基因植株花粉的环境电镜扫描观察，其中A，pBI35S-AMF6(×1000)；B，pBIA9-AMF6(×1000)；C，35S-pBI121空载体(×500)；D，A9-pBI121空载体(×500)。
具体实施例方式
1.白菜育性相关基因BCMF6的分离方法，包括以下步骤
1)可育株系特异BCMF-A4T17基因片段的获得设计两条AFLP引物A4和T17，用AFLP引物A4和T17组合对‘矮脚黄’白菜核雄性不育两用系的不育株系与可育株系的表达差异进行cDNA-AFLP分析，其中将能在可育株系的中蕾、大蕾和开放花中特异表达，而在不育株系中完全不表达的基因片段命名为BCMF-A4T17。其中A4GAC TGCGTA CCT AAT GG；T17GAT GAG TCC AGA CCG ACA；2)BCMF-A4T17基因片段的回收、克隆与测序用针尖将上述BCMF-A4T17特异条带挑一点作为模板进行PCR扩增，引物为A4和T17；PCR产物电泳检测表明，BCMF-A4T17基因片段片段长度为350 bp左右；克隆到pGEM-T Easy载体(购自Promega公司)，提取质粒，酶切验证并测序，结果得出该片段大小为357bp，具有SEQID No.2的序列，将该重组质粒命名为pBCMF-A4T17；3)与BCMF-A4T17片段相关的基因的cDNA的3’末端的获得根据BCMF-A4T17基因片段的序列，设计两条特异引物SP1和SP2，其中，SP1引物最后一个碱基与SP2引物的第一个碱基相差75个碱基，以3’RACE锚定引物分别与SP1和SP2组合，以反转录的可育中蕾的双链cDNA为模板进行巢式PCR扩增，电泳结果表明，第二轮产物分子量低于第一轮产物分子量，第二轮PCR产物的长度为1000bp左右，回收3’RACE第二轮PCR的电泳条带，克隆到pGEM-T Easy载体并测序，结果表明3’RACE扩增产物的序列长度为980bp，去掉3’RACE锚定引物20bp，实际扩增到960bp，其中含有25个T的寡聚核苷酸序。获得的BCMF-A4T17片段相关的基因的cDNA的3’末端具有SEQ ID No.3的序列。其中SP15’-GTT GAG TCG TAC TTG GGAAGG C-3’；SP25’-TTG AGT ACA ACA ACC GTG GACCAG G-3’；3’RACE锚定引物5’-GAG GCG GCC GAC ATG TTT TT-3’；4)与BCMF-A4T17片段相关基因的cDNA的5’末端的获得根据BCMF-A4T17基因片段的序列，设计5’RACE的特异引物SP3和SP4，其中SP3引物最后一个碱基与SP4第一个碱基相差99个碱基，与5’RACE锚定引物通过嵌套式PCR进行扩增，回收并测序，结果表明5’RACE扩增产物的序列长度为501bp，去掉5’RACE锚定引物和锚定序列共40bp，实际扩增到461bp。获得的BCMF-A4T17片段相关的基因的cDNA的5’末端具有SEQ ID No.4序列。其中SP35’-GAC TCC AAC ACT CCT TCC CAC-3’；SP45’-CGT CAA AGA TACCAC CTC C-3’；5’RACE锚定引物5’-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3’；5)与BCMF-A4T17片段相关的基因BCMF6的cDNA的全长序列的拼接将三次测序结果拼接，得到与BCMF-A4T17片段相关基因的全长序列，基因全长为1514bp，我们将其命名为BCMF6基因，该基因具有SEQ ID No.1的序列。
本发明分离得到的白菜育性相关基因BCMF6的特点1)BCMF6的ORF及其氨基酸序列的确定通过BLAST分析比较，BCMF6基因的cDNA全长序列与白菜多聚半乳糖醛酸酶基因(Brassica campestris polygalacturonase)mRNA同源性高达87％；利用序列综合分析软件DNAStar对BCMF6基因ORF进行分析，结果表明该基因最大ORF为1194bp，起始密码子ATG位于第115位，终止密码子为TAA，位于第1308位。ATG上游-3位核苷酸分别为A，+4位为核苷酸为G，这是一个典型的Kozak结构。利用DNA Star软件将ORF翻译成氨基酸，其编码398个氨基酸，该氨基酸具有SEQ IDNo.5的序列；2)BCMF6的DNA序列的确定根据BCMF6的cDNA的全长序列，在其最大ORF框外设计扩增DNA全长的上游引物SP5和下游引物SP6，以白菜可育株的基因组DNA为模板进行PCR扩增。电泳结果表明，其DNA扩增全长在1600bp左右，表明BcMF6的DNA序列中含有内含子。对所获DNA扩增序列进行回收、连接、转化，PCR和酶切验证、测序，结果表明BcMF6基因DNA序列全长为1576个碱基，减去两端酶切位点碱基6个和保护碱基3个，实际长度为1558bp。对BcMF6的DNA和cDNA全长序列比较分析表明，该基因序列包含3个内含子和4个外显子，内含子的长度依次为81bp、95bp和127bp。其外显子-内含子交接点处序列都遵守GT-AG规律，是典型的剪接体识别序列。该序列具有SEQ ID No.6。其中SP5GTAGGATCCATTGTAATCCCCAGTAAC；SP6GCATCTAGAGTGTATTGGTTATCGCA。
BCMF6基因的功能分析1)BCMF6基因的反义表达载体的构建选取BcMF6基因的cDNA的编码区长为477-bp的一段作为构建BcMF6基因反义表达载体的反义片段，根据pBI121表达载体的多克隆位点设计分别带有Sma 1引物SP7和带有BamH I酶切位点的引物SP8。用mmc突变体的野生型的cDNA做为模板，按下述PCR反应体系和条件进行BcMF6反义片段的PCR扩增。PCR反应体系cDNA模板0.5μL，10×PCR缓冲溶液5μL，25 m mol·L-1的Mg2+4μL，SP7引物(20m mol·L-1)1μL，SP8引物(20μmol·L-1)1μL，10m mol·L-1dNTPs 1μL，Taq酶(5U·μL-1)0.5μL，加水到总体积50μL。PCR程序94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。PCR产物用VITAGENE公司的DNA凝胶回收试剂盒回收、连接到pGEM-T easy载体、转化大肠杆菌、蓝白斑筛选阳性克隆、PCR和酶切鉴定正确后，送上海博亚生物公司测序。
将已链接到T-Easy载体的BcMF6反义链质粒和带有CaMV35S启动子、拟南芥A9启动子的pBI121空载体用BamH I和Sma I在37℃双酶切3～4h。1.0％的琼脂糖凝胶中电泳分离后，切下含目的片段的胶块，VITAGENE公司的DNA凝胶回收试剂盒回收。将酶切回收过的反义片段与经过同样酶酶切回收的pBI121大片段用T4连接酶定向连接，从而完成BcMF6基因带有CaMV35S启动子、拟南芥A9启动子的pBI121反义表达载体的构建，分别命名为pBI35S-AMF6和pBIA9-AMF6。
2)BCMF6基因的反义表达载体菜心转基因植株的功能分析将构建好的表达载体pBI35S-AMF6和pBIA9-AMF6冻融法转化农杆菌LBA4404，利用农杆菌介导的方法转化到白菜的近缘物种菜心中，得到菜心KanR植株。对菜心KanR植株进行分子检测和Southern杂交检测后，对其花粉的形态进行电镜扫描观察、花粉的体外萌发率进行检测及对BCMF6基因表达进行northern杂交检测，其结果如下i用BcMF6基因的cDNA序列为探针，对pBI35S-AMF6、pBIA9-AMF6菜心转基因KanR植株在开放花中的表达进行Northern杂交检测，结果表明pBI35S-AMF6、pBIA9-AMF6菜心转基因KanR植株开放花的BcMF6表达都低于对照(见图1)，这表明BcMF6的反义表达载体已抑制了其表达。
ii对BcMF6反义载体pBI35S-AMF6、pBIA9-AMF6的菜心转基因KanR植株花器官与非转基因菜心花器官的比较可以看出，转基因菜心的花器官花丝比对照小一点，而且花药不饱满，花粉数量少(见图2)，这也表明了菜心转基因植株的花粉受到BcMF6的反义表达载体的抑制导致其花粉数量下降。
iii对BcMF6反义载体的菜心转基因KanR植株的花粉萌发试验表明，pBI35S-AMF6和pBIA9-AMF6的花粉萌发率明显低于对照，对其花粉萌发率的统计结果表明，pBI35S-AMF6和pBIA9-AMF6的花粉萌发率相近分别是48.67％和36.88％，都显著低于相应空载体转基因对照的萌发率(见图3。这表明BcMF6反义载体pBI35S-AMF6和pBIA9-AMF6抑制了其菜心转基因植株的花粉的萌发，使萌发率显著降低。
iv对BcMF6反义载体pBI35S-AMF6、pBIA9-AMF6的菜心转基因KanR植株的花粉电镜扫描结果表明，pBI35S-AMF6菜心转基因植株既有形态正常的花粉，也含有发育不正常的花粉，其表现为花粉皱缩，发育不饱满，明显小于正常的花粉，统计分析表明其畸形率为54.18％，与其花粉萌发率相近；对pBIA9-AMF6花粉电镜扫描结果表明，pBIA9-AMF6菜心转基因植株有相当部分的花粉表现为萌发沟提前愈合，花粉壁塌陷，统计分析表明花粉畸形率为52.36％，高于其花粉萌发率(见图4)。
综上所述，对BcMF6反义载体pBI35S-AMF6、pBIA9-AMF6的菜心转基因KanR植株的Northern杂交检测、花器官观察、花粉萌发率和花粉形态电镜扫描结果都表明了BcMF6为一可能在花粉的成熟和萌发过程中起作用的基因。同时也表明了BcMF6基因的表达与花药的绒毡层存在密切的联系，其表达可能是配子体表达模式，因为只有大约一半的花粉会受到反义RNA的抑制。
上述实施用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
序列信息<110>浙江大学<120>白菜育性相关基因BcMF6及其分离方法<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1514<212>DNA<213>Brassica sp.
<400>1ataaataaga aaaatatttt ttttcaaata ctaataataa taaaactagt ggattacaaa 60atatataaac aaaaataata attgtaatcc ccagtaacta aaaaaaatca tataatgggt 120gtacattttg gaatatccgt attatttgtt gtttgtttgc taggtttatc agcaaatgct 180aaagatttca caatcactgc tcctccaggt tctgatatcg ccagcttatt gttgaaagca 240ttcaatgagg catgccagtt cccgaccagg agtagcgtat tgatccctaa aggtgaatac 300aagcttcggc aaatagagat gatgggtcca tgcaaagctc ccataaggat tactcttcaa 360ggcactgtga aagctgacgg aaacgttaac gggaatgact actgggtcgc tttccgcagg 420attaatgggt ttaagttgaa cggaggtggt atctttgacg gtgaaggtaa cgctgcatgg 480agggctaata attgccacaa aatggcatta actcagtgca agaaactccc tatcagcata 540cggtttgatt tcgtgactga cgctaagata agaggcataa cctcgttgga ttcaaagaac 600ttccacatta acgcgctcgg agcaaggaac ctgacattgg aagaaatcac gatcattgcc 660cctgaagaga gacccaacac cgatggaatc cacgtgggaa ggagtgctgg agtccagatc 720atcaactcaa acatcaaaac aggagatgac tgcatctcta ttggagacgg gacgagagac 780cttcttgtcg aaagagttac atgcggtccg ggacatggaa tcagtattgg aagcctcgga 840ttatacgtga aggaggaaga cgtcactggc atcagggtcg taaactccac cctcataaac 900actgacaatg gtgtaaggat caagacatgg ccgtctgcag cttgctccac caccgcctcg 960ggtatccatt ttgagaatat tatcctcaag aacgttacca accctatcct catcgaccaa 1020gagtactgcc cctggaaccg atgcaacaag aacaaaccat caacaatcaa gctggtggac 1080
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1.白菜育性相关基因BCMF6，其特征在于具有SEQ ID No.1的序列；包含3个内含子和4个外显子，内含子的长度依次为81bp、95bp和127bp；最大ORF从第115位碱基开始，1308位碱基终止，1194个碱基编码398个氨基酸，该氨基酸具有SEQ ID No.5的序列。
2.权利要求1所述的白菜育性相关基因BCMF6的分离方法，其特征在于包括以下步骤1)可育株系特异BCMF-A4T17基因片段的获得设计两条AFLP引物A4和T17，用A4和T17引物对‘矮脚黄’白菜核雄性不育两用系的不育株系与可育株系的表达差异进行cDNA-AFLP分析，将能在可育株系的中蕾、大蕾和开放花中特异表达，而在不育株系中完全不表达的基因片段命名为BCMF-A4T17；2)将差异片段BCMF-A4T17进行回收、克隆和测序，得到大小为357 bp，具有SEQID No.2序列的BCMF-A4T17基因片段；3)根据BCMF-A4T17基因片段的序列，设计两条特异引物SP1和SP2，将SP1和SP2分别与3’RACE锚定引物进行配合，以反转录的可育中蕾的双链cDNA为模板进行巢式PCR扩增，获得与BCMF-A4T17片段相关基因的cDNA的3’末端序列，该序列具有SEQ ID No.3的序列；4)根据BCMF-A4T17基因片段的序列，设计两条特异引物SP3和SP4，将SP3和SP4与5’RACE锚定引物通过嵌套式PCR进行扩增，获得与BCMF-A4T17片段相关基因的cDNA的5’末端序列，该序列具有SEQ ID No.4序列；5)将三次测序结果拼接，得到与BCMF-A4T17片段相关基因的全长序列，基因全长为1514bp，并将其命名为BCMF6基因，该基因具有SEQ ID No.1的序列。
3.按权利要求2所述的分离白菜育性相关基因BCMF6的方法，其特征在于步骤1)所设计的引物A4GAC TGC GTA CCT AAT GG；T17GAT GAG TCC AGA CCG ACA。
4.按权利要求2所述的分离白菜育性相关基因BCMF6的方法，其特征在于步骤3)所设计的特异引物SP15’-GTT GAG TCG TAC TTG GGAAGG C-3’；SP25’-TTG AGT ACAACAACC GTG GAC CAG G-3’。
5.按权利要求2所述的分离白菜育性相关基因BCMF6的方法，其特征在于步骤4)所设计的特异引物SP35’-GAC TCC AAC ACT CCT TCC CAC-3’；SP45’-CGT CAAAGA TACCAC CTC C-3’。
全文摘要
本发明涉及白菜育性相关基因BCMF6及其分离方法，以‘矮脚黄’白菜隐性雄性不育两用系为材料，采用cDNA－AFLP方法对白菜可育株系和不育株系的时空表达特征进行分析，分离与育性基因相关的差异表达基因BcMF6；通过RACE技术获得其cDNA全长序列，进而获得其DNA全长序列，并对全长序列进行生物信息学分析；构建了其反义RNA表达载体，用农杆菌介导的方法转化到白菜的近缘物种菜心，对BcMF6基因的功能进行了验证，结果表明BcMF6为一个在花粉的成熟和萌发过程中起作用的多聚半乳糖醛酸酶基因，其表达与花药的绒毡层存在密切的联系，且其表达模式可能是配子体表达模式，参与花粉育性的决定，当其表达受到抑制后，引起花粉畸形、败育。
文档编号C07K14/415GK1995349SQ200610155398
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月22日 优先权日2006年12月22日
发明者张强, 曹家树, 黄鹂, 余小林 申请人:浙江大学