用于治疗呼吸道疾病的可结合肺组织内靶标的结合剂的制作方法

专利名称：用于治疗呼吸道疾病的可结合肺组织内靶标的结合剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及可结合肺组织内靶标的域抗体(domain antibody，dAb)在制备用于局部给予肺组织的一日量制剂中的用途，其中肺部结合剂水平的至少50％维持至少约4小时。
本发明涉及可结合肺组织内靶标的域抗体(dAb)在制备用于治疗或预防呼吸道疾病的制剂中的用途，其中制剂用于局部给予肺组织，而基本上不进入体循环。在一个实施方案中，使用至多约10mg可结合肺组织内靶标的dAb。优选肺组织内靶标介导肺部炎症或肺病。
本发明涉及吸入器或鼻内递药装置，用于将定量域抗体(dAb)制剂给予患者，用于治疗或预防呼吸道疾病，其中吸入器或鼻内递药装置包括dAb制剂，并且提供含有至多10mg dAb的定量日用量。本发明也涉及域抗体(dAb)制剂在制造吸入器或鼻内递药装置中的用途，从而提供长效吸入dAb制剂供肺部局部递送用。
本发明也涉及将可结合肺组织内靶标的结合剂给予患者以在其肺组织中产生长治疗窗的方法，所述方法包括将有效量的所述结合剂局部给予所述患者的肺组织。
本发明也涉及将可结合肺组织内靶标的结合剂给予患者以在其肺组织中产生长治疗窗的方法，所述方法包括选择体内血清半衰期为约1秒钟至约12小时并能结合肺组织内靶标的结合剂，并将有效量的所述结合剂局部给予所述患者的肺组织。
适用于本发明的结合剂可结合选自以下的肺组织内靶标TNFR1、IL-1、IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、IL-12、IL-12R、IL-13、IL-13Rα1、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、类糜蛋白酶、FGF、弗林蛋白酶、内皮素-1、嗜酸性粒细胞趋化因子类(例如嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、整联蛋白、L-选择蛋白、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、骨桥蛋白、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、涎免凝集素8(siglec8)、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、TNFR1、TRANCE、类胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、αvβ6、αvβ8、cMET和CD8。
在一个实施方案中，用于本发明的结合剂可结合选自TNF信号级联蛋白的靶标。优选该蛋白靶标选自TNFα、TNFβ、TNFR2、TRADD、FADD、胱冬蛋白酶-8、TNF受体相关因子(TRAF)、TRAF2、受体相互作用蛋白(RIP)、Hsp90、Cdc37、IKKα、IKKβ、NEMO、kB的抑制剂(IkB)、NF-kB、NF-kB必需调节物、细胞凋亡信号调节激酶-1(aSMase)、中性鞘磷脂酶(nSMase)、ASK1、组织蛋白酶-B、生发中心激酶(GSK)、GSK-3、因子相关死亡域蛋白(FADD)、中性鞘磷脂酶活化相关因子(FAN)、FLIP、JunD、NF-kB激酶抑制剂(IKK)、MKK3、MKK4、MKK7、IKKγ、促分裂原活化蛋白激酶/Erk激酶激酶(MEKK)、MEKK1、MEKK3、NIK、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、PKC-ζ、RelA、T2K、TRAF1、TRAF5、死亡效应域(DED)、死亡域(DD)、死亡诱导信号转导复合物(DISC)、细胞凋亡蛋白抑制剂(IAP)、c-Jun N-erminal激酶(JNK)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷酸肌醇-3OH激酶(PI3K)、蛋白激酶A(PKA)、PKB、PKC、PLAD、PTEN、rel同源域(RHD)、RING(really interesting new gene)、应激激活蛋白激酶(SAPK)、TNFα转化酶(TACE)、死亡域蛋白沉默因子(SODD)和TRAF相关NF-kB活化剂(TANK)。对于这些优选靶标，可参见WO04046189、WO04046186和WO04046185(通过引用结合到本文中)，这些文献提供选择抗体单可变区用于靶向胞内靶标的指南。
本发明涉及TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb单体)在制备用于治疗、抑制或预防肺部炎症和/或呼吸道疾病的药物中的用途。
本发明也涉及治疗、抑制或预防肺部炎症和/或呼吸道疾病的方法，所述方法包括选择肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)拮抗剂，所述拮抗剂当以不超过约10mg/kg/天的用量给予时，在合适呼吸道疾病的动物模型中具有功效，其中相对于未治疗对照而言，当通过支气管肺泡灌洗液中的总细胞计数评定，肺部细胞浸润受到抑制，其p≤0.05时，则对所述动物模型具有功效；以及将有效量的所述TNFR1拮抗剂给予有需要的患者(例如局部给予所述患者的肺组织)。
可用本发明的药物、制剂和方法治疗、抑制或预防的呼吸道疾病包括肺部炎症、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、过敏性肺炎、伴有嗜酸粒细胞增多的肺部浸润、环境性肺病、肺炎、支气管扩张、囊性纤维化、间质性肺病、原发性肺动脉高压、肺血栓栓塞症、胸膜病、纵隔病、横隔膜病、通气不足、通气过度、睡眠呼吸暂停、急性呼吸窘迫综合征、间皮瘤、肉瘤、移植物排斥、移植物抗宿主病、肺癌、变应性鼻炎、变态反应、石棉肺、曲霉肿、曲霉病、支气管扩张、慢性支气管炎、肺气肿、嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化、侵袭型肺炎球菌病、流感、非结核性分枝杆菌、胸腔积液、尘肺、肺囊虫病(pneumocytosis)、肺炎、肺放线菌病、肺泡蛋白沉积症、肺炭疽、肺水肿、肺栓子、肺部炎症、肺组织细胞增多症X、肺动脉高压、肺诺卡菌病、肺结核、肺静脉闭塞性疾病、类风湿性肺病、结节病、韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)和非小细胞肺癌。
本发明也涉及本文所述的配体和dAb。
本发明也涉及包含具有TNFR1结合特异性结合位点的蛋白质部分的配体，其中所述蛋白质部分包含的氨基酸序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR3的氨基酸序列相同。
在某些实施方案中，配体包含具有TNFR1结合特异性结合位点的蛋白质部分，其中所述蛋白质部分的氨基酸序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR3的氨基酸序列相同，并且还包含与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR1和/或CDR2的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
在其它实施方案中，配体包含可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区，其中可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区与本文所公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR1序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR1序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区，其中可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR2序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR2序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区，其中可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR3序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR3序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区，其中可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR1序列和CDR2序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR1序列或CDR2序列分别具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区，其中可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR2序列和CDR3序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR2序列或CDR3序列分别具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区，其中可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR1序列和CDR3序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR1序列或CDR3序列分别具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区，其中可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR1序列、CDR2序列或CDR3序列分别具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是包含可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的CDR1序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR1序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是包含可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的CDR2序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR2序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是包含可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的CDR3序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR3序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是包含可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的CDR1序列和CDR2序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR1序列和CDR2序列分别具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是包含可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的CDR2序列和CDR3序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR2序列和CDR3序列分别具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是包含可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的CDR1序列和CDR3序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR1序列和CDR3序列分别具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是包含可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中可结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列分别具有至少50％同一性。
本发明也涉及编码任何本发明配体的分离核酸或重组核酸。在其它实施方案中，本发明涉及包含本发明重组核酸的载体。
本发明也涉及包含本发明重组核酸或本发明载体的宿主细胞。
本发明也涉及用于制备配体的方法，所述方法包括将本发明的宿主细胞在适合本发明核酸或载体表达的条件下进行培养，由此产生配体。在其它实施方案中，用于制备配体的方法还包括分离出配体。
附图简述

图1是一幅图，表明与其它治疗药相比，当局部给予C57BL/6小鼠吸烟所致(TS)慢性阻塞性肺病(COPD)亚慢性模型的肺组织时，TNFR1拮抗剂具有优越功效。该图显示在实施例1所述的研究完成时小鼠支气管肺泡灌洗液(BAL)中存在的细胞数。显示出研究中每只小鼠的各数据点和组平均值(平均值；水平线)。结果表明，与未治疗组相比，经鼻内给药而局部给予肺部的抗TNFR1 dAb单体(Dom1)使BAL中的细胞数下降72％。结果也表明，将靶向TNF的治疗药(ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(Immunex Corporation)))局部给予肺部，对BAL中的细胞数没有统计学上的显著影响。结果还表明，经鼻内给药而局部给予肺部的抗TNFR1 dAb单体(Dom1)能更有效降低BAL中的细胞数，相对于以10mg/kg口服(每日2次)的高剂量给予磷酸二酯酶4抑制剂(PDE4I，BAY 19-8004)。TS，吸烟所致；Veh，溶媒；ns，没有统计学意义。
图2是一幅图，表明与靶向TNF的治疗药相比，当系统给予C57BL/6小鼠吸烟所致(TS)慢性阻塞性肺病(COPD)亚慢性模型的肺组织时，TNFR1拮抗剂具有优越功效。该图显示在实施例2所述的研究完成时小鼠BAL中存在的细胞数。显示出研究中每只小鼠的各数据点和组平均值(水平线)。结果表明，与未治疗组相比，经腹膜内给药而系统给予的PEG化抗TNFR1 dAb单体(TNFR1)使BAL中的细胞数下降60％。结果也表明，系统给予靶向TNF的治疗药(ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(Immunex Corporation)))，导致BAL中的细胞数增加12％，尽管这样的增加没有统计学意义。TS，吸烟所致；Veh，溶媒；ns，没有统计学意义；i.p.，腹膜内。
图3是柱状图，其中将图1和图2所示的某些组的数据与甾体药物(地塞米松)经口服给予模型的研究结果一起重新作图。该图表明，在模型中，经鼻内给药而局部给予肺部抗TNFR1 dAb单体(DOM/ADS101-天然(图1的Dom1))(1mg/kg，每天用药一次)，经腹膜内给药而系统给予PEG化抗TNFR1 dAb单体(DOM/ADS101-PEG化(图2的TNFR1))(10mg/kg，每两天用药一次)，比起高剂量(10mg/kg口服，每天用药两次)给予磷酸二酯酶4抑制剂(PDE4I)更有效。该图也表明，口服给予甾体药物(0.3mg/kg，口服，每天两次)增加了BAL中的细胞数，因此在模型中无效。
图4A和图4B是柱状图，表明图1和图2所示的某些研究组的BAL中巨噬细胞(4A)或嗜中性粒细胞(4B)的分类细胞计数。图4A显示经鼻内给药而局部给予肺部抗TNFR1 dAb单体(DOM/ADS101-天然(图1的Dom1))(1mg/kg，每天用药一次)，经腹膜内给药而系统给予PEG化抗TNFR1 dAb单体(DOM/ADS101-PEG化(图2的TNFR1))(10mg/kg，每两天用药一次)，比起高剂量(10mg/kg口服，每天两次)给予磷酸二酯酶4抑制剂(PDE4I)来说，更能有效降低BAL中的巨噬细胞数量。同样，图4B显示经鼻内给药而局部给予肺部抗TNFR1 dAb单体(DOM/ADS101-天然(图1的Dom1))(1mg/kg，每天用药一次)，经腹膜内给药而系统给予PEG化抗TNFR1 dAb单体(DOM/ADS101-PEG化(图2的TNFR1))(10mg/kg，每两天用药一次)，比起高剂量(10mg/kg口服，每天两次)给予磷酸二酯酶4抑制剂(PDE4I)来说，更能有效降低BAL中的嗜中性粒细胞数量。
图5是曲线图，表明TNFR1结合剂(DOM1m(TAR2m21-23))经鼻内给药而局部给予肺组织(参见实施例3)后的药代动力学研究结果。该图表明肺组织中DOM1m水平在给药后保持相对恒定达至少8小时，而BAL中的水平则逐渐下降，且血清中的水平快速下降，在5小时后已检测不到。给药后1小时检测到BAL和血清中DOM1m的最大水平。(BAL中约14μg/ml，血清中约150ng/ml)。BAL中的水平在延长的时间内维持高水平，在24小时内逐渐下降(24小时后下降＞10倍)。血清中的水平快速下降，在5小时后血清中已检测不到DOM1m。肺组织中DOM1的水平在给药后保持相对恒定达至少8小时，在给药后24小时检测不到。
图6A-6V显示对人TNFR1具有结合特异性的一些人免疫球蛋白可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO1-198)。所示的氨基酸序列是连续的，没有空位；序列中插入了符号～，表示互补决定区(CDR)的位置。CDR1的两侧是～，CDR2的两侧是～～，CDR3的两侧是～～～。
图7A-7B显示对小鼠TNFR1具有结合特异性的一些人免疫球蛋白可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO199-211)。所示的氨基酸序列是连续的，没有空位；序列中插入了符号～，表示互补决定区(CDR)的位置。CDR1的两侧是～，CDR2的两侧是～～，CDR3的两侧是～～～。
图8A显示编码人(Homo sapiens)TNFR1胞外结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO212)。
图8B显示人(Homo sapiens)TNFR1胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO213)。
图9A显示编码小鼠(Mus musculus)TNFR1胞外结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO214)。
图9B显示小鼠(Mus musculus)TNFR1胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO215)。
图10A-10Q显示对小鼠TNFR1具有结合特异性的一些人免疫球蛋白可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO216-221)，以及对人TNFR1具有结合特异性的一些人免疫球蛋白可变区的氨基酸序列(SEQ IDNO222-433)。所示的氨基酸序列是连续的，没有空位；序列中插入了符号～，表示互补决定区(CDR)的位置。CDR1的两侧是～，CDR2的两侧是～～，CDR3的两侧是～～～。
图11A和图11B是曲线图，显示在(i.n.)给予溶媒或抗-TNFR1 dAb(1mg/kg)后1小时经鼻内(i.n.)给予鼠TNFα(1mg/小鼠)，支气管肺泡灌洗液(BAL)(图11A)或肺组织(图11B)中TNFα浓度随时间的增加。
图12是曲线图，显示在(i.n.)预先给予溶媒或抗-TNFR1 dAb(1mg/kg)后1小时经鼻内(i.n.)给予鼠TNFα(1μg/小鼠)，BAL嗜中性粒细胞随时间的增加。预先给予抗TNFR1 dAb部分地抑制了由TNFα诱导的嗜中性粒细胞的增加。
图13A-13D是曲线图，显示鼠TNFα对BAL KC水平(13A)、BALMIP-2水平(13B)、BAL MCP-1水平(13C)或肺组织E-选择蛋白水平(13D)的影响随时间的变化。给予抗TNFR1 dAb明显抑制了由TNFα诱导的增加。
图14A-14Z和图14A2-14J2显示编码对人TNFR1具有结合特异性的人免疫球蛋白可变区的一些核酸的核苷酸序列(SEQ IDNO434-644)，和编码对小鼠TNFR1具有结合特异性的人免疫球蛋白可变区的一些核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO645-650)。所示的序列是连续的，没有空位；序列中插入了符号～，表示互补决定区(CDR)的编码位置。CDR1的两侧是～，CDR2的两侧是～～，CDR3的两侧是～～～。
发明详述 本文所用的术语“拮抗剂”是指能结合靶标(例如受体蛋白)并能抑制靶标的一种或多种功能的结合剂(药物)(例如分子、化合物)。例如，受体蛋白拮抗剂可结合受体蛋白并抑制天然配体或关联配体与受体蛋白的结合和/或抑制通过受体蛋白介导的信号转导。例如，肿瘤坏死因子受体1“TNFR1”拮抗剂可结合TNFR1并抑制TNFα与TNFR1的结合和/或抑制通过TNFR1介导的信号转导。可以通过例如筛选文库或分子集合(例如Chemical Repository of the National Cancer Institute)或采用其它合适方法，鉴定拮抗剂。优选的拮抗剂是本文所述的“配体”。
本文所用的术语“肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)拮抗剂”是指能结合TNFR1并能抑制TNFR1的一种或多种功能的结合剂(药物)(例如分子、化合物)。例如，TNFR1拮抗剂可抑制TNFα与TNFR1的结合和/或抑制通过TNFR1介导的信号转导。因此，TNFR1介导的过程和细胞应答(例如在标准L929细胞毒性测定中TNFα诱导的细胞死亡)可以被TNFR1拮抗剂所抑制。TNFR1拮抗剂可以是例如有机小分子、天然产物、蛋白质、肽或肽模拟物。可以通过筛选本文所述的文库或分子集合(例如Chemical Repository of the National Cancer Institute)或采用其它合适方法，鉴定TNFR1拮抗剂。优选的TNFR1拮抗剂是本文所述的抗体、抗体的抗原结合片段、配体和dAb单体。
本文所用的术语“配体”是指包含对所需靶标具有结合特异性的结构域的多肽。优选结合域是对所需目标抗原(例如受体蛋白)具有结合特异性的免疫球蛋白单可变区(例如VH、VL、VHH)。结合域也可包含对所需目标抗原具有结合特异性的免疫球蛋白单可变区的一个或多个合适形式的互补决定区(CDR)，致使结合域对目标抗原具有结合特异性。例如，可将CDR移植到合适蛋白质支架或骨架上，例如亲和体(affibody)、SpA支架、LDL受体A类区或EGF区。此外，配体可以是本文所述的单价(例如dAb单体)、双价(同型双价、异型双价)或多价(同型多价、异型多价)。因此，“配体”包括本文所述的由dAb组成的多肽，包括基本上由这样的dAb组成的多肽，包括合适形式的dAb(或dAb的CDR)(例如抗体形式(例如IgG样形式、scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2))或合适蛋白质支架或骨架(例如亲和体、SpA支架、LDL受体A类区或EGF区)的多肽，包含可结合第一目标蛋白、抗原或表位(例如TNFR1)的dAb和可结合另一目标蛋白、抗原或表位(例如血清白蛋白)的第二dAb的双特异性配体以及多特异性配体。结合域也可以是包含所需目标的结合位点的蛋白结构域，例如选自以下的蛋白结构域亲和体、SpA区、LDL受体A类区、EGF区、高亲和性多聚体(avimer)(参见例如美国专利申请公布号2005/0053973、2005/0089932、2005/0164301)。
术语“免疫球蛋白单可变区”，是指能独立于其它V区(V region，V domain)而特异性结合抗原或表位的抗体可变区(VH、VHH、VL)；然而，本文所用的术语免疫球蛋白单可变区可以与其它可变区(variableregion，variable domain)呈现例如同型多聚体或异型多聚体的形式，其中其它区(region，domain)不是免疫球蛋白单可变区的抗原结合所必需的(即其中免疫球蛋白单可变区与抗原的结合独立于另外的可变区)。“免疫球蛋白单可变区”不仅包括分离的抗体单可变区多肽，而且包括含有抗体单可变区多肽序列的一个或多个单体的较大多肽。本文所用的术语“域抗体”或“dAb”与本文所用的术语“免疫球蛋白单可变区”多肽同义。本文所用的免疫球蛋白单可变区多肽是指哺乳动物(优选人，但也包括啮齿动物)免疫球蛋白单可变区多肽(例如公开于WO 00/29004，所述文献的内容通过引用全部结合到本文中)或骆驼科动物(camelid，包括骆驼、骆马及相关种系)VHH dAb。骆驼科动物dAb是免疫球蛋白单可变区多肽，它来自骆驼(camel)、美洲驼(llama)、羊驼(alpaca)、单峰骆驼(dromedary)和栗色骆马(guanaco)等物种，并且包含天然缺乏轻链的重链抗体VHH。VHH分子要比IgG分子小约10倍，作为单一多肽，它们非常稳定，能耐受极端pH和温度条件。
本文所用的术语“剂量”是指一次性全部给予(单位剂量)、或者在限定的时间间隔内分两次或更多次给予患者的药物(结合剂)(例如TNFR1拮抗剂)的量。例如，剂量可以指在1天(24小时)(日用量)、2天、1周、2周、3周或1个月或数月的疗程中给予(例如通过单次给予，或通过两次或更多次给予)患者的药物(结合剂)(例如TNFR1拮抗剂)的量。给药之间的间隔可以是任何所需时间。
本文所用的术语“治疗窗(therapeutic window)”是指药物(例如拮抗剂、配体、dAb单体)在血浆或者局部给予药物的组织或器官(例如肺组织、肺)中产生高治疗功效概率的浓度范围。
“互补”，当两个免疫球蛋白结构域属于能构成关联对或关联组的结构家族时，或者它们来源于这样的家族并保留该特征时，则它们是“互补”的。例如，抗体的VH区和VL区就是互补的；两个VH区则不互补，两个VL区也不互补。在免疫球蛋白超家族其它成员中也可发现互补区，例如T细胞受体的Vα和Vβ(或γ和δ)区。人工结构域，例如基于蛋白质支架的结构域(它们不结合表位，除非经改造才可结合表位)，是非互补的。同样，基于(例如)免疫球蛋白结构域和纤连蛋白结构域的两个结构域也不互补。
“免疫球蛋白”，是指这样的多肽家族其保留抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，含有两个β折叠，一般还含有一个保守二硫键。免疫球蛋白超家族成员在体内参与细胞和非细胞相互作用的许多方面，包括在免疫系统(例如抗体、T细胞受体分子等)中具有广泛作用，参与细胞粘附(例如ICAM分子)和胞内信号转导(例如受体分子，例如PDGF受体)。本发明可用于具有结合域的所有免疫球蛋白超家族分子。优选本发明涉及抗体。
“domain(域，结构域，区)”，是经过折叠的蛋白质结构，它保留了蛋白质三级结构，但独立于蛋白质的其余部分。通常，各结构域负责蛋白质的分离的功能性，并且在许多情况下可以添加、去除或转移给其它蛋白质，而不丧失该蛋白质和/或该结构域的其余部分的功能。单抗体可变区(single antibody variable domain)是指经过折叠的多肽区，包含特征为抗体可变区的序列。因此，它包含完整抗体可变区和修饰可变区(例如其中一个或多个环已经被不具有抗体可变区特征的序列所置换)，或者已被截短或包含N-端或C-端延伸的抗体可变区，以及保留全长结构域的至少部分结合活性和特异性的可变区的折叠片段。
“库(repertoire)”，一级序列不同的多样化变异体(例如多肽变异体)的集合。本发明所用的文库可包括含有至少1000个成员的多肽库。
“文库(library)”，术语文库是指异源多肽或核酸的混合物。文库由成员组成，每个成员都具有一个多肽或核酸序列。就这一方面而言，文库(library)和库(repertoire)同义。文库成员间的序列差异造成文库的多样性。文库可以呈多肽或核酸的简单混合物的形式，或者可以呈用核酸文库转化的生物体或细胞的形式，例如细菌、病毒、动植物细胞等。优选各个生物体或细胞仅含有一个文库成员或数目有限的文库成员。最好将核酸掺入到表达载体中，以表达该核酸所编码的多肽。因此，在一个优选的方面，文库可以呈宿主生物体群体的形式，每个生物体含有一个或多个拷贝的表达载体，所述载体含有呈核酸形式的文库的一个成员，所述核酸可以表达而产生其相应多肽成员。因此，宿主生物体群体具有编码很大的具有遗传多样性的多肽变异体库的潜力。
“抗体”，抗体(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)或其片段(例如Fab、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗体、二硫键连接的scFv、双链抗体)，无论是来自任何物种的天然产生的抗体，还是由重组DNA技术产生的抗体；无论是从下列哪种样品中分离的血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌。
“双特异性配体”，是指包含本文所定义的第一免疫球蛋白单可变区和第二免疫球蛋白单可变区的配体，其中可变区能结合两个不同抗原或同一抗原上的两个表位，而它们通常并不与单特异性免疫球蛋白结合。例如，两个表位可以在同一半抗原上，而不是同一表位或足够近从而结合单特异性配体。本发明的双特异性配体由具有不同特异性的可变区组成，但不包括具有相同特异性的相互互补的可变区对。双特异性配体和制备双特异性配体的合适方法公开于WO2004/058821、WO 2004/003019和WO 03/002609，这些已公布的国际申请的全部内容各自通过引用结合到本文中。
“抗原”，一种能与本发明的配体结合的分子。通常，抗原与抗体配体结合并能在体内产生抗体反应。抗原可以是多肽、蛋白质、核酸或其它分子。一般而言，针对特定抗原的靶特异性而选择本发明双特异性配体。就常规抗体及其片段而言，由可变环(L1、L2、L3和H1、H2、H3)所限定的抗体结合位点能够结合抗原。
“表位”，与免疫球蛋白VH/VL对常规结合的结构单元。表位限定针对抗体的最小结合部位，因此代表了抗体特异性的靶。就单域抗体而言，表位代表了与分离的可变区结合的结构单元。
“通用构架(universal framework)”，单抗体构架序列，对应于序列中的保守抗体区，根据Kabat(″Sequences of Proteins ofImmunological Interest″，US Department of Health and Human Services(美国健康和人类服务部))所定义；或者对应于人种系免疫球蛋白库或结构，根据Chothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196910-917所定义。本发明提供单构架或一组这样的构架的用途，已经发现它们允许事实上任何结合特异性的衍生，尽管变异仅在超变区内。
“半衰期”，是指配体的血清浓度在体内降低50％所需要的时间，例如因为通过天然机制所致的配体降解和/或清除或螯合。本发明的配体在体内是稳定的，其半衰期因结合抗降解和/或清除或螯合的分子而延长。通常，这类分子是天然存在的蛋白质，它们本身在体内具有较长的半衰期。如果一种配体的功能活性在体内的持续时间比对延长半衰期的分子不具有特异性的另一种类似配体更长的话，则该配体的半衰期延长。因此，将对HSA和靶分子具有特异性的配体，与对HAS无特异性且不结合HAS、而结合别的分子的相同配体进行比较。例如，它能结合靶分子上的第二表位。通常，半衰期延长10％、20％、30％、40％、50％以上。半衰期延长范围在2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x以上是可能的。或者，另外，半衰期延长范围高达30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x也是可能的。
“基本相同(或“基本同源”)”，第一氨基酸或核苷酸序列与第二氨基酸或核苷酸序列含有足够数量的相同或等同(例如具有相似侧链，例如保守氨基酸取代)氨基酸残基或核苷酸，以使第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似活性。就抗体而言，第二抗体与第一抗体具有相同的结合特异性并且具有第一抗体亲和力的至少50％。
本文所用的术语“低严格性”、“中等严格性”、“高严格性”或“极高严格性条件”描述了核酸杂交和洗涤条件。进行杂交反应的指南可参见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，所述文献通过引用全部结合到本文中。该参考文献中描述了含水方法和无水方法，都可以采用。本文所用的具体杂交条件如下(1)低严格性杂交条件在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约45℃，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，在至少50℃(对于低严格性条件，洗涤温度可升高至55℃)洗涤两次；(2)中等严格性杂交条件在6X SSC中，在约45℃，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，在60℃洗涤一次或多次；(3)高严格性杂交条件在6X SSC中，在约45℃，再在0.2X SSC、0.1％SDS中在65℃洗涤一次或多次；和优选(4)极高严格性杂交条件是0.5M磷酸钠、7％SDS中，在65℃，再在0.2X SSC、1％SDS中，在65℃洗涤一次或多次。极高严格性条件(4)是优选的条件，除非另有说明，否则应采用该条件。
本文所用的术语“竞争”是指当第二表位与其关联表位结合域结合时，第一表位与其关联表位结合域的结合受到抑制。例如，结合可以是空间上受到抑制，例如通过结合域的物理阻断或通过改变结合域的结构或环境，使其对表位的亲和力(affinity)或亲合力(avidity)降低。
与本文所公开的序列相似或同源(例如至少约70％序列同一性)的序列也是本发明的组成部分。在某些实施方案中，氨基酸水平上的序列同一性可以约为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上。在核酸水平上，序列同一性可以约为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上。或者，当核酸区段在所选杂交条件(例如极高严格性杂交条件)下与互补链杂交时，则存在基本的同一性。核酸可以存在于完整细胞中，存在于细胞裂解物中，或者呈部分纯化或基本纯化的形式。
两序列间“同源性”或“序列同一性”或“相似性”(这些术语在本文可互换使用)的计算如下进行。为了优化比较目的，将序列比对(例如为了比较目的，对于最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中引入空位，非同源序列可以忽略不计)。在一个优选的实施方案中，为了比较目的，所比对的参考序列长度占参考序列总长度的至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。然后，对相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的某个位置被与第二序列相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，那么分子在该位置上是相同的(本文所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。两序列间的％同一性是考虑到空位数和各空位长度后的两序列共享的相同位置数的函数，需要引入这些空位以进行两序列的最佳比对。
优选采用BLAST 2 Sequences算法，使用默认参数，制备和测定本文所定义的氨基酸和核苷酸序列比对和同源性、相似性或同一性(Tatusova，T.A.等，FEMS Microbiol Lett，174187-188(1999))。或者，最好采用BLAST算法(2.0版)进行序列比对，参数设定到默认值。BLAST算法在美国政府(“.gov”)的国立健康研究院(“nih”)国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，“.ncbi”)的万维网(“www”)上、在“/Blast/”目录下、在“blast_help.html”文件内有详细介绍。检索参数定义如下，最好是设定在已定好的默认参数。
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx程序所采用的启发式检索算法；这些程序都主要归功于采用Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(6)2264-8(参见如上所述的“blast_help.html”文件)的统计学方法的发现，只有很少的强化。BLAST程序专门用于序列相似性检索，例如鉴定查询序列的同源物。这些程序一般不用于基序风格的检索。有关序列数据库相似性检索的基本问题的讨论，参见Altschul等(1994)。
在美国国立生物技术信息中心网站可获得的5个BLAST程序来完成以下任务 “blastp”比较氨基酸查询序列和蛋白质序列数据库； “blastn”比较核苷酸查询序列和核苷酸序列数据库； “blastx”比较核苷酸查询序列(两条链)的六个读框概念翻译产物和蛋白质序列数据库； “tblastn”比较蛋白质查询序列和所有六个读框(两条链)动态翻译的核苷酸序列数据库。
“tblastx”比较核苷酸查询序列的六个读框翻译和核苷酸序列数据库的六个读框翻译。
BLAST采用下列检索参数 HISTOGRAM显示每次检索得分的直方图；默认为yes(是)。(参见BLAST手册中的参数H)。
DESCRIPTIONS限制对指定数量报告的匹配序列简短描述的数量；默认限制为100个描述。(参见手册的参数V)。另见EXPECT和CUTOFF。
ALIGNMENTS将数据库序列限定在报告高打分区段对(high-scoring segment pairs，HSP)的指定数量；默认限制为50。如果数据库序列比这更多，为了满足统计显著性的报告阈值(参见以下EXPECT和CUTOFF)，仅报告归于最大统计显著性的匹配。(参见BLAST手册的参数B)。
EXPECT针对数据库序列报告的匹配的统计显著性的阈值；默认值为10，使得预期仅偶然找到10个匹配，按照Karlin和Altschul(1990)的随机模型。如果归于匹配的统计显著性大于EXPECT阈值，则将不报告匹配。EXPECT阈值越低，严格性越高，导致报告的匹配机会越少。分数值是可接受的。(参见BLAST手册的参数E)。
CUTOFF用于报告高打分区段对的截止(Cutoff)分值。默认值从EXPECT值(参见上文)求出。HSP是为数据库序列而报告的，仅当归于它们的统计显著性至少与具有等于CUTOFF值的分值的孤立HSP一样高时。CUTOFF值越高，严格性越高，导致报告的匹配机会越小。(参见BLAST手册的参数S)。通常，显著性阈值可以用EXPECT更直观地控制。
MATRIX指定替代打分矩阵，用于BLASTP、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX。默认矩阵是BLOSUM62(Henikoff和Henikoff，1992，Proc.Natl.Aacad.Sci.USA 89(22)10915-9)。有效替代选择包括PAM40、PAM120、PAM250和IDENTITY。替代打分矩阵不适用于BLASTN；指定MATRIX在BLASTN请求中的方向返回错误响应。
STRAND将TBLASTN检索正好限制在数据库序列的顶链或底链；或将BLASTN、BLASTX或TBLASTX检索正好限制在查询序列的顶链或底链的读框。
FILTER掩蔽具有低成分复杂性的查询序列区段(通过Wootton和Federhen(1993)Computers and Chemistry 17149-163的SEG程序来确定)，或由短周期性内部重复序列组成的区段(通过Claverie和States，1993，Computers and Chemistry 17191-201的XNU程序来确定，或者对于BLASTN，通过Tatusov和Lipman的DUST程序来确定(参见NCBI的互联网站点))。过滤可从blast输出中消除具有统计学显著性但没有生物学意义的报告(例如针对常见富含酸性、碱性或脯氨酸区的命中)，留下更具生物学意义的查询序列区，适用于针对数据库序列的特定匹配。
过滤程序中发现的低复杂性序列在核苷酸序列中用字母“N”替代(例如“N”重复13次)，在蛋白质序列中用字母“X”替代(例如“X”重复9次)。
过滤仅适用于查询序列(或其翻译产物)，而不适用于数据库序列。对于BLASTN，默认过滤是DUST，而对于其它程序是SEG。
当用于SWISS-PROT中的序列时，SEG、XNU或这两者完全没有掩蔽什么，这并非是不常见的，所以不应当希望过滤总会有结果。此外，在某些情况下，序列完全被掩蔽，这表明任何针对未过滤查询序列而报告的匹配的统计学显著性应当受到怀疑。NCBI-gi CausesNCBI gi标识符在输出中显示，除了检索号和/或位置名称之外。最优选采用上述NCBI网址的“/BLAST”目录下所提供的简单BLAST检索算法，进行序列比较。
除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语都具有本领域(例如细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学)普通技术人员公知的相同含义。标准技术用于分子、遗传和生化方法(一般参见Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版，JohnWiley&Sons，Inc.，所述文献通过引用结合到本文中)和化学方法。
如本文所述，在小鼠吸烟所致慢性阻塞性肺病(COPD)亚慢性模型中进行了一项研究，即将基本上由可结合TNFR1的dAb单体组成的TNFR1拮抗剂给予所述小鼠模型。研究结果表明，TNFR1拮抗剂(例如包括可结合TNFR1的域抗体(dAb)的TNFR1拮抗剂)是治疗呼吸道疾病(例如肺部炎症、急性肺病、慢性肺病(例如COPD))的有效治疗药。事实上，该研究中所测试的拮抗剂比高剂量磷酸二酯酶4抑制剂或可结合并中和TNFα的可溶性TNFR1(ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(Immunex Corporation)))更有效。当通过系统给药(腹膜内注射)或通过鼻内给药局部给予肺组织时，所研究的TNFR1拮抗剂在模型中更有效。
令人吃惊的是，研究结果表明，在抑制模型的肺部细胞浸润中，局部给予可结合肺组织内靶标(例如TNFR1)的拮抗剂比起系统给予半衰期长的拮抗剂(PEG化dAb单体，经PEG化，以增加dAb单体的流体动力学尺寸和体内血清半衰期)更有效，甚至当系统给予5倍拮抗剂时。将系统给予2.5倍摩尔量的半衰期更长的拮抗剂(PEG化dAb单体，经PEG化，以增加dAb单体的流体动力学尺寸和体内血清半衰期)，与局部给予dAb单体进行比较。
如本文所述，进一步研究了经鼻内给药而局部给予肺组织后可结合TNFR1的dAb单体的药代动力学。研究结果表明，局部给予肺组织后，dAb单体在肺部滞留时间长，肺部dAb单体含量在8小时内基本恒定。另外，将dAb单体局部给予肺部，导致血清内仅存在低浓度的dAb单体。具体地讲，给药后1小时，血清中测得的最大水平约150ng/ml，而5小时后血清中检测不到dAb单体。
该项药代动力学研究结果令人吃惊，这表明，可将能结合肺组织内靶标的结合剂(例如抗体或可结合肺组织内靶标的抗体片段(例如Fab片段、Fab’片段、Fv片段(例如scFv、二硫键连接的Fv)、F(ab’)2片段、dAb)或者肺组织内靶标的拮抗剂(例如配体、dAb单体)，局部给予肺组织，在肺组织中提供长治疗窗(用于治疗、抑制、预防或诊断呼吸道疾病)，因为这些结合剂在肺组织中具有长滞留时间。药代动力学研究结果以及局部给予肺组织所提供的长治疗窗，也解释了将TNFR1拮抗剂局部给予小鼠COPD模型所观察到的优越功效。另外，所观察到的低剂量局部给予dAb单体的优越功效，进入血清的低浓度dAb单体，以及dAb单体从血清中快速清除的现象，都表明与其它类型的治疗药相比，可结合肺组织内靶标的结合剂(例如可结合肺组织内靶标的抗体片段(例如Fab片段、Fab’片段、Fv片段(例如scFv、二硫键连接的Fv)、F(ab’)2片段、dAb)产生副作用(例如免疫抑制、毒性)的可能性低得多。
在进一步的研究中，用炎症刺激物TNFα诱导了肺部炎症，这些研究结果表明，TNFR1拮抗剂(抑制TNFα与受体结合的抗TNFR1dAb，或不抑制TNFα与受体结合的抗TNFR1 dAb)显著抑制TNFα诱导的其它炎症介质的增加并抑制肺部细胞浸润，所述炎症介质例如早期起作用的嗜中性粒细胞化学引诱物KC和MIP-1，以及晚期起作用的趋化因子MCP-1和粘附分子E-选择蛋白。
本文所述的研究表明，可结合肺组织内靶标的结合剂(例如抗体片段(例如Fab片段、Fab’片段、Fv片段(例如scFv、二硫键连接的Fv)、F(ab’)2片段、dAb)、拮抗剂、配体、dAb单体)是优越的治疗药，用于治疗、抑制或预防肺部炎症和/或呼吸道疾病，或用于诊断目的(例如造影)。这些结果也表明，甚至当dAb单体具有短的体内血清半衰期时，也可将能结合肺组织内靶标的dAb单体和含有所述dAb的拮抗剂，局部给予肺组织，给肺组织提供长治疗窗，因为这样的dAb在肺组织具有长滞留时间。因此，可结合肺组织内靶标并具有短体内半衰期的其它结合剂(例如抗体片段，例如Fab片段、Fab’片段、Fv片段(例如scFv、二硫键连接的Fv)、F(ab’)2片段)，可局部给予肺组织，从而给肺组织提供长治疗窗(例如用于治疗、抑制、防止或预防呼吸道疾病)。
通常，可将能结合肺组织内靶标的结合剂(例如抗体片段(例如Fab片段、Fab’片段、Fv片段(例如scFv、二硫键连接的Fv)、F(ab’)2片段、dAb)、拮抗剂、配体、dAb单体)局部给予肺组织，从而给肺组织提供治疗窗达至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约11小时或者至少约12小时。
将可结合肺组织内靶标的结合剂局部给予肺组织。
第一方面，本发明涉及将可结合肺组织内靶标的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)给予患者以在其肺组织内产生长治疗窗(例如用治疗、抑制、预防或诊断呼吸道疾病)的方法。例如，肺组织内的治疗窗达至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约11小时或者至少约12小时。按照本发明的第一方面，结合剂经局部给予患者(例如人)的肺组织。
可采用任何合适方法，将可结合肺组织内靶标的结合剂(例如抗体片段(例如Fab片段、Fab’片段、Fv片段(例如scFv、二硫键连接的Fv)、F(ab’)2片段、dAb)、拮抗剂、配体、dAb单体)经局部给予患者的肺组织(例如肺)。例如，可通过吸入或鼻内给药方式，将结合剂局部给予肺组织。对于吸入或鼻内给药，可采用喷雾器、吸入器、雾化器、烟雾器、薄雾器(mister)、干粉吸入器、定量吸入器、定量喷雾器、定量薄雾器(metered dose mister)、定量雾化器或其它合适递药装置，给予结合剂(TNFR1拮抗剂、配体、dAb单体)。
在某些实施方案中，本发明方法包括将有效量的具有短体内血清半衰期并能结合肺组织内靶标的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)局部给予患者的肺组织。按照本发明，可将这类结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)局部给予肺组织，从而给肺组织提供长治疗窗，但又基本不会在血清内蓄积。因为这类结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)具有短的体内半衰期，所以，它们可跨越肺上皮而进入血清并快速从血清内清除，因而不会蓄积到产生副作用(例如全身副作用)的水平。例如，用于本发明第一方面的可结合肺组织内靶标的合适结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)的体内血清半衰期为约1秒钟至约12小时、约12小时以内、约11小时以内、约10小时以内、约9小时以内、约8小时以内、约7小时以内、约6小时以内、约5小时以内、约4小时以内、约3小时以内、约2小时以内、约1小时以内或约30分钟以内。按照本发明第一方面给药的优选的拮抗剂包括可结合肺组织内靶标的dAb。
用于本发明第一方面的尤其优选的结合剂(例如拮抗剂)是可结合肺组织内靶标的dAb单体或抗体的抗原结合片段(例如Fab片段、Fab’片段、Fv片段(例如scFv、二硫键连接的Fv、F(ab’)2片段)。dAb单体的体内血清半衰期约为30分钟。(参见WO 2004/081026A2实施例9和实施例13)。然而，如本文所述，局部给予可结合肺组织内靶标(例如TNFR1)的dAb单体，在肺组织内可导致治疗窗达至少8小时。同样，抗体的抗原结合片段(尤其是Fv片段)的体内血清半衰期也很短，使得它们不适合许多体内治疗和诊断应用。(Peters等，Science286(5439)434(1999))。然而，本文所述的研究结果表明，可将能结合肺组织内靶标的抗体的抗原结合片段局部给予肺组织，从而给肺组织提供长治疗窗(例如用于治疗、抑制、预防或诊断呼吸道疾病)，例如，治疗窗达至少8小时。
如本文所述，将可结合肺组织内靶标的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)局部给予肺组织，在肺组织(肺)中产生长治疗窗。在某些实施方案中，将可结合肺组织内靶标的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)局部给予肺组织，在肺组织(肺)中产生长治疗窗，其特征是在给药后4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时，肺部含有所给结合剂总量的至少约1％、至少约1.25％、至少约1.5％、至少约1.75％、至少约2％、至少约2.25％、至少约2.5％、至少约2.75％或者至少约3％。在某些实施方案中，将可结合肺组织内靶标的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)局部给予肺组织，在肺中产生长治疗窗，其特征是在给药后4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时，肺部共计(BAL和肺组织)含有所给结合剂总量的至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约20％、至少约15％、至少约10％或者至少约5％。
在其它实施方案中，将可结合肺组织内靶标的结合剂局部给予肺组织，在肺组织(肺)中产生长治疗窗，其中肺部结合剂水平达至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以上(例如在给药后所达到的水平(例如在局部给予肺部后1小时所达到的肺部水平))并维持至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约11小时或者至少约12小时。
如本文所述，将可结合肺组织内靶标的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)局部给予肺组织，在肺组织(肺)中产生长治疗窗，但是结合剂基本不进入体循环。当给药后5小时，血清内结合剂水平不超过所给结合剂总量的约2％、不超过约1.75％、不超过约1.5％、不超过约1.25％、不超过约1％、不超过约0.75％、不超过约0.5％或不超过约0.25％或者基本不含结合剂时，则结合剂基本不进入循环。在某些情况下，按照本文所述而给予的结合剂可进入体循环，但并不蓄积到显著水平，因为例如结合剂会被快速地从体循环中清除掉。因此，本发明提供将可结合肺组织内靶标的结合剂局部给予肺组织的方法，其中结合剂在体循环中未蓄积到显著水平。当给药后5小时，血清内结合剂水平不超过所给结合剂总量的约2％、不超过约1.75％、不超过约1.5％、不超过约1.25％、不超过约1％、不超过约0.75％、不超过约0.5％或不超过约0.25％或基本不含结合剂时，则体循环中的结合剂水平不显著。
通常，仅需要将可结合肺组织内靶标的“低剂量有效量药物(结合剂)”(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)局部给予患者的肺组织。低剂量有效量是指药物(结合剂)量小于同样药物(结合剂)通过系统给予并能达到相同效果的药物(结合剂)量(即有效系统剂量)。在某些实施方案中，低剂量有效量为有效系统剂量的约80％以下、约70％以下、约60％以下、约50％以下、约40％以下、约30％以下、约20％以下、约10％以下或约5％以下。
按照本发明第一方面，可局部给予肺组织的合适结合剂包括例如这样的结合剂可结合肺组织内靶标的抗体或抗体的抗原结合片段(例如Fab片段、Fab’片段、Fv片段(例如scFv、二硫键连接的Fv)、F(ab’)2片段、dAb)和拮抗剂(例如配体、dAb单体)，所述靶标例如TNFR1、IL-1、IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、IL-12、IL-12R、IL-13、IL-13Rα1、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、类糜蛋白酶、FGF、弗林蛋白酶、内皮素-1、嗜酸性粒细胞趋化因子类(例如嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、整联蛋白、L-选择蛋白、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、骨桥蛋白、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、涎免凝集素8(siglec8)、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、TNFR1、TRANCE、类胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、αvβ6、αvβ8、Cmet或CD8。
在一个实施方案中，靶标选自TNF信号级联中的蛋白质。优选该蛋白靶标选自TNFα、TNFβ、TNFR2、TRADD、FADD、胱冬蛋白酶-8、TNF受体相关因子(TRAF)、TRAF2、受体相互作用蛋白(RIP)、Hsp90、Cdc37、IKKα、IKKβ、NEMO、kB抑制剂(IkB)、NF-kB、NF-kB必需调节物、细胞凋亡信号调节激酶-1(aSMase)、中性鞘磷脂酶(nSMase)、ASK1、组织蛋白酶-B、生发中心激酶(GSK)、GSK-3、因子相关死亡域蛋白(FADD)、中性鞘磷脂酶活化相关因子(FAN)、FLIP、JunD、NF-kB激酶抑制剂(IKK)、MKK3、MKK4、MKK7、IKKγ、促分裂原活化蛋白激酶/Erk激酶激酶(MEKK)、MEKK1、MEKK3、NIK、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、PKC-ζ、RelA、T2K、TRAF1、TRAF5、死亡效应域(DED)、死亡域(DD)、死亡诱导信号转导复合物(DISC)、细胞凋亡蛋白抑制剂(IAP)、c-Jun N-erminal激酶(JNK)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷酸肌醇-3OH激酶(PI3K)、蛋白激酶A(PKA)、PKB、PKC、PLAD、PTEN、rel同源域(RHD)、RING(reallyinteresting new gene)、应激激活蛋白激酶(SAPK)、TNFα转化酶(TACE)、死亡域蛋白沉默因子(SODD)和TRAF相关NF-kB活化剂(TANK)。对于这些优选靶标，可参见WO04046189、WO04046186和WO04046185(通过引用结合到本文中)，这些文献提供选择抗体单可变区用于靶向胞内靶标的指南。
可采用任何合适方法，制备可结合肺组织内靶标的结合剂(例如抗体片段(例如Fab片段、Fab’片段、Fv片段(例如scFv、二硫键连接的Fv)、F(ab’)2片段、dAb)、拮抗剂、配体、dAb单体)，所述方法例如本文详述的有关能结合TNFR1的拮抗剂(例如配体、dAb单体)的方法。
在某些实施方案中，本发明是用可结合肺组织内靶标(例如TNFR1)的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)给患者(例如人)肺组织提供长治疗窗的方法，所述方法包括选择具有短体内血清半衰期(例如约12小时以内)并能结合肺组织内靶标的结合剂，并且将有效量或低剂量有效量的所选结合剂局部给予患者的肺组织。
在具体的实施方案中，本发明的第一方面是用可结合肺组织内靶标(例如TNFR1)的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)给患者(例如人)肺组织提供长治疗窗的方法，所述方法包括将有效量或低剂量有效量的所选结合剂局部给予患者的肺组织。优选所给予的结合剂不超过约10mg/kg/天。例如，所给予的结合剂约1mg/kg/天至约10mg/kg/天、例如约1mg/kg/天、约2mg/kg/天、约3mg/kg/天、约4mg/kg/天、约5mg/kg/天、约6mg/kg/天、约7mg/kg/天、约8mg/kg/天、约9mg/kg/天或约10mg/kg/天。在其它优选实施方案中，例如当将结合剂局部给予人的肺组织(肺)时，给予量不超过约10mg/天。例如，在这样的实施方案中，结合剂局部给予肺组织的剂量为约1mg/天至约10mg/天(例如10mg/天、9mg/天、8mg/天、7mg/天、6mg/天、5mg/天、4mg/天、3mg/天、2mg/天或1mg/天)。因此，结合剂局部给予肺组织的剂量为约1μg/kg/天至约200μg/kg/天(例如约10μg/kg/天、约20μg/kg/天、约30μg/kg/天、约40μg/kg/天、约50μg/kg/天、约60μg/kg/天、约70μg/kg/天、约80μg/kg/天、约90μg/kg/天、约100μg/kg/天、约110μg/kg/天、约120μg/kg/天、约130μg/kg/天、约140μg/kg/天、约150μg/kg/天、约160μg/kg/天、约170μg/kg/天、约180μg/kg/天或约190μg/kg/天)。在具体的实施方案中，给予约5μg/kg/天至约3mg/kg/天或优选给予约50μg/kg/天至约500μg/kg/天。
用于肺组织的可结合肺组织内靶标的结合剂在制备制剂和药物中的用途。
本发明的第一方面也涉及本文所述的可结合肺组织内靶标(例如TNFR1)的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)在制备供肺组织局部给予用的长效或长治疗窗制剂中的用途。在肺组织内的长治疗窗或长作用期可以是至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约11小时或者至少约12小时。
在某些实施方案中，所用的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)具有短体内血清半衰期并能结合肺组织内靶标。根据本发明，可将这类结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)局部给予肺组织，从而给肺组织提供长治疗窗，但又基本不会在血清内蓄积。例如，用于本发明第一方面的可结合肺组织内靶标的合适结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)的体内血清半衰期为约1秒钟至约12小时、约12小时以内、约11小时以内、约10小时以内、约9小时以内、约8小时以内、约7小时以内、约6小时以内、约5小时以内、约4小时以内、约3小时以内、约2小时以内、约1小时以内或约30分钟以内。
用于本发明第一方面的特别优选的结合剂(例如拮抗剂)是可结合肺组织内靶标的dAb单体或抗体的抗原结合片段(例如Fab片段、Fab’片段、Fv片段(例如scFv、二硫键连接的Fv)、F(ab’)2片段)。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的可结合肺组织内靶标(例如TNFR1)的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)在制备供肺组织(肺)局部给予用的长效或长治疗窗制剂中的用途。其中肺部结合剂水平的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以上(例如给药后所达到的水平(例如在局部给予肺部后1小时所达到的肺部水平))维持至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约11小时或者至少约12小时。在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的可结合肺组织内靶标(例如TNFR1)的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)在制备供肺组织(肺)局部给予用的长效或长治疗窗制剂中的用途，其中在肺部的长作用期或长治疗窗的特征是在给药后4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时，肺部共计(BAL和肺组织)含有所给结合剂总量的至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约20％、至少约15％、至少约10％或者至少约5％。
在某些实施方案中，本发明涉及本文所述的可结合肺组织内靶标(例如TNFR1)的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)在制备供肺组织(肺)局部给予用的长效或长治疗窗制剂中的用途，其中至少约1％、至少约1.25％、至少约1.5％、至少约1.75％、至少约2％、至少约2.25％、至少约2.5％、至少约2.75％或者至少约3％的制剂中结合剂含量(例如以制剂剂量给予)的肺部水平，在肺组织内持续至少4小时，至少5小时，至少6小时，至少7小时，至少8小时，至少9小时，至少10小时，至少11小时或者至少12小时(例如在给予制剂之后)。
优选用于本发明的结合剂基本不进入体循环(例如当呈长效或长治疗窗制剂形式时)。如本文所述，当给予结合剂(例如以制剂剂量)后5小时，血清内结合剂水平不超过所给结合剂总量(例如在制剂剂量中)的约2％、不超过约1.75％、不超过约1.5％、不超过约1.25％、不超过约1％、不超过约0.75％、不超过约0.5％或不超过约0.25％或者基本不含结合剂时，则结合剂基本不进入循环。在某些情况下，按照本文所述而给予的结合剂可进入体循环，但并不蓄积到显著水平，因为例如结合剂会被快速地从体循环中清除掉。因此，本发明提供可结合肺组织内靶标的结合剂在肺组织中的用途，其中结合剂在体循环中未蓄积到显著水平。当给予结合剂(例如以制剂剂量)后5小时，血清内结合剂水平不超过所给结合剂总量(例如在制剂剂量中)的约2％、不超过约1.75％、不超过约1.5％、不超过约1.25％、不超过约1％、不超过约0.75％、不超过约0.5％或不超过约0.25％或基本不含结合剂时，则体循环中的结合剂水平不显著。
本发明也涉及本文所述的可结合肺组织内靶标(例如TNFR1)的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)在制备将低剂量有效量结合剂局部给予肺组织的药物中的用途。如本文所述，低剂量有效量通常为有效系统剂量的约80％以下、约70％以下、约60％以下、约50％以下、约40％以下、约30％以下、约20％以下、约10％以下或约5％以下。
在某些实施方案中，本发明是制备供肺组织局部给药用的长效或长治疗窗制剂的方法，所述制剂包含可结合肺组织内靶标的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)；或是制备供肺组织局部给药用的低剂量有效量的可结合肺组织内靶标的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)的药物的方法。所述方法包括(1)选择能结合肺组织内靶标并具有短体内血清半衰期(例如约12小时以内)的结合剂，和(2)使用所选结合剂，来制备供肺组织局部给药用的长效或长治疗窗制剂，或来制备供肺组织局部给药用的低剂量有效量结合剂的药物。
本发明也涉及本文所述的可结合肺组织内靶标的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)在制备本文所述的供肺组织(肺)局部给药用的长效或长治疗窗制剂中的用途，或者在制备本文所述的供肺组织局部给药用的低剂量有效量结合剂的药物中的用途，其中给予结合剂的制剂或药物不超过约10mg/kg/天。例如，给予制剂或药物约1mg/kg/天至约10mg/kg/天，例如约1mg/kg/天、约2mg/kg/天、约3mg/kg/天、约4mg/kg/天、约5mg/kg/天、约6mg/kg/天、约7mg/kg/天、约8mg/kg/天、约9mg/kg/天或约10mg/kg/天。在某些实施方案中，将制剂或药物局部给予人的肺组织(肺)，而且给予制剂或药物不超过约10mg/天。例如，给予结合剂的制剂或药物的剂量为约1mg/天至约10mg/天(例如10mg/天、9mg/天、8mg/天、7mg/天、6mg/天、5mg/天、4mg/天、3mg/天、2mg/天或1mg/天)。因此，给予结合剂的制剂或药物的剂量为约1μg/kg/天至约200μg/kg/天(例如约10μg/kg/天、约20μg/kg/天、约30μg/kg/天、约40μg/kg/天、约50μg/kg/天、约60μg/kg/天、约70μg/kg/天、约80μg/kg/天、约90μg/kg/天、约100μg/kg/天、约110μg/kg/天、约120μg/kg/天、约130μg/kg/天、约140μg/kg/天、约150μg/kg/天、约160μg/kg/天、约170μg/kg/天、约180μg/kg/天或约190μg/kg/天)。在具体的实施方案中，给予约5μg/kg/天至约3mg/kg/天，或优选约50μg/kg/天至约500μg/kg/天。
可采用任何合适方法，将用本文所述的可结合肺组织内靶标的结合剂制备的制剂和药物，局部给予患者的肺组织(例如肺)。例如，可通过吸入或鼻内给药方式，将结合剂局部给予肺组织。对于吸入或鼻内给药，可采用喷雾器、吸入器、雾化器、烟雾器、薄雾器、干粉吸入器、定量吸入器、定量喷雾器、定量薄雾器、定量雾化器或其它合适递药装置，给予结合剂(TNFR1拮抗剂、配体、dAb单体)。
如有必要，例如对于诊断目的(例如造影)，可结合肺组织内靶标的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)可包含可检测标记。合适的可检测标记和用于标记结合剂的方法是本领域众所周知的。合适的可检测标记包括例如放射性同位素(例如铟-111、锝-99m或碘-131)、正电子发射标记(例如氟-19)、顺磁离子(例如镓(III)、锰(II))、表位标记(标签)、亲和标记(例如生物素、抗生物素蛋白)、自旋标记、酶、荧光基团或化学发光基团。当不使用标记时，可通过表面等离子共振或其它合适方法来测定复合物形成。
用于治疗、抑制或预防肺部炎症和呼吸道疾病的TNFR1拮抗剂 在第二方面，本发明涉及用于治疗、抑制或预防肺部炎症和/或呼吸道疾病的方法，所述方法包括给予有需要的患者(例如哺乳动物、人)有效量的TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb单体)。本发明也涉及TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb单体)在制备用于治疗、抑制或预防肺部炎症和/或呼吸道疾病的药物中的用途，以及涉及用于治疗、抑制或预防肺部炎症和/或呼吸道疾病并包含TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb单体)作为活性成分的药物组合物。适用于本发明的TNFR1拮抗剂在本文中有详述，其包括小分子、新型化学实体、配体、dAb单体等。
本发明提供包含TNFR1拮抗剂(例如配体、双特异性配体、多特异性配体、dAb单体)和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物，以及适用本发明配体或组合物的治疗和诊断方法。根据本发明的方法，拮抗剂和配体(例如双特异性配体、多特异性配体、dAb单体)可用于体内治疗和预防应用、体内诊断应用等。
TNFR1拮抗剂(例如配体、多特异性配体、双特异性配体、dAb单体)的治疗和预防用途包括将有效量的TNFR1拮抗剂(例如配体、多特异性配体、双特异性配体、dAb单体)给予哺乳动物受体或患者，例如人。
例如，TNFR1拮抗剂(例如配体、多特异性配体、双特异性配体、dAb单体)通常可用于预防、抑制或治疗肺部炎症和/或呼吸道疾病，例如以肺部炎症为症状或病理部分的病症、急性呼吸道疾病、慢性呼吸道疾病、急性炎性呼吸道疾病和慢性炎性呼吸道疾病。例如，可给予TNFR1拮抗剂(例如配体、多特异性配体、双特异性配体、dAb单体)以治疗、抑制或预防肺部炎症、慢性阻塞性肺病(例如慢性支气管炎、慢性阻塞性支气管炎、肺气肿)、哮喘(例如甾体药物耐受性哮喘)、肺炎(例如细菌性肺炎、例如葡萄球菌性肺炎)、过敏性肺炎、伴有嗜酸粒细胞增多的肺部浸润、环境性肺病、肺炎、支气管扩张、囊性纤维化、间质性肺病、原发性肺动脉高压、肺血栓栓塞症、胸膜病、纵隔病、横隔膜病、通气不足、通气过度、睡眠呼吸暂停、急性呼吸窘迫综合征、间皮瘤、肉瘤、移植物排斥、移植物抗宿主病、肺癌、变应性鼻炎、变态反应、石棉肺、曲霉肿、曲霉病、支气管扩张、慢性支气管炎、肺气肿、嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化、侵袭型肺炎球菌病(IPD)、流感、非结核性分枝杆菌、胸腔积液、尘肺、肺囊虫病、肺炎、肺放线菌病、肺泡蛋白沉积症、肺炭疽、肺水肿、肺栓子、肺部炎症、肺组织细胞增多症X(嗜曙红细胞肉芽肿)、肺动脉高压、肺诺卡菌病、肺结核、肺静脉闭塞性疾病、类风湿性肺病、结节病、韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)和非小细胞肺癌。
在本发明的应用中，术语“预防”包括在疾病诱发之前给予保护性组合物。“抑制”是指在诱导事件之后、而在临床上出现疾病之前给予组合物。“治疗”包括在疾病症状出现后给予保护性组合物。
最好是双特异性或多特异性配体可用于针对在生物体内治疗环境中起协同作用的细胞因子和其它分子。因此，本发明提供协同能结合细胞因子或其它分子的两个或更多个结合域(例如dAb)活性的方法，其中一个结合域与肺组织中的TNFR1或其它靶标结合，而其它结合域与细胞因子或其它分子结合；该方法包括给予能够结合所述两个或更多个分子(例如TNFR1和细胞因子)的双特异性或多特异性配体。例如，本发明的这一方面涉及VH区和VL区的组合、仅有VH区的组合和仅有VL区的组合。
在治疗中可以多种方式达到协同作用。例如，仅当配体同时针对两个靶标时，靶标组合才具有治疗活性，而仅针对一个靶标则没有疗效。在另一个实施方案中，仅一个靶标可提供稍低或最小疗效，但是与第二靶标一起的组合协同性地增加了疗效。
可以采用动物模型系统，用于在预防、抑制或治疗呼吸道疾病中筛选TNFR1拮抗剂(例如配体、抗体或其结合蛋白、dAb单体)的有效性是可行的。例如，合适的呼吸道疾病动物模型包括慢性阻塞性肺病模型(参见Groneberg，DA等，Respiratory Research 518(2004))和哮喘模型(参见Coffman等，J.Exp.Med.201(12)1875-1879(2001)。优选TNFR1拮抗剂(例如配体或dAb单体)在小鼠吸烟所致慢性阻塞性肺病模型(例如本文所公开的亚慢性模型)或合适的灵长类哮喘或慢性阻塞性肺病模型中有效。更优选TNFR1拮抗剂(例如配体或dAb单体)在小鼠吸烟所致慢性阻塞性肺病模型(例如本文所公开的亚慢性模型)中有效(另见Wright和Churg，Chest，122301-306(2002))。例如，与合适对照相比，在模型中给予有效量的配体可减少、延迟或预防COPD症状的发作。现有技术没有给出在这些模型中使用TNFR1拮抗剂(例如配体或dAb单体)的启示，也没有给出它们是否有效的启示。
通常，纯化形式的本发明拮抗剂(例如配体)可与药理学上合适的载体一起使用。通常，这些载体包括水性或醇/水溶液剂、乳剂或混悬剂，任意包括盐水和/或缓冲介质。胃肠外溶媒包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠以及乳酸化林格液。可以从增稠剂中选出合适的生理上可接受的辅料，如果需要在混悬剂中维持多肽复合物的话，这些增稠剂例如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。
静脉内溶媒包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的那些。也可含有防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington′s PharmaceuticalSciences，第16版)。各种合适制剂都可采用，包括延长释放的制剂。
可以单独给予的组合物形式使用本发明的拮抗剂(例如配体)，或者将其与其它药物联用。这些药物可包括各种药物，例如磷酸二酯酶抑制剂(例如磷酸二酯酶4抑制剂)、支气管扩张药(例如β2-激动剂、抗胆碱能药、茶碱)、短效β-激动剂(例如舒喘灵(albuterol)、沙丁胺醇(salbutamol)、班布特罗、非诺特罗、异他林(isoetherine)、异丙肾上腺素、左沙丁胺醇、奥西那林、吡布特罗、特布他林和甲磺酸比托特罗吸入剂(tornlate))、长效β-激动剂(例如福莫特罗和沙美特罗)、短效抗胆碱能药(例如异丙托溴铵和氧托溴铵)、长效抗胆碱能药(例如噻托品)、茶碱(例如短效制剂、长效制剂)、吸入用甾体药物(例如倍氯米松、贝可乐(beclometasone)、布地奈德、氟尼缩松、丙酸氟替卡松和曲安西龙)、口服甾体药物(例如甲泼尼龙、泼尼松龙、强的松龙(prednisolon)和泼尼松)、短效β-激动剂与抗胆碱能药联用(例如舒喘灵/沙丁胺醇/异丙阿托品(ipratopium)和非诺特罗/异丙阿托品)、长效β激动剂与吸入用甾体药物联用(例如沙美特罗/氟替卡松和福莫特罗/布地奈德)和粘液溶解药(例如厄多司坦、乙酰基半胱氨酸、溴己新(bromheksin)、羧甲半胱氨酸、guiafenesin和碘化甘油)、环孢菌素、抗生素、抗病毒药、甲氨蝶呤、阿霉素、顺铂和免疫毒素。
药物组合物可包含各种细胞毒剂或其它药物以及本发明拮抗剂(例如配体)或者甚至具有不同特异性的本发明配体组合的“合剂(cocktail)”，所述配体例如用不同靶抗原或表位(无论它们在给药前是否混合)选择的配体。
可以给予TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb单体)和或将TNFR1拮抗剂与一种或多种额外治疗药或活性剂配制在一起。当TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb单体)与额外治疗药一起给予时，TNFR1拮抗剂可以在给予额外药物之前、同时或之后给予。通常，可以能提供重叠疗效的方式给予TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb单体)和额外药物。
可以给予含有本发明拮抗剂(例如配体)或其合剂的组合物，用于预防性治疗和/或治疗性治疗。在某些治疗应用中，达到至少部分抑制、阻遏、调节、杀伤所选细胞群体或其它可测定参数的足够量，定义为“治疗有效量”。例如，对于治疗肺部炎症和/或呼吸道疾病，痰抑制量、支气管活检炎症抑制量、呼吸困难抑制量、第一秒用力呼气肺活量(FEV(1))增加量、健康状况改善增加量，正如合适的问卷调查(例如St.George呼吸问卷调查(例如4点改善评分))评价所量化的那样。
尽管达到这些效果的所需用量将取决于疾病严重程度和患者自身免疫系统的一般状态，但是通常范围为每千克体重0.005-10.0mg药物、拮抗剂(例如配体、dAb单体)或其结合蛋白，更常用的剂量为0.05-2.0mg/kg/剂。在具体的实施方案中，给药量为约5μg/kg/剂至约3mg/kg/剂或优选约50μg/kg/剂至约500μg/kg/剂。
对于预防应用而言，也可以类似或稍低剂量给予含有本发明配体或其合剂的组合物，以预防、抑制或延迟疾病发作(例如维持缓解或静止状态，或者预防急性期)。熟练的临床医生能够确定合适的给药间隔，以治疗、抑制或预防疾病。当给予TNFR1拮抗剂(例如配体)以治疗、抑制或预防肺部炎症或呼吸道疾病时，可以给予最多4次/天，每周两次，每周一次，每两周一次，每月一次或每两月一次，其剂量例如为约10μg/kg至约80mg/kg、约100μg/kg至约80mg/kg、约1mg/kg至约80mg/kg、约1mg/kg至约70mg/kg、约1mg/kg至约60mg/kg、约1mg/kg至约50mg/kg、约1mg/kg至约40mg/kg、约1mg/kg至约30mg/kg、约1mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约10μg/kg至约10mg/kg、约10μg/kg至约5mg/kg、约10μg/kg至约2.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg。在具体的实施方案中，给予TNFR1拮抗剂(例如配体)以治疗、抑制或预防肺部炎症或呼吸道疾病，每天一次，每两天一次，每周一次，每两周一次或每月一次，剂量为约10μg/kg至约10mg/kg(例如约10μg/kg、约100μg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg)。具体的实施方案中，给予约5μg/kg至约3mg/kg或者优选给予约50g/kg至约500μg/kg。
也可给予TNFR1拮抗剂(例如配体)以治疗、抑制或预防肺部炎症或呼吸道疾病，其日用量或单位剂量为约10mg、约9mg、约8mg、约7mg、约6mg、约5mg、约4mg、约3mg、约2mg或约1mg。
相对于治疗前所具有的所述症状、或者相对于未用所述组合物或其它合适对照治疗的个体(人或模型动物)的所述症状而言，当一种或多种症状减少(例如达至少10％或在临床评价量表中达至少一个点)时，就认为用本文所述的组合物进行的治疗是“有效”的。尽管症状视所针对的疾病或障碍而明显不同，但是可以由普通熟练的临床医生或技术人员来测定。这些症状可以通过例如监测疾病或障碍的一个或多个物理指标来测定(例如肺组织的细胞浸润、痰的产生、痰的细胞浸润、呼吸困难、运动耐量、肺活量测定((例如最大肺活量(FVC))、第一秒用力呼气肺活量(FEV(1)、FEV(1)/FVC)、疾病恶化速率或严重程度、或通过可接受的临床评价量表(例如St.George呼吸问卷调查)。合适的临床评价量表包括例如FEV(1)的气流阻塞严重程度(ClinicalGuideline 12，Chronic Obstructive Pulmonary Disease，Management ofChronic Obstructive Pulmonary Disease in Adults in Primary andSecondary Care，National Institute for Clinical Excellence，London(2004))、呼气峰流量(PEF)(British Guideline on the Management ofAsthma，British Thoracic Society，Scottish Intercollegiate GuidelinesNetwork，Revised Edition(2004))、按照美国胸科学会(AmericanThoracic Society，ATS)标准确定的COPD分期(Am.J.Respir.Crit.CareMed.，152S77-S120(1995)、按照ATS标准确定的哮喘损伤分类(Am.Rev.Respir.Dis.，1471056-1061(1993)或本领域已知的其它可接受的临床评价量表。疾病或障碍症状持续(例如一天以上，优选超过一天)下降达至少10％或者在给定临床量表上下降达一个点或多个点，就表明是“有效”治疗。同样，相对于未经组合物治疗的类似个体(人或动物模型)的一种或多种症状而言，当所述症状的发作或严重程度被延迟、减少或消除时，用本文所述的组合物进行预防就是“有效”的。
含有本发明拮抗剂(例如配体)的组合物可用于预防和治疗装置，以帮助改变、钝化、杀伤或去除哺乳动物的所选靶细胞群体。例如，所述组合物可用于降低肺内炎性细胞水平和/或抑制肺部细胞浸润。
含有本发明拮抗剂(例如配体)的组合物也可用于降低炎性介质的水平，所述炎性介质例如由肺部炎性刺激所诱导的细胞因子、趋化因子、细胞粘附分子。例如，dAb单体TNFR1拮抗剂可抑制(i)炎性刺激物诱导的(例如TNFα诱导的)早期起作用介质(例如嗜中性粒细胞化学引诱物KC和MIP-1)水平的升高，和/或(ii)抑制炎性刺激物诱导的(例如TNFα诱导的)晚期起作用介质(例如趋化因子MCP-1和粘附分子E-选择蛋白)水平的升高。也可影响其它介质，例如LTB4、GRO-a、IP-10、GM-CSF、活性氧中间体(ROS)、NO等。
可将本发明的配体冻干贮存，临用前再用合适载体重配。已知该技术用常规免疫球蛋白是有效的，可采用本领域已知的冻干和重配技术。本领域技术人员将会知道，冻干和重配会导致不同程度的抗体活性损失(例如用常规免疫球蛋白，IgM抗体比起IgG抗体倾向于具有更大的活性损失)，可上调使用水平以便进行补偿。可将本发明的配体冻干而形成干粉，供吸入用，并以此形式给药。
本发明药物组合物的给药途径可以是本领域普通技术人员公知的任何途径。给药可通过任何合适方式，包括胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、经皮、通过肺部途径或通过导管直接输注。给药剂量和频率可因患者年龄、性别和症状、同时给予的其它药物、禁忌症(counterindications)和临床医师要考虑的其它参数而异。按照指示，给药可以是局部(例如通过肺部给药而局部递送到肺部，例如鼻内给药)或系统给药。
在具体的实施方案中，TNFR1拮抗剂的给予可通过肺部递药例如吸入(例如支气管内、鼻内或口腔吸入、滴鼻)，或通过系统递药(例如胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、皮下)。在优选的实施方案中，可通过肺部给药例如吸入或鼻内给药(例如支气管内、鼻内或口腔吸入、滴鼻)将TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb单体)给予患者。对于吸入，可利用喷雾器、吸入器、雾化器、烟雾器、薄雾器、干粉吸入器、定量吸入器、定量喷雾器、定量薄雾器、定量雾化器或其它合适递药装置，给予TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb单体)。
本发明涉及用于治疗、抑制或预防肺部炎症或呼吸道疾病的方法，所述方法包括给予有需要的患者有效量的TNFR1拮抗剂，其中所述有效量不超过约10mg/kg/天，而且相对于治疗前水平而言，优选肺内炎性细胞水平下降，其p≤0.05；或者相对于治疗前水平而言，炎性细胞向肺部募集受到抑制，其p≤0.05。相对于治疗前水平而言，肺内炎性细胞水平或炎性细胞向肺部的募集可降低或受到抑制达至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或者至少约95％。
优选采用本文的实施例所述方法进行统计学分析。在某些实施方案中，相对于治疗前水平而言，肺内炎性细胞水平或炎性细胞向肺部的募集可降低或受到抑制，其p＜0.001。
可采用任何合适方法评价肺部细胞(例如炎性细胞)水平，所述方法例如BAL、痰或活检样品(例如支气管活检样品、肺活检样品)中的总细胞计数或分类细胞计数(例如巨噬细胞计数、嗜中性粒细胞计数、嗜酸性粒细胞计数、淋巴细胞计数、上皮细胞计数)。
本发明也涉及用于治疗呼吸道疾病的方法，所述方法包括(1)选择在合适的呼吸道疾病动物模型中当以不超过约10mg/kg(每天一次)的剂量给予时具有功效的肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)拮抗剂，其中相对于未治疗的对照而言，当按照支气管肺泡灌洗液中的总细胞计数而评价的肺部细胞浸润受到抑制(其p≤0.05)时，则在所述动物模型中具有功效；和(2)将有效量的所述TNFR1拮抗剂给予有需要的患者(例如局部给予所述患者的肺组织)。
在某些实施方案中，采用本文所述的方法来治疗、抑制或预防慢性阻塞性肺病(例如慢性支气管炎、慢性阻塞性支气管炎、肺气肿)、哮喘(例如甾体药物耐受性哮喘)、肺炎(例如细菌性肺炎，例如葡萄球菌性肺炎)或肺部炎症。
本发明也涉及本文所述的TNFR1拮抗剂在制备用于用于治疗本文所述的肺部炎症或呼吸道疾病的药物或制剂中的用途。该药物可用于系统给予和/或局部给予肺组织。
TNFR1拮抗剂 TNFR1是一种跨膜受体，它含有胞外区和胞内区，其中胞外区能结合配体，胞内区缺乏内在信号转导活性、但能结合信号转导分子。具有结合TNF的TNFR1复合物含有3条TNFR1链和3条TNF链。(Banner等，Cell，73(3)431-445(1993))。TNF配体以三聚体形式存在，它与3条TNFR1链结合(出处同上)。这3条TNFR1链在受体-配体复合物中紧密簇集在一起，这种簇集是TNFR1介导的信号转导的先决条件。事实上，在TNF不存在时，结合TNFR1的多价物质(例如抗TNFR1抗体)可诱导TNFR1成簇和信号转导，并且通常用作TNFR1激动剂。(参见例如Belka等，EMBO，14(6)1156-1165(1995)；Mandik-Nayak等，J.Immunol.，1671920-1928(2001))。因此，与TNFR1结合的多价物质通常并非有效的TNFR1拮抗剂，甚至当它们阻断TNFα与TNFR1的结合时。
TNFR1的胞外区包含13个氨基酸的氨基端区段(SEQ ID NO213(人)的氨基酸1-13；SEQ ID NO215(小鼠)的氨基酸1-13)、域1(SEQID NO213(人)的氨基酸14-53；SEQ ID NO215(小鼠)的氨基酸14-53)、域2(SEQ ID NO213(人)的氨基酸54-97；SEQ ID NO215(小鼠)的氨基酸54-97)、域3(SEQ ID NO213(人)的氨基酸98-138；SEQED NO215(小鼠)的氨基酸98-138)和域4(SEQ ID NO213(人)的氨基酸139-167；SEQ ID NO215(小鼠)的氨基酸139-167)，其后接着是膜近端区(SEQ ID NO213(人)的氨基酸168-182；SEQ ID NO215(小鼠)的氨基酸168-183)。(参见Banner等，Cell 73(3)431-445(1993)和Loetscher等，Cell 61(2)351-359(1990))。域2和域3接触结合配体(TNFβ、TNFα)。(Banner等，Cell，73(3)431-445(1993))。TNFR1胞外区也含有一个称为前配体结合装配区或PLAD区的区(SEQ ID NO213(人)的氨基酸1-53；SEQ ID NO215(小鼠)的氨基酸1-53)(美国政府，WO 01/58953；Deng等，Nature Medicine，doi10.1038/nm1304(2005))。
TNFR1通过蛋白水解等过程在体内从细胞表面脱落，产生可溶性形式的TNFR1，所述过程包括TNFR1在域4或在膜近端区(SEQ ID NO213的氨基酸168-182；SEQ ID NO215的氨基酸168-183)的蛋白水解。可溶性TNFR1保留了结合TNFα的能力，因此起到TNFα活性的内源抑制剂的作用。
适用于本发明的TNFR1拮抗剂(例如本文所述的配体)对肿瘤坏死因子受体1(TNFR1；p55；CD120a)具有结合特异性。优选TNFR1拮抗剂对肿瘤坏死因子2(TNFR2)没有结合特异性，或者基本不拮抗TNFR2。TNFR1拮抗剂基本不拮抗TNFR2，当在标准细胞测定中，拮抗剂(1nM、10nM、100nM、1μM、10μM或100μM)导致不超过约5％的由TNFα(100pg/ml)诱导的TNPR1介导的活性被抑制。
适用于本发明的TNFR1拮抗剂是有效治疗药(有效，具有疗效)用于治疗呼吸道疾病(例如急性呼吸道疾病、慢性呼吸道疾病、急性炎性呼吸道疾病、慢性炎性呼吸道疾病)。例如，当以有效量给予时，适用于本发明的TNFR1拮抗剂在呼吸道疾病模型中有效。通常有效量为约1μg/kg至约10mg/kg或约1mg/kg至约10mg/kg(例如约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg)。一些合适的呼吸道疾病动物模型是本领域已知的，本领域技术人员都知道它们可用于预测在人体内的疗效。例如，合适的呼吸道疾病动物模型包括慢性阻塞性肺病模型(参见Groneberg，DA等，Respiratory Research 518(2004))、哮喘模型(参见Coffman RL等，J.Exp.Med.201(12)1875-1879(2001)；Van Scott，MR等，J.App.Physiol.961433-1444(2004))和肺纤维变性模型(例如Venkatesan，N等，Lung 2871342-1347(2004)。优选TNFR1拮抗剂(例如配体或dAb单体)在小鼠吸烟所致慢性阻塞性肺病模型(例如本文所公开的亚慢性模型)或合适的灵长类哮喘或慢性阻塞性肺病模型中有效(参见例如Coffman RL等，J.Exp.Med.201(12)1875-1879(2001)；Van Scott，MR等，J.App.Physiol.961433-1444(2004))。更优选TNFR1拮抗剂(例如配体或dAb单体)在小鼠吸烟所致慢性阻塞性肺病模型(例如本文所公开的亚慢性模型)中有效(另见Wright和Churg，Chest，122301-306(2002))。例如，与合适对照相比，给予有效量的配体可在模型中降低、延迟或预防COPD的症状发作。现有技术没有给出在这些模型中使用TNFR1拮抗剂(例如配体或dAb单体)的启示，也没有给出它们是否有效的启示。
合适的TNFR1拮抗剂可以是单价或多价的。在某些实施方案中，拮抗剂是单价的，含有一个与TNFR1相互作用的结合位点。单价拮抗剂能结合一个TNFR1，而不诱导细胞表面TNFR1的交联或成簇，这样的交联或成簇能导致受体活化和信号转导。在具体的实施方案中，单价TNFR1拮抗剂与TAR2m-21-23竞争性结合小鼠TNFR1或者与TAR2h-205竞争性结合人TNFR1。
多价TNFR1拮抗剂可含有两个或更多个拷贝的针对TNFR1的特定结合位点或者含有两个或更多个能结合TNFR1的不同结合位点。例如，TNFR1拮抗剂可以是二聚体、三聚体或多聚体，其包含两个或更多个拷贝的能结合TNFR1的特定dAb或者两个或更多个能结合TNFR1的不同dAb。在标准细胞测定中，优选多价TNFR1拮抗剂基本上不激动TNFR1(起到TNFR1激动剂的作用)(即在测定中，当浓度为1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1000μM或5,000μM时，导致不超过约5％的由TNFα(100pg/ml)诱导的TNPR1介导的活性)。
合适的多价TNFR1拮抗剂可含有两个或更多个针对TNFR1的所需表位或结构域的结合位点。例如，多价TNFR1拮抗剂可包含两个或更多个能结合TNFR1的同一表位的结合位点，或包含两个或更多个能结合TNFR1的不同表位或结构域的结合位点。在一个实例中，多价TNFR1拮抗剂包含第一结合位点和第二结合位点，其中第一结合位点能结合TNFR1的第一表位，第二结合位点能结合TNFR1的不同的第二表位。在本文所述的标准L929细胞毒性测定或标准HeLaIL-8测定中，优选所述多价拮抗剂当浓度为约1nM、或约10nM、或约100nM、或约1μM、或约10μM时，不激动TNFR1。
适用于本发明的一些TNFR1拮抗剂能结合TNFR1并抑制TNFα与TNFR1的结合。在具体的实施方案中，所述TNFR1拮抗剂与TAR2h-10-27、TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-10或TAR2h-185-25竞争性结合TNFR1。
适用于本发明的一些TNFR1拮抗剂不抑制TNFα与TNFR1的结合，但却抑制通过TNFR1介导的信号转导。例如，TNFR1拮抗剂可抑制TNFα诱导的TNFR1成簇，而这是通过TNFR1的信号转导之前的步骤。这类拮抗剂具有若干优势。例如，在这样的拮抗剂存在下，TNFα能结合在细胞表面表达的并离开细胞环境的TNFR1，但是不会激活TNFR1介导的信号转导。因此，TNFR1信号诱导的额外TNFα和其它炎症介质的产生将会被抑制。同样，能结合TNFR1并抑制通过TNFR1介导的信号转导、但却不抑制TNFα与TNFR1结合的TNFR1拮抗剂，将不抑制内源产生的可溶性TNFR1的TNFα的结合及抑制活性。因此，将这样的拮抗剂给予有需要的哺乳动物，可补充内源调节途径，所述途径在体内抑制TNFα的活性和TNFR1的活性。
在一个具体的实施方案中，适用于本发明的TNFR1拮抗剂(例如dAb单体或配体)与TNFR1结合并且抑制在结合TNFα后能通过TNFR1介导的信号转导。这样的拮抗剂可抑制通过TNFR1的信号转导，但不抑制TNFα与TNFR1的结合和/或TNFR1的脱落，以产生可溶性TNFR1。因此，将这样的拮抗剂给予有需要的哺乳动物，可补充内源调节途径，所述途径在体内抑制TNFα的活性和TNFR1的活性。
适用于本发明的某些TNFR1拮抗剂(例如化合物，新型化学实体、dAb单体、配体)能结合TNFR1并与TAR2m-21-23竞争性结合小鼠TNFR1或与TAR2h-205竞争性结合人TNFR1。适用于本发明的其它TNFR1拮抗剂(例如化合物，新型化学实体、dAb单体、配体)能结合TNFR1并与TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-10、TAR2h-185-25或TAR2h-27-10竞争性结合TNFR1(例如人和/或小鼠TNFR1)。
一些拮抗剂(例如配体、dAb单体)可交叉反应，能结合人TNFR1和另一物种(例如适用于医学研究的动物)的TNFR1。例如可结合人TNFR1和小鼠TNFR1的dAb单体。这类拮抗剂(例如配体、dAb单体)具有这样的优势可用相同拮抗剂(例如dAb单体)进行临床前和临床研究，而不需要用合适替代配体来进行临床前研究。交叉反应性拮抗剂的优选实例可结合人TNFR1，小鼠、大鼠或豚鼠等啮齿动物的TNFR1，以及兔、狗、羊、猪或非人类灵长类(例如猕猴(cynomolgusmonkey)或恒河猴(rhesus macaque))的TNFR1。
通常，本发明的交叉反应性拮抗剂能以类似的亲和力(Kd)与人TNFR1和另一物种的TNFR1结合。优选交叉反应性拮抗剂(例如dAb单体)与人TNFR1和另一物种的TNFR1结合的亲和力差异不超过约100倍、10倍或5倍。例如，交叉反应性dAb单体与人TNFR1结合的亲和力为1nM，而与小鼠、猕猴或恒河猴的TNFR1结合的亲和力为约10pM至约100nM、约100pM至约10nM或约200pM至约5nM。
交叉反应性拮抗剂(例如dAb单体)能结合人TNFR1和另一物种(例如在上两段提到的非人类灵长类)的TNFR1的结合速率(on rate)(K结合)的差异不超过约100倍、10倍或5倍，和/或解离速率(off rate)(K解离)的差异不超过约100倍、10倍或5倍。例如，拮抗剂可以是可同时结合人TNFR1和另一物种的TNFR1的dAb单体，其K结合为约104M/s至约105M/s和/或K解离为约10-3s-1至约10-5s-1。
适用于本发明的TNFR1拮抗剂还包括对TNFR1具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段(例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段或Fv片段(例如scFV))。在某些实施方案中，拮抗剂是单价的，例如dAb或抗体的单价抗原结合片段，例如Fab片段、Fab’片段或Fv片段。
优选TNFR1拮抗剂是本文所述的配体(例如dAb单体)。如本文所述，适用于本发明的优选的TNFR1拮抗剂包括可结合TNFR1并抑制TNFR1功能的dAb单体。然而，适用于本发明的TNFR1拮抗剂(例如配体)并不包含“dAb”，而是包含可结合TNFR1的dAb的CDR的结构域(例如移植到合适蛋白质支架或骨架上的CDR，例如亲和体(affibody)、SpA支架、LDL受体A类区或EGF区)或包含TNFR1的结合位点的蛋白结构域，例如其中结构域选自亲和体、SpA区、LDL受体A类区、EGF区、高亲和性多聚体(avimer)。因此，本说明书全文可视为用这样的结构域代替dAb，以提供拮抗剂、配体和方法的公开内容。
通过表面等离子共振测定，按照本发明任何方面，TNFR1拮抗剂(包括配体)以及用于构建所述配体的dAb单体，优选与其靶标结合的Kd为300nM至5pM(即3×10-7M至5×10-12M)，优选50nM至20pM、或5nM至200pM、或1nM至100pM、1×10-7M以下、1×10-8M以下、1×10-9M以下、1×10-10M以下、1×10-11M以下；和/或K解离速率常数为5×10-1s-1至1×10-7s-1，优选1×10-2s-1至1×10-6s-1、或5×10-3s-1至1×10-5s-1、或5×10-1s-1以下、或1×10-2s-1以下、或1×10-3s-1以下、或1×10-4s-1以下、或1×10-5s-1以下、或1×10-6s-1以下。Kd速率常数定义为K解离/K结合。或者，配体(例如dAb单体)与TNFR1的结合具有中速或快速K结合以及慢速K解离。优选的K结合为约104M/s至约105M/s和/或K解离为约10-3s-1至约10-5s-1。
与TNFR1结合的配体和dAb单体 适用于本发明的优选TNFR1拮抗剂是配体或dAb单体，当按有效量给予时，它们在呼吸道疾病模型中有效。通常有效量为约1mg/kg至约10mg/kg(例如约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg)。在具体的实施方案中，给予约5μg/kg至约3mg/kg或优选约50μg/kg至约500μg/kg。
一些合适的呼吸道疾病动物模型是本领域已知的，本领域技术人员都知道它们可用于预测在人体内的疗效。例如，合适的呼吸道疾病动物模型包括慢性阻塞性肺病模型(参见Groneberg，DA等，Respiratory Research 518(2004))和哮喘模型(参见Coffman等，J.Exp.Med.201(12)1875-1879(2001)。优选配体或dAb单体在本文所述的小鼠吸烟所致慢性阻塞性肺病的亚慢性模型中有效。(另见Wright和Churg，Chest，122301-306(2002))。例如，与合适对照相比，给予有效量的配体可在模型中降低、延迟或预防COPD的症状发作。现有技术没有给出在这些模型中使用TNFR1拮抗剂(例如配体或dAb单体)的启示，也没有给出它们是否有效的启示。
通常，合适的配体(例如dAb单体)包括抗TNFR1 dAb单体(例如包含所述dAb的双特异性配体)，根据表面等离子共振的测定，所述单体与TNFR1结合的Kd为300nM至5pM(即3×10-7至5×10-12M)、优选50nM至20pM、更优选5nM至200pM、最优选1nM至100pM，例如1×10-7M以下、优选1×10-8M以下、更优选1×10-9M以下、有利的是1×10-10M以下，最优选1×10-11M以下；和/或K解离速率常数为5×10-1s-1至1×10-7s-1、优选1×10-2s-1至1×10-6s-1、更优选5×10-3s-1至1×10-5s-1，例如5×10-1s-1以下、优选1×10-2s-1以下、有利的是1×10-3s-1以下、更优选1×10-4s-1以下、还更优选1×10-5s-1以下、最优选1×10-6s-1以下。(Kd＝K解离/K结合)。根据表面等离子共振的测定，适用于本发明的某些配体或dAb单体与人TNFR1特异性结合的Kd为50nM至20pM，而K解离速率常数为5×10-1s-1至1×10-7s-1。
某些配体或dAb单体抑制TNFα与TNFR1的结合。例如，一些配体或dAb单体抑制TNFα与TNFR1的结合，其抑制浓度50(IC50)为500nM至50pM、优选100nM至50pM、更优选10nM至100pM、有利的是1nM至100pM；例如50nM以下、优选5nM以下、更优选500pM以下、有利的是200pM以下、最优选100pM以下。优选的TNFR1是人TNFR1。
其它配体和dAb单体不抑制TNFα与TNFR1的结合，但却是拮抗剂，因为它们抑制通过TNFR1介导的信号转导。例如，配体或dAb单体能抑制TNFα诱导的TNFR1成簇，这种成簇是通过TNFR1的信号转导的先决条件。例如，在某些实施方案中，配体或dAb单体能结合TNFR1并抑制TNFR1介导的信号转导，但基本不抑制TNFα与TNFR1的结合。在某些实施方案中，配体或dAb单体抑制TNFα诱导的TNFR1在细胞表面的交联和成簇。这类配体或dAb(例如本文所述的TAR2m-21-23)是有利的，因为它们可拮抗细胞表面TNFR1，但基本不降低内源可溶性TNFR1的抑制活性。例如，在受体结合测定中，配体或dAb可结合TNFR1，但抑制TNFα与TNFR1的结合不超过约10％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％或不超过约1％。另外，在这些实施方案中，在标准细胞测定中，配体或dAb抑制TNFα诱导的TNFR1交联和/或TNFR1介导的信号转导达至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或者至少约99％。这类配体或dAb单体具有一些优势，正如本文所讨论的具有这些特性的拮抗剂。因此，将这类配体或dAb单体给予有需要的哺乳动物，可补充内源调节途径，所述途径在体内抑制TNFα的活性和TNFR1的活性。
如本文所述，配体可以是单价的(例如dAb单体)或多价的(例如双特异性、多特异性)。在具体的实施方案中，配体是能结合TNFR1的dAb单体。相对于其它结合形式(例如单克隆抗体)来说，能结合TNFR1的域抗体单体具有小足迹(small footprint)。因此，这样的dAb单体可选择性阻断TNFR1的某一功能，但不干扰TNFR1的其它功能。例如，能结合TNFR1的dAb单体可拮抗TNFR1(例如抑制TNFR1介导的信号转导)，但不抑制TNFα与TNPR1的结合或TNFR1的脱落。
在更具体的实施方案中，配体是能结合TNFR1并与TAR2m-21-23竞争性结合小鼠TNFR1或与TAR2h-205竞争性结合人TNFR1的dAb单体。
在其它实施方案中，配体是多价的，包含两个或更多个能结合TNFR1的dAb单体。多价配体可含有两个或更多个拷贝的能结合TNFR1的特定dAb，或者含有两个或更多个能结合TNFR1的dAb。例如，配体可以是二聚体、三聚体或多聚体，其包含两个或更多个拷贝的能结合TNFR1的特定dAb，或者两个或更多个能结合TNFR1的不同dAb。在一些实例中，配体是同型二聚体或同型三聚体，它们分别包含两个或三个拷贝的能结合TNFR1的特定dAb。在标准细胞测定中，优选多价配体基本上不激动TNFR1(起到TNFR1激动剂的作用)(即在测定中，当浓度为1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1000μM或5,000μM时，导致不超过约5％的由TNFα(100pg/ml)诱导的TNFR1介导的活性)。
在某些实施方案中，多价配体含有两个或更多个能结合TNFR1所需表位或结构域的dAb，或两个或更多个拷贝的能结合TNFR1所需表位的dAb。该类配体可以高亲合力结合TNFR1，并且比起其它配体形式(例如dAb单体)来说，对于过量表达TNFR1或在其表面高密度表达TNFR1的细胞的结合选择性更高。
在其它具体的实施方案中，多价配体包含两个或更多个能结合TNFR1的dAb，或两个或更多个拷贝的能结合TNFR1的特定dAb。该类多价配体可以低亲和力结合TNFR1单体，但却以高亲合力结合受体多聚体(例如在受体配体复合物中所观察到的三聚体)。因此，可以给予该形式的配体以有效地靶向受体，所述受体已彼此成簇或缔合和/或与TNFR1介导的信号转导所需的配体(例如TNFα)簇集或缔合。
在标准细胞测定(例如本文所述的标准L929或标准HeLa IL-8测定)中，优选配体或dAb单体中和TNFR1(抑制其活性)，其中和剂量50(ND50)为500nM至50pM、优选100nM至50pM、更优选10nM至100pM、有利的是1nM至100pM；例如50nM以下、优选5nM以下、更优选500pM以下、有利的是200pM以下、最优选100pM以下。在其它实施方案中，在标准细胞测定(例如本文所述的标准L929或标准HeLa IL-8测定)中，配体或dAb单体结合TNFR1并拮抗TNFR1的活性，其ND50≤100nM，而在测定中，在浓度≤10μM时，dAb激动TNFR1的活性达≤5％。
在其它实施方案中，配体或dAb单体特异性结合TNFR1(其Kd如本文所述)并且在标准小鼠LPS/D-半乳糖胺诱发的脓毒性休克模型中抑制致死率(即与合适对照相比，其预防致死或减少致死率至少约10％)。在标准小鼠LPS/D-半乳糖胺诱发的脓毒性休克模型中，与合适对照相比，当给予约5mg/kg或更优选约1mg/kg的dAb单体时，优选dAb单体抑制致死率至少约25％或至少约50％。
在具体的实施方案中，在标准细胞测定(例如本文所述的标准L929或标准HeLa IL-8测定)中，配体或dAb单体基本上不激动TNFR1(起到TNFR1激动剂的作用)(即在测定中，当浓度为1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1000μM或5,000μM时，导致不超过约5％的由TNFα(100pg/ml)诱导的TNPR1介导的活性)。
在其它实施方案中，配体包含域抗体(dAb)单体，所述dAb单体与肿瘤坏死因子受体1(TNFR1，p55，CD120a)特异性结合的Kd为300nM至5pM，并且所述dAb单体的氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列或dAb具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或者至少约99％同源性TAR2h-12(SEQ ID NO1)、TAR2h-13(SEQ ID NO2)、TAR2h-14(SEQ IDNO3)、TAR2h-16(SEQ ID NO4)、TAR2h-17(SEQ ID NO5)、TAR2h-18(SEQ ID NO6)、TAR2h-19(SEQ ID NO7)、TAR2h-20(SEQ ID NO8)、TAR2h-21(SEQ ID NO9)、TAR2h-22(SEQ IDNO10)、TAR2h-23(SEQ ID NO11)、TAR2h-24(SEQ ID NO12)、TAR2h-25(SEQ ID NO13)、TAR2h-26(SEQ ID NO14)、TAR2h-27(SEQ ID NO15)、TAR2h-29(SEQ ID NO16)、TAR2h-30(SEQ IDNO17)、TAR2h-32(SEQ ID NO18)、TAR2h-33(SEQ ID NO19)、TAR2h-10-1(SEQ ID NO20)、TAR2h-10-2(SEQ ID NO21)、TAR2h-10-3(SEQ ID NO22)、TAR2h-10-4(SEQ ID NO23)、TAR2h-10-5(SEQ ID NO24)、TAR2h-10-6(SEQ ID NO25)、TAR2h-10-7(SEQ ID NO26)、TAR2h-10-8(SEQ ID NO27)、TAR2h-10-9(SEQ ID NO28)、TAR2h-10-10(SEQ ID NO29)、TAR2h-10-11(SEQ ID NO30)、TAR2h-10-12(SEQ ID NO31)、TAR2h-10-13(SEQ ID NO32)、TAR2h-10-14(SEQ ID NO33)、TAR2h-10-15(SEQ ID NO34)、TAR2h-10-16(SEQ ID NO35)、TAR2h-10-17(SEQ ID NO36)、TAR2h-10-18(SEQ ID NO37)、TAR2h-10-19(SEQ ID NO38)、TAR2h-10-20(SEQ ID NO39)、TAR2h-10-21(SEQ ID NO40)、TAR2h-10-22(SEQ ID NO41)、TAR2h-10-27(SEQ ID NO42)、TAR2h-10-29(SEQ ID NO43)、TAR2h-10-31(SEQ ID NO44)、TAR2h-10-35(SEQ ID NO45)、TAR2h-10-36(SEQ ID NO46)、TAR2h-10-37(SEQ ID NO47)、TAR2h-10-38(SEQ ID NO48)、TAR2h-10-45(SEQ ID NO49)、TAR2h-10-47(SEQ ID NO50)、TAR2h-10-48(SEQ ID NO51)、TAR2h-10-57(SEQ ID NO52)、TAR2h-10-56(SEQ ID NO53)、TAR2h-10-58(SEQ ID NO54)、TAR2h-10-66(SEQ ID NO55)、TAR2h-10-64(SEQ ID NO56)、TAR2h-10-65(SEQ ID NO57)、TAR2h-10-68(SEQ ID NO58)、TAR2h-10-69(SEQ ID NO59)、TAR2h-10-67(SEQ ID NO60)、TAR2h-10-61(SEQ ID NO61)、TAR2h-10-62(SEQ ID NO62)、TAR2h-10-63(SEQ ID NO63)、TAR2h-10-60(SEQ ID NO64)、TAR2h-10-55(SEQ ID NO65)、TAR2h-10-59(SEQ ID NO66)、TAR2h-10-70(SEQ ID NO67)、TAR2h-34(SEQ ID NO68)、TAR2h-35(SEQ ID NO69)、TAR2h-36(SEQ ID NO70)、TAR2h-37(SEQ ID NO71)、TAR2h-38(SEQ IDNO72)、TAR2h-39(SEQ ID NO73)、TAR2h-40(SEQ ID NO74)、TAR2h-41(SEQ ID NO75)、TAR2h-42(SEQ ID NO76)、TAR2h-43(SEQ ID NO77)、TAR2h-44(SEQ ID NO78)、TAR2h-45(SEQ IDNO79)、TAR2h-47(SEQ ID NO80)、TAR2h-48(SEQ ID NO81)、TAR2h-50(SEQ ID NO82)、TAR2h-51(SEQ ID NO83)、TAR2h-66(SEQ ID NO84)、TAR2h-67(SEQ ID NO85)、TAR2h-68(SEQ IDNO86)、TAR2h-70(SEQ ID NO87)、TAR2h-71(SEQ ID NO88)、TAR2h-72(SEQ ID NO89)、TAR2h-73(SEQ ID NO90)、TAR2h-74(SEQ ID NO91)、TAR2h-75(SEQ ID NO92)、TAR2h-76(SEQ IDNO93)、TAR2h-77(SEQ ID NO94)、TAR2h-78(SEQ ID NO95)、TAR2h-79(SEQ ID NO96)、TAR2h-15(SEQ ID NO97)、TAR2h-131-8(SEQ ID NO98)、TAR2h-131-24(SEQ ID NO99)、TAR2h-15-8(SEQ ID NO100)、TAR2h-15-8-1SEQ ID NO101)、TAR2h-15-8-2(SEQ ID NO102)、TAR2h-185-23(SEQ ID NO103)、TAR2h-154-10-5(SEQ ID NO104)、TAR2h-14-2(SEQ ID NO105)、TAR2h-151-8(SEQ ID NO106)、TAR2h-152-7(SEQ ID NO107)、TAR2h-35-4(SEQ ID NO108)、TAR2h-154-7(SEQ ID NO109)、TAR2h-80(SEQ ID NO110)、TAR2h-81(SEQ ID NO111)、TAR2h-82(SEQ ID NO112)、TAR2h-83(SEQ ID NO113)、TAR2h-84(SEQ ID NO114)、TAR2h-85(SEQ ID NO115)、TAR2h-86(SEQ ID NO116)、TAR2h-87(SEQ ID NO117)、TAR2h-88(SEQ ID NO118)、TAR2h-89(SEQ ID NO119)、TAR2h-90(SEQ ID NO120)、TAR2h-91(SEQ ID NO121)、TAR2h-92(SEQ ID NO122)、TAR2h-93(SEQ ID NO123)、TAR2h-94(SEQ ID NO124)、TAR2h-95(SEQ ID NO125)、TAR2h-96(SEQ ID NO126)、TAR2h-97(SEQ ID NO127)、TAR2h-99(SEQ ID NO128)、TAR2h-100(SEQ ID NO129)、TAR2h-101(SEQ ID NO130)、TAR2h-102(SEQ ID NO131)、TAR2h-103(SEQ ID NO132)、TAR2h-104(SEQ ID NO133)、TAR2h-105(SEQ ID NO134)、TAR2h-106(SEQ ID NO135)、TAR2h-107(SEQ ID NO136)、TAR2h-108(SEQ ID NO137)、TAR2h-109(SEQ ID NO138)、TAR2h-110(SEQ ID NO139)、TAR2h-111(SEQ ID NO140)、TAR2h-112(SEQ ID NO141)、TAR2h-113(SEQ ID NO142)、TAR2h-114(SEQ ID NO143)、TAR2h-115(SEQ ID NO144)、TAR2h-116(SEQ ID NO145)、TAR2h-117(SEQ ID NO146)、TAR2h-118(SEQ ID NO147)、TAR2h-119(SEQ ID NO148)、TAR2h-120(SEQ ID NO149)、TAR2h-121(SEQ ID NO150)、TAR2h-122(SEQ ID NO151)、TAR2h-123(SEQ ID NO152)、TAR2h-124(SEQ ID NO153)、TAR2h-125(SEQ ID NO154)、TAR2h-126(SEQ ID NO155)、TAR2h-127(SEQ ID NO156)、TAR2h-128(SEQ ID NO157)、TAR2h-129(SEQ ID NO158)、TAR2h-130(SEQ ID NO159)、TAR2h-131(SEQ ID NO160)、TAR2h-132(SEQ ID NO161)、TAR2h-133(SEQ ID NO162)、TAR2h-151(SEQ ID NO163)、TAR2h-152(SEQ ID NO164)、TAR2h-153(SEQ ID NO165)、TAR2h-154(SEQ ID NO166)、TAR2h-159(SEQ ID NO167)、TAR2h-165(SEQ ID NO168)、TAR2h-166(SEQ ID NO169)、TAR2h-168(SEQ ID NO170)、TAR2h-171(SEQ ID NO171)、TAR2h-172(SEQ ID NO172)、TAR2h-173(SEQ ID NO173)、TAR2h-174(SEQ ID NO174)、TAR2h-176(SEQ ID NO175)、TAR2h-178(SEQ ID NO176)、TAR2h-201(SEQ ID NO177)、TAR2h-202(SEQ ID NO178)、TAR2h-203(SEQ ID NO179)、TAR2h-204(SEQ ID NO180)、TAR2h-185-25(SEQ ID NO181)、TAR2h-154-10(SEQ ID NO182)、TAR2h-205(SEQ ID NO183)、TAR2h-10(SEQ ID NO184)、TAR2h-5(SEQ ID NO185)、TAR2h-5d1(SEQ ID NO186)、TAR2h-5d2(SEQ ID NO187)、TAR2h-5d3(SEQ ID NO188)、TAR2h-5d4(SEQ ID NO189)、TAR2h-5d5(SEQ ID NO190)、TAR2h-5d6(SEQ ID NO191)、TAR2h-5d7(SEQ ID NO192)、TAR2h-5d8(SEQ ID NO193)、TAR2h-5d9(SEQ ID NO194)、TAR2h-5d10(SEQ ID NO195)、TAR2h-5d11(SEQ ID NO196)、TAR2h-5d12(SEQ ID NO197)和TAR2h-5d13(SEQ ID NO198)。
在其它实施方案中，配体包含域抗体(dAb)单体，所述dAb单体与肿瘤坏死因子受体1(TNFR1，p55，CD120a)特异性结合的Kd为300nM至5pM，并且所述dAb单体的氨基酸序列与包括SEQ IDNO216至SEQ ID NO433的任一氨基酸序列的dAb的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或者至少约99％同源性。
在其它实施方案中，配体包含域抗体(dAb)单体，所述dAb单体与肿瘤坏死因子受体1(TNFR1，p55，CD120a)特异性结合的Kd为300nM至5pM，并且所述dAb单体的氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列或dAb具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或者至少约99％同源性TAR2m-14(SEQ IDNO199)、TAR2m-15(SEQ ID NO200)、TAR2m-19(SEQ ID NO201)、TAR2m-20(SEQ ID NO202)、TAR2m-21(SEQ ID NO203)、TAR2m-24(SEQ ID NO204)、TAR2m-21-23(SEQ ID NO205)、TAR2m-21-07(SEQ ID NO206)、TAR2m-21-43(SEQ ID NO207)、TAR2m-21-48(SEQ ID NO208)、TAR2m-21-10(SEQ ID NO209)、TAR2m-21-06(SEQ ID NO210)和TAR2m-21-17(SEQ ID NO211)。
在某些实施方案中，配体包含dAb单体，所述dAb单体能结合TNFR1并与本文所公开的任何dAb竞争性结合TNFR1(例如小鼠TNFR1和/或人TNFR1)。
本发明的配体可包含非免疫球蛋白结合部分，其对TNFR1具有结合特异性并且优选抑制TNFR1的某一功能(例如结合TNFα，在结合TNFα后进行的信号转导)，其中非免疫球蛋白结合部分包含能结合TNFR1的VH、VL或VHH的1、2或3个CDR以及合适的支架。在某些实施方案中，非免疫球蛋白结合部分包含能结合TNFR1的VH、VL或VHH的CDR3(但不含CDR1或CDR2)和合适的支架。在其它实施方案中，非免疫球蛋白结合部分包含能结合TNFR1的VH、VL或VHH的CDR1和CDR2(但不含CDR3)和合适的支架。在其它实施方案中，非免疫球蛋白结合部分包含能结合TNFR1的VH、VL或VHH的CDR1、CDR2和CDR3以及合适的支架。优选这些实施方案中的配体的CDR是本文所述的抗TNFR1 dAb的CDR。优选非免疫球蛋白结合部分包含一种本文所公开的抗TNFR1 dAb的1、2或3个CDR。在其它实施方案中，配体仅包含能结合TNFR1的VH、VL或VHH的CDR3。非免疫球蛋白域可包含与本文所述的抗TNFR1的1、2或3个CDR具有序列同一性的一个或多个区的氨基酸序列。例如，非免疫球蛋白域的氨基酸序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR1、CDR2和/或CDR3具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或者至少约90％序列同一性。甚至更优选非免疫球蛋白结合部分包含TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194的1、2或3个CDR。
本发明也涉及包含具有TNFR1结合特异性结合位点的蛋白质部分的配体，其中所述蛋白质部分的氨基酸序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb(例如TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194)的CDR3的氨基酸序列相同。
在某些实施方案中，配体包含具有TNFR1结合特异性结合位点的蛋白质部分，其中所述蛋白质部分的氨基酸序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的CDR3的氨基酸序列相同，并且也包含与本文所公开的抗TNFR1 dAb(例如TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194)的CDR1和/或CDR2的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
在其它实施方案中，配体包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区，其中能结合IL-4的免疫球蛋白单可变区与本文所公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且具有CDR1序列，其与本文所公开的抗TNFR1 dAb(例如TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194)的CDR1序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区，其中能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且具有CDR2序列，其与本文所公开的抗TNFR1 dAb(例如TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194)的CDR2序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区，其中能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且具有CDR3序列，其与本文所公开的抗TNFR1 dAb(例如TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194)的CDR3序列具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区，其中能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且具有CDR1序列和CDR2序列，所述CDR1序列和CDR2序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb(例如TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194)的CDR1序列和CDR2序列分别具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区，其中能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且具有CDR2序列和CDR3序列，所述CDR2序列和CDR3序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb(例如TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194)的CDR2序列和CDR3序列分别具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区，其中能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且具有CDR1序列和CDR3序列，所述CDR1序列和CDR3序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb(例如TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194)的CDR1序列或CDR3序列分别具有至少50％同一性。
在其它实施方案中，配体包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区，其中能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且具有CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列，所述CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb(例如TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194)的CDR1序列、CDR2序列或CDR3序列分别具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的CDR2序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb(例如TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194)的CDR2序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的CDR3序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb(例如TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194)的CDR3序列具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的CDR1序列和CDR2序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb(例如TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194)的CDR1序列和CDR2序列分别具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的CDR2序列和CDR3序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb(例如TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194)的CDR2序列和CDR3序列分别具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的CDR1序列和CDR3序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb(例如TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194)的CDR1序列和CDR3序列分别具有至少50％同一性。
在另一个实施方案中，本发明是包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列与本文所公开的抗TNFR1 dAb(例如TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194)的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列分别具有至少50％同一性。
在某些实施方案中，配体包含能结合人TNFR1的dAb并且是人TNFR1拮抗剂，其中所述配体对TNFα诱导的炎症或TNFα诱导的炎性介质的抑制剂量[mg/kg]不超过对所述TNFα诱导的炎症或TNFα诱导的炎性介质具有基本相同抑制程度所需的依那西普(ENBREL，英姆纳克斯公司(Immunex Corporation))剂量的1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/25或1/30。例如，配体在以下剂量时可抑制TNFα诱导的组织(例如肺)细胞流入，TNFα诱导的炎性介质(例如早期起作用的嗜中性粒细胞化学引诱物KC和MIP-1以及晚期起作用的趋化因子MCP-1和粘附分子E-选择蛋白)的产生量、浓度或水平提高所述剂量[mg/kg]不超过达到基本相同或相同抑制水平所需的依那西普(ENBREL，英姆纳克斯公司(Immunex Corporation))剂量的1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20、1/25或1/30。优选的抑制水平为至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或者至少约95％。
dAb单体可包含任何合适的免疫球蛋白可变区，优选包含人可变区或包含人构架区的可变区。在某些实施方案中，dAb单体包含本文所述的通用构架。
通用构架可以是VL构架(Vλ或Vκ)，例如包含由人种系DPK1、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK10、DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPK18、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、DPK26或DPK28免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列的构架。如有必要，VL构架还可包含由人种系Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列。
在其它实施方案中，通用构架可以是VH构架，例如包含由人种系DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP38、DP45、DP46、DP47、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68或DP69免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列的构架。如有必要，VH构架还可包含由人种系JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5和JH6免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列。
在具体的实施方案中，dAb单体包含DPK9VL构架或选自DP47、DP45和DP38的VH构架。
在某些实施方案中，dAb单体包含一个或多个构架区，所述架构区的氨基酸序列与人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序列相同，或者一个或多个所述构架区的氨基酸序列共同包含最多5个与人种系抗体基因区段所编码的所述相应构架区的氨基酸序列不同的氨基酸。
在其它实施方案中，dAb单体的FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列与人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序列相同，或者FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列共同包含最多10个与所述人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序列不同的氨基酸。
在其它实施方案中，dAb单体包含FW1、FW2和FW3区，而且所述FW1、FW2和FW3区的氨基酸序列与人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序列相同。
在某些实施方案中，dAb单体不含骆驼科动物免疫球蛋白可变区，或者不含骆驼科动物种系抗体基因区段所编码的免疫球蛋白可变区所特有的一个或多个构架氨基酸。
核酸分子、载体和宿主细胞 本发明也提供分离和/或重组的核酸分子，所述分子编码本文所述的配体。本文所述的“分离的”核酸是指已经从其来源基因组DNA或细胞RNA的核酸(例如存在于细胞中或存在与文库等核酸混合物中的核酸)中分离出来的核酸，并且包括用本文所述的方法或其它合适方法而得到的核酸，包括基本纯化的核酸、通过化学合成而得到的核酸、通过生物学和化学组合方法而得到的核酸以及分离的重组核酸(参见例如Daugherty，B.L.等，Nucleic Acids Res.，19(9)2471-2476(1991)；Lewis，A.P.和J.S.Crowe，Gene，101297-302(1991))。
本文所述的“重组的”核酸是指通过重组DNA方法产生的核酸，包括通过依赖于人工重组方法而产生的核酸，所述方法例如聚合酶链式反应(PCR)和/或用限制酶克隆到载体中。
在某些实施方案中，分离和/或重组的核酸包含编码本文所述配体的核苷酸序列，其中所述配体的氨基酸序列与能结合本文所公开的TNFR1的dAb的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或者至少约99％氨基酸序列同一性。
例如，在某些实施方案中，分离和/或重组的核酸包含编码对TNFR1具有结合特异性的配体的核苷酸序列，其中所述配体的氨基酸序列与选自以下的dAb的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或者至少约99％氨基酸序列同一性TAR2m-15-8(SEQ ID NO216)、TAR2m-15-12(SEQ ID NO217)、TAR2m-15-2(SEQ ID NO218)、TAR2m-15-5(SEQ ID NO219)、TAR2m-15-6(SEQ ID NO220)、TAR2m-15-9(SEQ ID NO221)、Tar2h-131-1(SEQ ID NO222)、Tar2h-131-2(SEQID NO223)、Tar2h-131-3(SEQ ID NO224)、Tar2h-131-4(SEQ IDNO225)、Tar2h-131-5(SEQ ID NO226)、Tar2h-131-6(SEQ IDNO227)、Tar2h-131-7(SEQ ID NO228)、Tar2h-131-8(SEQ IDNO229)、Tar2h-131-9(SEQ ID NO230)、Tar2h-131-10(SEQ IDNO231)、Tar2h-131-11(SEQ ID NO232)、Tar2h-131-12(SEQ IDNO233)、Tar2h-131-13(SEQ ID NO234)、Tar2h-131-14(SEQ IDNO235)、Tar2h-131-15(SEQ ID NO236)、Tar2h-131-16(SEQ IDNO237)、Tar2h-131-17(SEQ ID NO238)、Tar2h-131-18(SEQ IDNO239)、Tar2h-131-19(SEQ ID NO240)、Tar2h-131-20(SEQ IDNO241)、Tar2h-131-21(SEQ ID NO242)、Tar2h-131-22(SEQ IDNO243)、Tar2h-131-23(SEQ ID NO244)、Tar2h-131-24(SEQ IDNO245)、Tar2h-131-25(SEQ ID NO246)、Tar2h-131-26(SEQ IDNO247)、Tar2h131-27(SEQ ID NO248)、Tar2h131-28(SEQ IDNO249)、Tar2h131-29(SEQ ID NO250)、Tar2h131-30(SEQ IDNO251)、Tar2h131-31(SEQ ID NO252)、Tar2h131-32(SEQ IDNO253)、Tar2h131-33(SEQ ID NO254)、Tar2h131-34(SEQ IDNO255)、Tar2h131-35(SEQ ID NO256)、Tar2h131-36(SEQ IDNO257)、Tar2h131-37(SEQ ID NO258)、Tar2h131-38(SEQ IDNO259)、Tar2h131-39(SEQ ID NO260)、Tar2h131-40(SEQ IDNO261)、Tar2h131-41(SEQ ID NO262)、Tar2h131-42(SEQ IDNO263)、Tar2h131-43(SEQ ID NO264)、Tar2h131-44(SEQ IDNO265)、Tar2h131-45(SEQ ID NO266)、Tar2h131-46(SEQ IDNO267)、Tar2h131-47(SEQ ID NO268)、Tar2h131-48(SEQ IDNO269)、Tar2h131-49(SEQ ID NO270)、Tar2h-131-50(SEQ IDNO271)、Tar2h-131-51(SEQ ID NO272)、Tar2h-131-52(SEQ IDNO273)、Tar2h-131-53(SEQ ID NO274)、Tar2h-131-54(SEQ IDNO275)、Tar2h-131-55(SEQ ID NO276)、Tar2h-131-56(SEQ IDNO277)、Tar2h-131-57(SEQ ID NO278)、Tar2h-131-58(SEQ IDNO279)、Tar2h-131-59(SEQ ID NO280)、Tar2h-131-60(SEQ IDNO281)、Tar2h-131-61(SEQ ID NO282)、Tar2h-131-62(SEQ IDNO283)、Tar2h-131-63(SEQ ID NO284)、Tar2h-131-64(SEQ IDNO285)、Tar2h-131-65(SEQ ID NO286)、Tar2h-131-66(SEQ IDNO287)、Tar2h-131-67(SEQ ID NO288)、Tar2h-131-68(SEQ IDNO289)、Tar2h-131-69(SEQ ID NO290)、Tar2h-131-70(SEQ IDNO291)、Tar2h-131-71(SEQ ID NO292)、Tar2h-131-72(SEQ IDNO293)、Tar2h-131-73(SEQ ID NO294)、Tar2h-131-74(SEQ IDNO295)、Tar2h-131-75(SEQ ID NO296)、Tar2h-131-76(SEQ IDNO297)、Tar2h-131-77(SEQ ID NO298)、Tar2h-131-78(SEQ IDNO299)、Tar2h-131-79(SEQ ID NO300)、Tar2h-131-80(SEQ IDNO301)、Tar2h-131-81(SEQ ID NO302)、Tar2h-131-82(SEQ IDNO303)、Tar2h-131-83(SEQ ID NO304)、Tar2h-131-86(SEQ IDNO305)、Tar2h-131-87(SEQ ID NO306)、Tar2h-131-88(SEQ IDNO307)、Tar2h-131-89(SEQ ID NO308)、Tar2h-131-90(SEQ IDNO309)、Tar2h-131-91(SEQ ID NO310)、Tar2h-131-92(SEQ IDNO311)、Tar2h-131-93(SEQ ID NO312)、Tar2h-131-94(SEQ IDNO313)、Tar2h-131-95(SEQ ID NO314)、Tar2h-131-96(SEQ IDNO315)、Tar2h-131-97(SEQ ID NO316)、Tar2h-131-99(SEQ IDNO317)、Tar2h-131-100(SEQ ID NO318)、Tar2h-131-101(SEQ IDNO319)、Tar2h-131-102(SEQ ID NO320)、Tar2h-131-103(SEQ IDNO321)、Tar2h-131-104(SEQ ID 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NO358)、Tar2h-131-190(SEQ IDNO359)、Tar2h-131-191(SEQ ID NO360)、Tar2h-131-192(SEQ IDNO361)、Tar2h-131-193(SEQ ID NO362)、Tar2h-131-194(SEQ IDNO363)、Tar2h-131-195(SEQ ID NO364)、Tar2h-131-196(SEQ IDNO365)、Tar2h-131-197(SEQ ID NO366)、Tar2h-131-198(SEQ IDNO367)、Tar2h-131-500(SEQ ID NO368)、Tar2h-131-501(SEQ IDNO369)、Tar2h-131-502(SEQ ID NO370)、Tar2h-131-503(SEQ IDNO371)、Tar2h-131-504(SEQ ID NO372)、Tar2h-131-505(SEQ IDNO373)、Tar2h-131-506(SEQ ID NO374)、Tar2h-131-507(SEQ IDNO375)、Tar2h-131-508(SEQ ID NO376)、Tar2h-131-509(SEQ IDNO377)、Tar2h-131-510(SEQ ID NO378)、Tar2h-131-511(SEQ IDNO379)、Tar2h-131-512(SEQ ID NO380)、Tar2h-131-513(SEQ IDNO381)、Tar2h-131-514(SEQ ID NO382)、Tar2h-131-515(SEQ IDNO383)、Tar2h-131-516(SEQ ID NO384)、Tar2h-131-517(SEQ IDNO385)、Tar2h-131-518(SEQ ID NO386)、Tar2h-131-519(SEQ IDNO387)、Tar2h-131-520(SEQ ID NO388)、Tar2h-131-521(SEQ IDNO389)、Tar2h-131-522(SEQ ID NO390)、Tar2h-131-523(SEQ IDNO391)、Tar2h-131-524(SEQ ID NO392)、Tar2h-131-525(SEQ IDNO393)、Tar2h-131-526(SEQ ID NO394)、Tar2h-131-527(SEQ IDNO395)、Tar2h-131-528(SEQ ID NO396)、Tar2h-131-529(SEQ IDNO397)、Tar2h-131-530(SEQ ID NO398)、Tar2h-131-531(SEQ IDNO399)、Tar2h-131-532(SEQ ID NO400)、Tar2h-131-533(SEQ IDNO401)、TAR2h-131-534(SEQ ID NO402)、Tar2h-131-535(SEQ IDNO403)、Tar2h-131-536(SEQ ID NO404)、Tar2h-131-537(SEQ IDNO405)、Tar2h-131-538(SEQ ID NO406)、Tar2h-131-539(SEQ IDNO407)、Tar2h-131-539(SEQ ID NO408)、Tar2h-131-539(SEQ IDNO409)、Tar2h-131-540(SEQ ID NO410)、Tar2h-131-541(SEQ IDNO411)、Tar2h-131-542(SEQ ID NO412)、Tar2h-131-543(SEQ IDNO413)、Tar2h-131-544(SEQ ID NO414)、Tar2h-131-545(SEQ IDNO415)、Tar2h-131-546(SEQ ID NO416)、Tar2h-131-547(SEQ IDNO417)、Tar2h-131-548(SEQ ID NO418)、Tar2h-131-549(SEQ IDNO419)、Tar2h-131-550(SEQ ID NO420)、Tar2h-131-551(SEQ IDNO421)、Tar2h-131-552(SEQ ID NO422)、Tar2h-131-553(SEQ IDNO423)、Tar2h-131-554(SEQ ID NO424)、Tar2h-131-555(SEQ IDNO425)、Tar2h-131-556(SEQ ID NO426)、Tar2h-131-557(SEQ IDNO427)、Tar2h-131-558(SEQ ID NO428)、Tar2h-131-559(SEQ IDNO429)、Tar2h-131-560(SEQ ID NO430)、Tar2h-131-561(SEQ IDNO431)、Tar2h-131-562(SEQ ID NO432)和Tar2h-131-563(SEQ IDNO433)。
在其它实施方案中，分离和/或重组的核酸编码本文所述的对TNFR1具有结合特异性的配体，其中所述核酸的核苷酸序列与选自以下的抗TNFR1 dAb的编码核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或者至少约99％核苷酸序列同一性Tar2h-131(SEQ ID NO434)、Tar2h-131-1(SEQ IDNO435)、Tar2h-131-2(SEQ ID NO436)、Tar2h-131-3(SEQ IDNO437、Tar2h-131-4(SEQ ID NO438)、Tar2h-131-5(SEQ IDNO439)、Tar2h-131-6(SEQ ID NO440)、Tar2h-131-7(SEQ IDNO441)、Tar2h-131-8(SEQ ID NO442)、Tar2h-131-9(SEQ IDNO443)、Tar2h-131-10(SEQ ID NO444)、Tar2h-131-11(SEQ IDNO445)、Tar2h-131-12(SEQ ID NO446)、Tar2h-131-13(SEQ IDNO447)、Tar2h-131-14(SEQ ID NO448)、Tar2h-131-15(SEQ IDNO449)、Tar2h-131-16(SEQ ID NO450)、Tar2h-131-17(SEQ IDNO451)、Tar2h-131-18(SEQ ID NO452)、Tar2h-131-19(SEQ IDNO453)、Tar2h-131-20(SEQ ID NO454)、Tar2h-131-21(SEQ IDNO455)、Tar2h-131-22(SEQ ID NO456)、Tar2h-131-23(SEQ IDNO457)、Tar2h-131-24(SEQ ID NO458)、Tar2h-131-25(SEQ IDNO459)、Tar2h-131-26(SEQ ID NO460)、Tar2h131-27(SEQ IDNO461)、Tar2h131-28(SEQ ID NO462)、Tar2h131-29(SEQ IDNO463)、Tar2h131-30(SEQ ID NO464)、Tar2h131-31(SEQ IDNO465)、Tar2h131-32(SEQ ID NO466)、Tar2h131-33(SEQ IDNO467)、Tar2h131-34(SEQ ID NO468)、Tar2h131-35(SEQ IDNO469)、Tar2h131-36(SEQ ID NO470)、Tar2h131-37(SEQ IDNO471)、Tar2h131-38(SEQ ID NO472)、Tar2h131-39(SEQ IDNO473)、Tar2h131-40(SEQ ID NO474)、Tar2h131-41(SEQ IDNO475)、Tar2h131-42(SEQ ID NO476)、Tar2h131-43(SEQ IDNO477)、Tar2h131-44(SEQ ID NO478)、Tar2h131-45(SEQ IDNO479)、Tar2h131-46(SEQ ID NO480)、Tar2h131-47(SEQ IDNO481)、Tar2h131-48(SEQ ID NO482)、Tar2h131-49(SEQ IDNO483)、Tar2h-131-50(SEQ ID NO484)、Tar2h-131-51(SEQ IDNO485)、Tar2h-131-52(SEQ ID NO486)、Tar2h-131-53(SEQ IDNO487)、Tar2h-131-54(SEQ ID NO488)、Tar2h-131-55(SEQ IDNO489)、Tar2h-131-56(SEQ ID NO490)、Tar2h-131-57(SEQ IDNO491)、Tar2h-131-58(SEQ ID NO492)、Tar2h-131-59(SEQ IDNO493)、Tar2h-131-60(SEQ ID NO494)、Tar2h-131-61(SEQ IDNO495)、Tar2h-131-62(SEQ ID NO496)、Tar2h-131-63(SEQ IDNO497)、Tar2h-131-64(SEQ ID NO498)、Tar2h-131-65(SEQ IDNO499)、Tar2h-131-66(SEQ ID NO500)、Tar2h-131-67(SEQ IDNO501)、Tar2h-131-68(SEQ ID NO502)、Tar2h-131-69(SEQ 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ID NO650)。优选核苷酸序列同一性是相对于编码所选抗TNFR1 dAb的核苷酸序列全长进行测定的核苷酸序列同一性。
本发明也提供包含本发明重组核酸分子的载体。在某些实施方案中，载体是包含一个或多个与本发明重组核酸操作性连接的表达控制元件或序列的表达载体。本发明也提供包含本发明的重组核酸分子或载体的重组宿主细胞。合适的载体(例如质粒、噬菌粒)、表达控制元件、宿主细胞和用于制备本发明重组宿主细胞的方法是本领域众所周知的，其实例进一步描述如下。
合适的表达载体可含有多个元件，例如复制起点、选择标记基因、一个或多个表达控制元件(例如转录控制元件(例如启动子、增强子、终止子))和/或一个或多个翻译信号、信号序列或前导序列等。表达控制元件和信号序列(如果有的话)可以由载体或其它来源提供。例如，可以使用编码抗体链的克隆核酸的转录和/或翻译控制序列来指导表达。
可以提供启动子，以便在所需宿主细胞中进行表达。启动子可以是组成型或诱导型的。例如，启动子可以与编码抗体、抗体链或其部分的核酸操作性连接，致使它可以指导核酸转录。可以使用用于原核宿主(例如用于大肠杆菌(E.coli)的lac、tac、T3、T7启动子)和真核宿主(例如猿猴病毒40早期或晚期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复启动子、巨细胞病毒启动子、腺病毒晚期启动子)的各种合适启动子。
另外，表达载体通常包含选择标记，用于选择携带载体以及(就复制表达载体而言)复制起点的宿主细胞。编码赋予抗生素或药物抗性的产物的基因是常用的选择标记，可用于原核生物(例如内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)、四环素抗性的Tet基因)和真核细胞(例如新霉素(G418或遗传霉素(geneticin))、gpt(麦考酚酸)、氨苄青霉素或潮霉素的抗性基因)。二氢叶酸还原酶标记基因允许在各种宿主中用甲氨蝶呤进行选择。在酵母中经常使用编码宿主营养缺陷型标记的基因产物的基因(例如LEU2、URA3、HIS3)作为选择标记。也可使用病毒(例如杆状病毒)或噬菌体载体和能够整合到宿主细胞基因组上的载体(例如逆转录病毒载体)。用于在哺乳动物细胞和原核细胞(大肠杆菌)、昆虫细胞(Drosophila Schnieder S2细胞、Sf9)和酵母(甲醇毕赤酵母(P.methanolica)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae))中表达的合适表达载体是本领域众所周知的。
合适的宿主细胞可以是原核生物，包括细菌细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和/或其它合适细菌；真核细胞，例如真菌细胞或酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、曲霉(Aspergillussp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa))或其它低等真核细胞和高等真核生物细胞，例如昆虫(例如DrosophilaSchnieder S2细胞、Sf9昆虫细胞(WO 94/26087(O’Connor))、哺乳动物(例如COS细胞、例如COS-1(ATCC保藏号CRL-1650)和COS-7(ATCC保藏号CRL-1651)、CHO(例如ATCC保藏号CRL-9096、CHODG44(Urlaub，G.和Chasin，LA.，Proc.Natl.Acac.Sci.USA，77(7)4216-4220(1980)))，293(ATCC保藏号CRL-1573)、HeLa(ATCC保藏号CCL-2)、CV1(ATCC保藏号CCL-70)、WOP(Dailey，L.等，J.Virol.，54739-749(1985)、3T3、293T(Pear，W.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，908392-8396(1993))NS0细胞、SP2/0、HuT 78细胞等，或者植物(例如烟草)。(参见例如Ausubel，F.M.等(编著)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and JohnWiley&Sons Inc.(1993))。在某些实施方案中，宿主细胞是分离的宿主细胞，而不是多细胞生物(例如植物或动物)的一部分。在优选的实施方案中，宿主细胞是非人类宿主细胞。
本发明还提供用于制备本发明配体(例如双特异性配体、多特异性配体)的方法，该方法包括将含有本发明重组核酸的重组宿主细胞在适于表达本发明重组核酸的条件下进行培养，由此表达重组核酸并产生配体。在某些实施方案中，该方法还包括分离出配体。
配体形式 配体和dAb单体可以精制成为单特异性或多特异性抗体或抗体片段或者单特异性或多特异性非抗体结构。合适的形式包括任何合适的多肽结构，其中抗体可变区或其一个或多个CDR可以结合起来，以便在结构上赋予对抗原的结合特异性。各种合适的抗体形式是本领域已知的，例如IgG样形式、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同型二聚体和异型二聚体、任何前述抗原结合片段(例如Fv片段(例如单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)、单可变区(例如VH、VL、VHH)、dAb和任何前述的修饰形式(例如通过共价连接聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其它合适的聚合物)而修饰)。参见PCT/GB03/002804(2003年6月30日申请，指定国为美国，公布号为WO 2004/081026)有关单可变区和dAb的PEG化、其合适的制备方法、PEG化单可变区和dAb单体和多聚体的延长的体内半衰期、合适的PEG、优选的流体动力学尺寸的PEG和优选的流体动力学尺寸的PEG化单可变区和dAb单体和多聚体。PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)的全部公开内容，包括上面提及的部分，全都通过引用结合到本文中。
配体可以精制成所需dAb单体的二聚体、三聚体或多聚体，例如使用合适接头，例如(Gly4Ser)n，其中n＝1-8，例如2、3、4、5、6或7。如有必要，配体(包括dAb单体、二聚体和三聚体)可以与抗体Fc区(包含CH2区和CH3区中的一个或两者都包含)和任选铰链区连接。例如，将编码配体的载体与Fc区连接成为一个核苷酸序列，用于制备所述多肽。
配体和dAb单体也可以结合到和/或精制到非抗体多配体结构中，形成多价复合物，其可结合具有相同抗原的靶分子，因而提供优越亲合力。例如天然细菌受体(例如SpA)已经用作移植CDR的支架，以产生能特异性结合一个或多个表位的配体。该方法的细节参见US5,831,012。其它合适的支架包括基于纤连蛋白和亲和体的支架。合适方法的细节参见WO 98/58965。其它合适的支架包括脂质运载蛋白和CTLA4(参见van den Beuken等，J.Mol.Biol.310，591-601(2001))以及例如描述于WO00/69907(Medical Research Council)的支架，所述支架是基于例如细菌GroEL的环状结构或其它多肽陪伴分子。蛋白质支架可以进行组合；例如，CDR可以移植到CTLA4支架上并且与免疫球蛋白VH区或VL区一起使用，以构成配体。同样，纤连蛋白、脂质运载蛋白和其它支架也可以进行组合。
制备任何所需形式的各种合适方法是本领域已知的，例如可以通过表达合适的表达构建体和/或培养合适细胞(例如杂交瘤、异源杂交瘤、含有编码所述形式的重组构建体的重组宿主细胞)，来制备抗体链和形式(IgG样形式、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同型二聚体和异型二聚体)。此外，可以通过表达合适的表达构建体或通过抗体的酶促消化(例如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)，制备抗体或抗体链的抗原结合片段(例如Fv片段(例如单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)等形式。
配体可以精制成为双特异性配体或多特异性配体，例如按照WO03/002609所述，该文献所公开的内容通过引用全部结合到本文中。双特异性配体包含具有不同结合特异性的免疫球蛋白单可变区。这类双特异性配体可包含重链区和轻链区的组合。例如，双特异性配体可包含VH区和VL区，这两区可以连接在一起呈scFv的形式(例如使用合适接头例如Gly4Ser)或精制成双特异性抗体或其抗原结合片段(例如F(ab’)2片段)。双特异性配体并不包括互补VH/VL对，其形成能协同结合抗原或表位的常规两条链的抗体抗原结合位点。而双形式配体包含VH/VL互补对，其中V区具有不同的结合特异性。
另外，如必要时，双特异性配体可包含一个或多个CH区或CL区。如必要时，还可包含铰链区域。这样的各区组合可以例如模拟天然抗体，例如IgG或IgM或其片段，例如Fv、scFv、Fab或F(ab’)2分子。也考虑了其它结构，例如包含VH、VL、CH1和CL区的IgG分子的单臂。优选本发明的双特异性配体仅包含两个可变区，尽管几个这样的配体也能结合在一起成为同一蛋白质，例如两个这样的配体可以结合成IgG或多聚体形式的免疫球蛋白，例如IgM。或者，在另一实施方案中，多个双特异性配体结合形成多聚体。例如，两个不同双特异性配体结合在一起，产生四特异性分子。本领域技术人员可以理解，本发明方法所产生的双特异性配体的轻链可变区和重链可变区，可以在同一多肽链上或者在不同多肽链上。就可变区在不同多肽链上而言，它们可以通过接头、通常是柔性接头(例如多肽链)、化学连接基团而连接，或者通过本领域已知的任何其它方法而连接。
多特异性配体具有不止一个表位结合特异性。通常，多特异性配体包含两个或更多个表位结合域，所述dAb或非抗体蛋白结构域包含表位的结合位点，例如亲和体、SpA区、LDL受体A类区、EGF区、高亲和性多聚体(avimer)。多特异性配体可按本文所述进一步精制。
在某些实施方案中，配体是IgG样形式。这类形式具有常规IgG分子的4条链结构(2条重链和2条轻链)，其中一个或多个可变区(VH和/或VL)已经被具有所需特异性的dAb即单可变区置换。优选各可变区(2个VH区和2个VL区)被dAb即单可变区置换。包括在IgG样形式中的dAb即单可变区可具有相同特异性或不同特异性。在某些实施方案中，IgG样形式是四价的，并且可具有1、2、3或4种特异性。例如，IgG样形式可以是单特异性的，并且包含4个具有相同特异性的dAb；可以是双特异性的，并且包含3个具有相同特异性的dAb和另一具有不同特异性的dAb；可以是双特异性的，并且包含2个具有相同特异性的dAb和两个具有共同、却不同特异性的dAb；可以是三特异性的，并且包含具有相同特异性的第一和第二dAb，具有不同特异性的第三dAb，具有不同于第一、第二和第三dAb的特异性的第四dAb；或者可以是四特异性的，并且包含4个各自具有不同特异性的dAb。可以制备IgG样形式的抗原结合片段(例如Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv、scFy)。优选IgG样形式或其抗原结合片段不交联TNFR1。
延长半衰期的形式 可以精制TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb单体、二聚体或多聚体、双特异性形式、多特异性形式)以延长其体内血清半衰期。延长体内半衰期可用于免疫球蛋白(尤其是抗体、最尤其是小尺寸的抗体片段，例如dAb)的体内应用。这样的片段(Fv、二硫键连接的Fv、Fab、scFv、dAb)被快速地从体内清除掉，这极大地限制了临床应用。
可将TNFR1拮抗剂精制成为具有较大流体动力学尺寸，例如通过连接聚亚烷基二醇基团(例如聚乙二醇(PEG)基团)、血清白蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或者至少其转铁蛋白结合部分、抗体Fc区，或者通过与抗体区缀合。在某些实施方案中，将拮抗剂(例如配体、dAb单体)PEG化。优选PEG化拮抗剂(例如配体、dAb单体)与非PEG化的同样配体对TNFR1都具有基本相同的亲和力。例如，配体可以是PEG化dAb单体，其中PEG化dAb单体与未PEG化形式dAb对TNFR1的结合亲和力差异不超过约1000倍、优选不超过约100倍，更优选不超过约10倍，或者前者的亲和力相对于未PEG化形式的亲和力来说基本不变。
可将小拮抗剂(例如dAb单体)精制成为抗体的较大抗原结合片段或/和抗体(例如精制成为Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、IgG、scFv)。也可通过将拮抗剂与本文所述的结合域(例如抗体或抗体片段)缀合或连接，而增加拮抗剂(例如配体、dAb单体)的流体动力学尺寸及其血清半衰期，所述结合域能结合能增加体内半衰期的抗原或表位。例如，拮抗剂(例如配体、dAb单体)可以与抗血清白蛋白或抗新生动物Fc受体抗体或抗体片段(例如抗SA或抗新生动物Fc受体dAb、Fab、Fab’或scFv)或与抗SA亲和体或抗新生动物Fc受体亲和体缀合或连接。
用于本发明的TNFR1结合配体的合适白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变异体的实例参见WO 2005/077042A2，所述文献通过引用全部结合到本文中。具体地讲，下面的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变异体可用于本发明 ·SEQ ID NO1(公开于WO 2005/077042A2，该序列通过引用明确地结合到本说明书中) ·白蛋白片段或变异体，其包含WO 2005/077042A2中SEQ IDNO1的氨基酸1-387或由其组成； ·白蛋白或其片段或变异体，其包含选自以下的氨基酸序列 (a)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸54-61； (b)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸76-89； (c)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸92-100； (d)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸170-176； (e)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸247-252； (f)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸266-277； (g)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸280-288； (h)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸362-368； (i)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸439-447； (j)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸462-475； (k)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸478-486；和 (l)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸560-566。
用于本发明的TNFR1结合配体的合适白蛋白、其片段和变异体的其它实例参见WO 03/076567A2，所述文献通过引用全部结合到本文中。具体地讲，下面的白蛋白、片段或变异体可用于本发明 ·人血清白蛋白，参见WO 03/076567A2，例如在图3中(该序列信息通过引用明确地结合到本说明书中)； ·人血清白蛋白(HA)，它由585个氨基酸的单一非糖基化多肽链组成，分子量为66,500(参见Meloun等，FEBS Letters 58136(1975)；Behrens等，Fed.Proc.34591(1975)；Lawn等，NucleicAcids Research 96102-6114(1981)；Minghetti等，J.Biol.Chem.2616747(1986))； ·白蛋白多态变异体或其类似物或片段，参见Weitkamp等，Ann.Hum.Genet.37219(1973)； ·白蛋白片段或变异体，参见EP 322094，例如HA(1-373)、HA(1-388)、HA(1-389)、HA(1-369)和HA(1-419)以及1-369和1-419间的片段； ·白蛋白片段或变异体，参见EP 399666，例如HA(1-177)和HA(1-200)和HA(1-X)之间的片段，其中X为178-199间的任意数字。
当一个或多个延长半衰期的部分(例如白蛋白、转铁蛋白及其片段和类似物)用于本发明的TNFR1结合配体时，可以用任何合适方法将其缀合，例如通过与TNFR1结合部分(例如抗TNFR1 dAb或抗体片段)直接融合，例如通过使用编码融合蛋白的单个核苷酸构建体，其中融合蛋白编码成为单一多肽链，具有延长半衰期的部分(位于TNFR1结合部分的N端或C端)。或者，可以通过使用各部分间的肽接头(例如WO 03/076567A2或WO 2004/003019所述的肽接头(这些接头的全部公开内容通过引用结合到本说明书中，以提供用于本发明的实例))，来完成缀合反应。
通常，能延长体内血清半衰期的多肽是这样的多肽其在体内天然存在，能抵抗通过内源机制所致的降解或清除，所述机制能够从生物体(例如人体)内除去不想要的物质。例如，可从以下蛋白质中选出延长体内血清半衰期的多肽来自胞外基质的蛋白质，血液中的蛋白质，血脑屏障或神经组织中的蛋白质，局限于肾、肝、肺、心、皮肤或骨骼中的蛋白质，应激蛋白、疾病特异性蛋白或参与Fc转运的蛋白质。
能延长体内血清半衰期的合适多肽包括例如转铁蛋白受体特异性配体-神经药物(neuropharmaceutical agent)融合蛋白(参见美国专利号5,977,307，其公开内容通过引用结合到本文中)、脑毛细血管内皮细胞受体、转铁蛋白、转铁蛋白受体(例如可溶性转铁蛋白受体)、胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGF 1)受体、胰岛素样生长因子2(IGF 2)受体、胰岛素受体、凝血因子X、α1-抗胰蛋白酶和HNF 1α。能延长血清半衰期的合适多肽还包括α-1糖蛋白(血清类粘蛋白(orosomucoid)；AAG)、α-1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、α-1微球蛋白(蛋白HC；AIM)、抗凝血酶III(AT III)、载脂蛋白A-1(Apo A-1)、载脂蛋白B(Apo B)、血浆铜蓝蛋白(Cp)、补体成分C3(C3)、补体成分C4(C4)、C1酯酶抑制剂(C1 INH)、C-反应蛋白(CRP)、铁蛋白(FER)、血红素结合蛋白(HPX)、脂蛋白(a)[Lp(a)]、甘露糖结合蛋白(MBP)、肌红蛋白(Myo)、前白蛋白(运甲状腺素蛋白(transthyretin))(PAL)、视黄醇结合蛋白(RBP)和类风湿因子(RF)。
来自胞外基质的合适蛋白质包括例如胶原蛋白、层粘连蛋白、整联蛋白和纤连蛋白。胶原蛋白是胞外基质的主要蛋白质。目前已经知道约15种胶原蛋白分子，在身体的不同部位发现，例如I型胶原蛋白(占身体总胶原蛋白的90％)在骨、皮肤、腱、韧带、角膜、内脏中发现，而II型胶原蛋白在软骨、椎间盘(invertebral disc)、脊索、眼睛的玻璃体中发现。
来自血液的合适蛋白质包括例如血浆蛋白(例如血纤蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、血纤蛋白原(例如血纤蛋白原A、血纤蛋白原B)、血清淀粉样蛋白A、触珠蛋白、抑制蛋白、泛蛋白、子宫球蛋白和α-2-微球蛋白)；酶和酶抑制剂(例如血纤蛋白溶解酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂)；免疫系统蛋白质，例如免疫球蛋白(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白轻链(κ/λ))；转运蛋白(例如视黄醇结合蛋白、α-1微球蛋白)；防卫素(例如β-防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素2和嗜中性粒细胞防卫素3)等。
血脑屏障或神经组织中发现的合适蛋白质包括例如黑皮质素受体、髓磷脂、抗坏血酸转运蛋白等。
能延长体内血清半衰期的合适多肽还包括局限于肾脏中的蛋白质(例如多囊蛋白、IV型胶原蛋白、有机阴离子转运蛋白K1、Heymann抗原)、局限于肝脏中的蛋白质(例如醇脱氢酶、G250)、局限于肺部的蛋白质(例如分泌成分，其可结合IgA)、局限于心脏中的蛋白质(例如HSP 27，其与扩张型心肌病相关)、局限于皮肤的蛋白质(例如角蛋白)、骨特异性蛋白(例如骨形态发生蛋白(BMP)，它们是表现出成骨活性(osteogenic activity)的转化生长因子β超家族亚类(例如BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8))、肿瘤特异性蛋白(例如滋养层抗原、herceptin受体、雌激素受体、组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B，其在肝和脾中发现))。
合适的疾病特异性蛋白包括例如仅在活化T细胞上表达的抗原，包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)、护骨蛋白(osteoprotegerin)配体(OPGL；参见Nature 402，304-309(1999))、OX40(TNF受体家族成员，在活化T细胞上表达并在人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)产生细胞中被特异性上调；参见Immunol.165(1)263-70(2000))。合适的疾病特异性蛋白质还包括例如金属蛋白酶(与关节炎/癌症有关)，包括CG6512果蝇(Drosophila)、人截瘫蛋白、人FtsH、人AFG3L2、鼠ftsH；以及血管生成生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、血管内皮生长因子/血管通透因子(VEGF/VPF)、转化生长因子-α(TGFα)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管生成素、白介素-3(IL-3)、白介素-8(IL-8)、血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(PlGF)、中期因子(midkine)血小板衍生生长因子-BB(PDGF)和CXXXC趋化因子(fractalkine)。
能延长体内血清半衰期的合适多肽还包括应激蛋白，例如热激蛋白(HSP)。HSP通常在胞内发现。当在胞外发现它们时，就表明细胞已经死亡并溢出其内容物。这样的非程序性细胞死亡(坏死)仅当作为创伤、疾病或损伤、胞外HSP触发免疫系统反应的结果时才发生。与胞外HSP的结合可使本发明组合物局限于疾病部位。
参与Fc转运的合适蛋白质包括例如Brambell受体(也称为FcRB)。该Fc受体具有两个功能，这两者可潜在用于递送。其功能是(1)跨越胎盘将IgG从母亲转运给孩子，(2)保护IgG免遭降解，因而延长其血清半衰期。认为受体从核内体中再循环IgG。(参见Holliger等，Nat Biotechnol 15(7)632-6(1997))。
药代动力学分析方法和配体半衰期的测定方法是本领域技术人员熟知的。有关细节可参见Kenneth，A等，Chemical Stability ofPharmaceuticalsA Handbook for Pharmacists和载于Peters等，Pharmacokinetc analysisA Practical Approach(1996)。参考文献也可参见“Pharmacokinetics”，M Gibaldi&D Perron，Marcel Dekker出版，2ndRev.ex edition(1982)，该文献介绍了药代动力学参数，例如tα和tβ半衰期和曲线下面积(AUC)。
基于免疫球蛋白的配体的制备 本文所述的本发明的结合剂、拮抗剂、配体、dAb，都可按照用于抗体工程领域关于制备scFv、“噬菌体”抗体和其它工程抗体分子的先前建立的技术来制备。抗体的制备技术例如参见以下综述及其中所引用的参考文献Winter&Milstein，(1991)Nature 349293-299；Pluckthun(1992)Immunological Reviews 130151-188；Wright等，(1992)Crti.Rev.Immunol.12125-168；Holliger，P.&Winter，G.(1993)Curr.Op.Biotechn.4，446-449；Carter等(1995)J.Hematother.4，463-470；Chester，K.A.&Hawkins，R.E.(1995)Trends Biotechn.13，294-300；Hoogenboom，H.R.(1997)Nature Biotechnol.15，125-126；Fearon，D.(1997)Nature Biotechnol.15，618-619；Plückthun，A.&Pack，P.(1997)Immunotechnology 3，83-105；Carter，P.&Merchant，A.M.(1997)Curr.Opin.Biotechnol.8，449-454；Holliger，P.&Winter，G.(1997)CancerImmunol.Immunother.45，128-130。
对具有所需特异性的抗体可变区选择所用的合适技术采用的是本领域已知的文库和选择方法。采用从人B细胞收获的重排V基因的天然文库(Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222581；Vaughan等(1996)Nature Biotech.，14309)是本领域技术人员众所周知的。合成文库(Hoogenboom和Winter(1992)J.Mol.Biol.，227381；Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，894457；Nissim等(1994)EMBO J.，13692；Griffiths等(1994)EMBO J.，133245；De Kruif等(1995)J.Mol.Biol.，24897)则是通常采用PCR、通过克隆免疫球蛋白V基因而制备的。PCR过程中出现的错误可导致高度随机化。可以分别针对靶抗原或表位选择VH和/或VL文库，在这种情况下，直接选择或一起选择单域结合。
文库载体系统 各种选择系统是本领域已知的，均适用于本发明。这些系统的实例如下所述。
可以直接筛选噬菌体λ表达系统的噬菌斑或溶原体的菌落，这两者先前都有描述(Huse等(1989)Science，2461275；Caton和Koprowski(1990)Proc.Natl..Acad.Sci.U.S.A.，87；Mullinax等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，878095；Persson等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，882432)并且用于本发明。尽管这样的表达系统可以用于筛选多达106个不同文库成员，但是它们不适合筛选更大数量(大于106个成员)。文库构建中特别有用的是选择展示系统，所述系统使核酸连接到它所表达的多肽上。本文所用的选择展示系统是允许通过文库各个成员结合通用配体和/或靶配体的合适展示方法而选择的系统。
在大文库中分离出所需成员的选择方案是本领域已知的，以噬菌体展示技术为代表。这种将多样化肽序列展示在丝状噬菌体表面的系统(Scott和Smith(1990)Science，249386)，已经证明可用于产生抗体片段(及其编码它们的核苷酸序列)文库，用于结合靶抗原的特异性抗体片段的体外选择和扩增(McCafferty等，WO 92/01047)。编码可变区的核苷酸序列连接到编码前导信号的基因片段上，这样的信号可指导它们到达大肠杆菌细胞的壁膜间隙，结果所得抗体片段可展示在噬菌体表面，通常是与噬菌体外壳蛋白(例如pIII或pVIII)融合。或者，抗体片段向外展示在λ噬菌体衣壳(噬菌体)上。基于噬菌体的展示系统的一个优点就是因为它们是生物系统，所以可以让含有所选文库成员的噬菌体在细菌细胞内进行生长，而简单扩增所选文库成员。此外，因为编码多肽文库成员的核苷酸序列被噬菌体或噬菌粒载体所包含，所以测序、表达和其后的遗传操作相对直接。
噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的构建方法是本领域众所周知的(McCafferty等(1990)Nature，348552；Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，884363；Clackson等(1991)Nature，352624；Lowman等(1991)Biochemistry，3010832；Burton等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，8810134；Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.，194133；Chang等(1991)J.Immunol.，1473610；Breitling等(1991)Gene，104147；Marks等(1991)，出处同上；Barbas等(1992)，出处同上；Hawkins和Winter(1992)J.Immunol.，22867；Marks等，1992，J.Biol.Chem.，26716007；Lerner等(1992)Science，2581313，所述文献通过引用结合到本文中)。
一个特别具有优势的方法一直是使用scFv噬菌体文库(Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，855879-5883；Chaudhary等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，871066-1070；McCafferty等(1990)，出处同上；Clackson等(1991)Nature，352624；Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222581；Chiswell等(1992)Trends Biotech.，1080；Marks等(1992)J.Biol.Chem.，267)。在噬菌体外壳蛋白上展示的scFv文库的各种实施方案已有描述。噬菌体展示方法的改进也是已知的，例如参见WO96/06213和WO92/01047(Medical Research Council等)和WO97/08320(Morphosys)，所述文献通过引用结合到本文中。
产生多肽文库的其它系统包括使用无细胞酶促机器来体外合成文库成员。在一个方法中，通过针对靶配体的多轮选择和PCR扩增来选择RNA分子(Tuerk和Gold(1990)Science，249505；Ellington和Szostak(1990)Nature，346818)。一项类似技术可用于鉴定结合预定人转录因子的DNA序列(Thiesen和Bach(1990)Nucleic Acids Res.，183203；Beaudry和Joyce(1992)Science，257635；WO92/05258和WO92/14843)。以类似方式，体外翻译可用于合成多肽，这作为产生大文库的方法。这些通常包括稳定的多核糖体复合物的方法进一步参见WO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、WO91/02076、WO91/05058和WO92/02536。并非基于噬菌体的替代展示系统例如那些公开于WO95/22625和WO95/11922(Affymax)的系统，采用多核糖体来展示多肽，用于选择。
还有一项技术包括对人工区室中的库的选择，这允许将基因与其基因产物结合起来。例如，通过在油包水乳剂形成的微胶囊中选择编码所需基因产物的核酸的选择系统，参见WO99/02671、WO00/40712；Tawfik和Griffiths(1998)Nature Biotechnol 16(7)，652-6。将编码具有所需活性的基因产物的遗传元件在微胶囊中区室化，然后在微胶囊内转录和/或翻译以产生它们相应的基因产物(RNA或蛋白质)。随后再分选产生具有所需活性的基因产物的遗传元件。该方法通过各种方法检测所需活性而选择目标基因产物。
文库构建 可以采用本领域已知技术，构建例如以上提出的文库用于选择，或者从商业来源购买。可用于本发明的文库参见例如WO99/20749。一旦选择载体系统并将一个或多个编码目标多肽的核酸序列克隆到文库载体中，通过在表达前进行诱变，就可以在克隆分子内产生多样性；或者，可以在如上所述的诱变和多轮选择进行之前，表达并选择所编码的蛋白质。按照标准分子方法，对编码结构优化多肽的核酸序列进行诱变。特别有用的是聚合酶链式反应即PCR(Mullis和Faloona(1987)Methods Enzymol.，155335，所述文献通过引用结合到本文中)。PCR是本领域众所周知的，它是采用由热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶催化的多轮DNA复制，以扩增目标靶序列。各种抗体文库的构建参见Winter等(1994)Ann.Rev.Immunology，12，433-55及其中引用的参考文献。
采用模板DNA(至少1fg；更有用的是1-1000ng)和至少25pmol寡核苷酸引物，进行PCR；当引物库(primer pool)非常不均一时，最好采用较大量引物，因为各序列仅有少量引物库分子作为代表，而且数量在随后的扩增循环中成为限制。通常反应混合物包括2μl DNA、25pmol寡核苷酸引物、2.5μl 10X PCR缓冲液1(Perkin-Elmer，FosterCity，CA)、0.4μl 1.25μM dNTP、0.15μl(或2.5单位)Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer，Foster City，CA)和去离子水加至总体积为25μl。覆盖矿物油，进行PCR，用程序加热循环仪。PCR循环中各步骤的长度和温度以及循环次数，按照结果所需的严格性来调整。退火温度和时间由引物预计与模板退火的效率和可耐受的错配程度而定；显然，当核酸分子同时扩增和诱变的话，错配是必需的，至少在合成的第一轮。优化引物退火条件的严格性的能力是在本领域普通技术人员的知识范围之内。采用的退火温度在30℃和72℃之间。模板分子开始变性通常发生在92℃和99℃之间达4分钟，再是20-40次循环，循环是由变性(94-99℃15秒至1分钟)、退火(按照上述温度；1-2分钟)和延伸(72℃1-5分钟，取决于扩增产物的长度)组成。最终延伸通常72℃4分钟，再接着是不确定(0-24小时)步骤，在4℃。
结合单可变区 本发明所用的结构域，一旦选出就可以通过本领域已知的各种方法连接，包括共价和非共价方法。优选的方法包括采用如上所述的多肽接头，例如连接scFv分子(Bird等(1988)Science 242423-426)。有关合适接头的讨论参见Bird等，Science 242，423-426；Hudson等，Journal Immunol Methods 231(1999)177-189；Hudson等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85，5879-5883。接头优选是柔性的，允许两个单域相互作用。一个接头的实例是(Gly4Ser)n接头，其中n＝1-8，例如2、3、4、5或7。也可采用双链抗体中使用的接头(其柔性较差)(Holliger等(1993)PNAS(USA)906444-6448)。在一个实施方案中，所用的接头不是免疫球蛋白铰链区。
可变区可采用不用接头的方法而结合。例如，可以开发二硫桥的用途(所述二硫桥是通过天然存在的或改造的半胱氨酸残基而提供的)，以便稳定VH-VH、VL-VL或VH-VL二聚体(Reiter等(1994)ProteinEng.，7697-704)或者通过可变区间界面的重构以改善“适合性(fit)”，因而稳定相互作用(Ridgeway等(1996)Protein Eng.7617-621；Zhu等(1997)Protein Science 6781-788)。如果适当的话，可以使用用于连接或稳定免疫球蛋白可变区、尤其是抗体VH区的其它技术。
配体的表征 配体(例如dAb单体、双特异性配体)与其特异性抗原或表位的结合可以用本领域技术人员熟知的方法来测定，该方法包括ELISA。在本发明的一个优选的实施方案中，采用单克隆噬菌体ELISA来测定结合。可以按照任何合适方法，进行噬菌体ELISA示例性方案如下。
可以通过ELISA筛选每轮选择中产生的、与所选抗原或表位结合的噬菌体群体，以鉴定“多克隆”噬菌体抗体。然后可通过ELISA筛选来自单个受感染细菌菌落的这些群体的噬菌体，以鉴定“单克隆”噬菌体抗体。最好也筛选结合抗原或表位的可溶性抗体片段，这也可通过ELISA、采用针对C-端或N-端标记等试剂来进行(参见例如Winter等(1994)Ann.Rev.Immunology 12，433-55及其中引用的参考文献。
可以通过PCR产物的凝胶电泳(Marks等1991，出处同上；Nissim等1994，出处同上)、探测(Tomlinson等，1992)J.Mol.Biol.227，776)或通过载体DNA测序，来评价所选噬菌体单克隆抗体的多样性。
配体的结构 在采用例如本文所述的噬菌体展示技术从V基因库中选出可变区的情况下，这些可变区可包含通用构架区，使得它们可以被本文所述的特异性通用配体所识别。有关通用构架、通用配体等的用途参见WO 99/20749。
当使用V基因库时，多肽序列中的变异优选位于可变区结构环内。各可变区的多肽序列可以通过DNA改组或通过突变而改变，以便增强各可变区与其互补对的相互作用。DNA改组是本领域已知的，参见例如Stemmer，1994，Nature 370389-391和美国专利号6,297,053，所述文献都通过引用结合到本文中。其它诱变方法是本领域技术人员众所周知的。
一般而言，可以按照例如以下标准实验室手册的方法，构建并操作用于选择、制备和精制配体所需的核酸分子和载体构建体Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，USA。
本发明所用的核酸的操作通常在重组载体中进行。
本文所用的载体是指这样的分离的元件所述元件用于将异源DNA引入细胞，用于表达和/或复制异源DNA。所述载体的选择或构建方法以及随后的使用方法是本领域普通技术人员众所周知的。大量载体是公众可得的，包括细菌质粒、噬菌体、人工染色体和附加型载体。这类载体可用于简单克隆和诱变；或者采用基因表达载体。可以选择本发明所用的载体，以适应所需大小的多肽编码序列，长度通常为0.25千碱基对(kb)至40kb或更大。体外克隆操作后，用载体转化合适的宿主细胞。各载体含有不同的功能性组件，通常包括克隆(或“多接头”)位点、复制起点和至少一个选择标记基因。如果给定的载体是表达载体，它还可具有一个或多个以下元件增强子元件、启动子、转录终止和信号序列，每个都位于克隆位点附近，使得它们与编码本发明配体的基因有效连接。
克隆载体和表达载体一般都含有使载体在一种或多种所选宿主细胞中能复制的核酸序列。通常在克隆载体中，该序列使载体独立于宿主染色体DNA而复制，并且还包含复制起点或自主复制序列。这类序列众所周知可用于多种多样的细菌、酵母和病毒。质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(例如SV40、腺病毒)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，复制起点对哺乳动物表达载体而言是不需要的，除非这些起点用于能高水平复制DNA的哺乳动物细胞，例如COS细胞。
最好克隆载体或表达载体可含有选择基因，也称为选择标记。该基因编码转化宿主细胞在选择培养基中存活或生长所必需的蛋白质。因此，没有被含有选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在培养基中存活。典型的选择基因编码这样的蛋白质所述蛋白质赋予抗生素(例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)抗性和其它毒素抗性、补充生长培养基中所没有的营养缺陷或补充关键性营养物。
因为编码本发明配体的载体的复制是在大肠杆菌中最常规进行的，所以采用大肠杆菌选择标记，例如赋予抗生素氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。这些可以得自大肠杆菌质粒，例如pBR322或pUC质粒，例如pUC18或pUC19。
表达载体通常含有宿主生物可识别的启动子，并且该启动子与目标编码序列操作性连接。这样的启动子可以是诱导型或组成型的。术语“操作性连接”是指并置方式使所述组件的关系允许它们以既定方式起作用。控制序列与编码序列“操作性连接”是指连接方式使得在控制序列相容的条件可进行编码序列的表达。
适用于原核宿主的启动子包括例如β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子(例如tac启动子)。用于细菌系统的启动子一般还含有与编码序列操作性连接的SD序列(Shine-Delgarno sequence)。
优选的载体是能表达对应于多肽文库成员的核苷酸序列的表达载体。因此，可以通过表达多肽文库成员的单个克隆的单独增殖和表达或者通过使用任何选择展示系统，用第一和/或第二抗原或表位进行选择。如上所述，优选的选择展示系统是噬菌体展示。因此，可以使用噬菌体或噬菌粒载体，例如pIT1或pIT2。用于本发明的前导序列包括pelB、stII、ompA、phoA、bla和pelA。一个实例是具有大肠杆菌复制起点(用于双链复制)以及噬菌体复制起点(用于产生单链DNA)的噬菌粒载体。这类载体的操作和表达是本领域众所周知的(Hoogenboom和Winter(1992)，出处同上；Nissim等(1994)，出处同上)。简而言之，载体含有β-内酰胺酶基因(以便在噬菌粒上赋予选择性)和表达盒上游的lac启动子，后者由以下部分组成(N端至C端)pelB前导序列(指导表达多肽到壁膜间隙)、多克隆位点(用于克隆核苷酸形式的文库成员)、任选一个或多个肽标记(用于检测)、任选一个或多个TAG终止密码子和噬菌体蛋白pIII。因此，使用大肠杆菌的不同抑制菌株和非抑制菌株，并且添加葡萄糖、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)或辅助噬菌体(例如VCS M13)，载体能够作为质粒进行复制，但却不表达，仅产生大量多肽文库成员或产生噬菌体，它们中的一些在其表面含有至少一个拷贝的多肽-pIII融合体。
编码本发明配体的载体的构建采用常规连接技术。分离的载体或DNA片段被切割、剪裁并重新连接成产生所需载体的理想形式。如有必要，可以用已知方式进行分析，证实所构建的载体中存在正确序列。用于构建表达载体、制备体外转录物、将DNA引入宿主细胞、以及进行评价表达和功能的分析所用的合适方法，是本领域技术人员已知的。通过常规方法，检测样品中存在的基因序列、或其扩增和/或表达量，所述常规方法例如DNA印迹分析或RNA印迹分析、蛋白质印迹、DNA、RNA或蛋白质斑点印迹、原位杂交、免疫细胞化学或者核酸或蛋白质分子的测序分析。如有必要，本领域技术人员会容易地知道如何改进这些方法。
骨架 骨架可以基于免疫球蛋白分子或者可以是如上所述来源的非免疫球蛋白。本文所述的优选免疫球蛋白骨架包括任何一个或多个选自以下的骨架至少包含以下部分的免疫球蛋白分子(i)抗体的CL(κ或λ亚类)区；或(ii)抗体重链的CH1区；包含抗体重链CH1区和CH2区的免疫球蛋白分子；包含抗体重链CH1区、CH2区和CH3区的免疫球蛋白分子；或任何(ii)亚类以及抗体的CL(κ或λ亚类)区。也可以包含铰链区域。这样的各区组合可以是例如模拟天然抗体，例如IgG或IgM或其片段，例如Fv、scFv、Fab或F(ab’)2分子。本领域技术人员知道，该名单并非是详尽而无遗漏的。
蛋白质支架 各表位结合域包含蛋白质支架和一个或多个CDR，它们参与结构域与一个或多个表位的特异性相互作用。最好本发明的表位结合域包含3个CDR。合适的蛋白质支架包括选自以下的任何支架基于免疫球蛋白结构域的支架、基于纤连蛋白的支架、基于亲和体的支架、基于CTLA4的支架、基于陪伴分子例如GroEL的支架、基于脂质运载蛋白的支架和基于细菌Fc受体SpA和SpD的支架。本领域技术人员可以理解，该名单并非是详尽而无遗漏的。
用于构建配体的支架 主链构象的选择 免疫球蛋白超家族成员都共享其多肽链的类似折叠。例如，尽管抗体在其一级序列上具有高度多样性，但是序列比较和晶体结构表明，与预期相反，抗体的6个抗原结合环中有5个(H1、H2、L1、L2、L3)采用数目有限的主链构象或正则结构(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196901；Chothia等(1989)Nature，342877)。因此，对环长度和关键残基进行分析，能够预测在大多数人抗体中存在的H1、H2、L1、L2和L3的主链构象(Chothia等(1992)J.Mol.Biol.，227799；Tomlinson等(1995)EMBO J.，144628；Williams等(1996)J.Mol.Biol.，264220)。尽管H3区在序列、长度和结构上更具多样性(因为使用D区段)，但是它也构成数目有限的短环长度的主链构象，这取决于环及抗体构架的关键位置上特定残基的长度和存在与否，或残基种类(Martin等(1996)J.Mol.Biol.，263800；Shirai等(1996)FEBS Letters，3991)。
可以设计配体和/或结构域文库，其中可以选择出某些环长度和关键残基，以保证各成员的主链构象是已知的。如上所述，最好这些是天然存在的免疫球蛋白超家族分子的真实构象，以将它们是非功能性的机会降至最低。种系V基因区段起到一个合适的基本构架的作用，用于构建抗体或T细胞受体文库；也可使用其它序列。可以低频率发生变异，使得少量功能性成员具有改变的主链构象，这样的改变并不影响其功能。
正则结构理论也用于评价配体所编码的不同主链构象的数目，以预测基于配体序列的主链构象并选择用于多样化的残基，同时又不影响正则结构。已经知道，在人Vκ区中，L1环可采用4种正则结构之一，L2环具有一种正则结构，而且90％的人Vκ区的L3环采用4或5种正则结构之一(Tomlinson等(1995)，出处同上)；因此，仅在Vκ区，不同正则结构可组合产生大量的不同主链构象。假定Vλ区为L1、L2和L3环编码各种不同正则结构，Vκ区和Vλ区可与任何VH区(其可为H1和H2环编码几种正则结构)配对，则这5个环所观察到的正则结构的组合数量将会非常庞大。这表明主链构象多样性的产生对产生各种结合特异性来说是必不可少的。然而，通过构建基于一种已知主链构象的抗体文库，已经发现，与预期相反，主链构象的多样性并非产生足够的针对几乎所有抗原的多样性所必需的。甚至更令人吃惊的是，一种主链构象不一定是共有结构-一种天然存在的构象可以用作整个文库的基础。因此，在优选的方面，本发明的双特异性配体具有一种已知主链构象。
所选的一种主链构象优选在所述免疫球蛋白超家族类型的分子中是常见的。当观察到大量天然存在的分子采用该构象时，该构象是常见的。因此，在本发明的优选方面，单独考虑免疫球蛋白结构域的各结合环的不同主链构象的天然发生率，然后选择具有不同环的主链构象所需组合的天然存在的可变区。如果没有可用的，就可选择最接近的等同物。优选不同环的主链构象的所需组合是由所选种系基因区段(其编码所需主链构象)产生的。更优选所选种系基因区段在自然界频繁表达，最优选它们在所有天然种系基因区段中是最频繁表达的。
在设计配体(例如dAb)或其文库过程中，可以单独考虑6个抗原结合环中每一个的不同主链构象的发生率。对于H1、H2、L1、L2和L3，选择被20％和100％的天然分子抗原结合环所采用的给定构象。通常，所观察到的它的发生率35％以上(即介于35％和100％之间)、更理想的是50％以上或甚至65％以上。因为绝大多数H3环没有正则结构，所以优先选择在可展示正则结构的环中常见的主链构象。因此，对于每个环来说，选择天然库中最常见的构象。在人抗体中，各环最常见的正则结构(CS)如下H1-CS 1(79％表达库)、H2-CS 3(46％)、Vκ的L1-CS 2(39％)、L2-CS 1(100％)、Vκ的L3-CS 1(36％)(计算假定κ∶λ的比例为70∶30，Hood等(1967)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，48133)。对于具有正则结构的H3环而言，具有从残基94到残基101的盐桥的7个残基的CDR3长度(Kabat等(1991)Sequences ofProteins of immunological interest，美国健康和人类服务部)看来是最常见的。EMBL数据文库中有至少16个人类抗体序列具有所需H3长度和关键残基，构成该构象，并且在蛋白质数据库中至少有两个晶体结构可用作抗体建模的基础(2cgr和1tet)。最常表达的种系基因区段的正则结构组合是VH区段3-23(DP-47)、JH区段JH4b、Vκ区段O2/O12(DPK9)和Jκ区段Jκ1。VH区段DP45和DP38也是合适的。因此，这些区段可用于组合，作为构建具有所需单一主链构象的文库的基础。
或者，并非根据分离的各结合环的不同主链构象的天然发生率来选择单一主链构象，而是采用主链构象组合的天然发生率作为选择单一主链构象的基础。就抗体而言，例如，可以确定任何2、3、4、5或所有6个抗原结合环的正则结构组合的天然发生率。在此，优选所选构象在天然存在的抗体中是常见的，最优选它是天然库中所观察到的最常见的。因此，在人抗体中，例如当考虑H1、H2、L1、L2和L3五个抗原结合环的天然组合时，确定最常见的正则结构的组合，然后结合最常见的H3环构象，作为选择单一主链构象的基础。
正则序列的多样化 如果具有所选几种已知的主链构象、或者优选单一已知主链构象，可以通过改变分子的结合位点，构建本发明所用的配体(例如dAb)或文库，以便产生具有结构和/或功能性多样性的库。这表明产生了变异体，使得它们在其结构和/或功能上具有足够的多样性，使得它们能够提供各种活性。
所需多样性通常是通过在一个或多个位置上改变所选分子而产生的。可以随机或优选选择所要改变的位置。然后，可以通过以下方式达到变异通过随机化(其间残余氨基酸被任何氨基酸或其类似物(天然或合成的)所取代)，产生非常大数量的变异体；或者通过用一个或多个氨基酸的限定亚类来取代残余氨基酸，产生数目更有限的变异体。
已经报道了各种方法，用于引入这样的多样性。易错PCR(Hawkins等(1992)J.Mol.Biol.，226889)、化学诱变(Deng等(1994)J.Biol.Chem.，2699533)或细菌突变菌株(Low等(1996)J.Mol.Biol.，260359)可用于将随机突变引入编码分子的基因内。使所选位置发生突变的方法也是本领域众所周知的，它包括使用错配寡核苷酸或简并寡核苷酸，使用或不使用PCR。例如，通过抗原结合环的定向突变，已经产生了一些合成抗体文库。使人破伤风类毒素结合Fab的H3区随机化，以便产生各种新的结合特异性(Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，894457)。随机或半随机H3和L3区已经附加到种系V基因区段上，产生具有未突变构架区的大文库(Hoogenboom和Winter(1992)J.Mol.Biol.，227381；Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，894457；Nissim等(1994)EMBO J.，13692；Griffiths等(1994)EMBO J.，133245；De Kruif等(1995)J.Mol.Biol.，24897)。这样的多样化可以延伸至包括某些或所有其它抗原结合环(Crameri等(1996)Nature Med.，2100；Riechmann等(1995)Bio/Technology，13475；Morphosys，WO97/08320，出处同上)。
因为环随机化仅对H3就具有产生约超过1015种结构的潜力，而对其它5个环也具有产生类似的大数量变异体的潜力，所以不能通过使用现有的转化技术或者甚至使用无细胞系统来产生代表所有可能组合的文库。例如，在迄今为止所构建的最大文库之一中，产生了6×1010个不同抗体，这仅仅是该设计文库的潜在多样性的一部分(Griffiths等(1994)，出处同上)。
优选只有直接参与产生或修饰分子所需功能的残基，才被多样化。对于许多分子而言，功能是要结合靶标的，因此，多样性应该集中在靶结合位点中，而避免改变那些对分子总体包装或保持所选主链构象来说必不可少的残基。
正则序列的多样化，当它用于抗体区时 就基于抗体的配体(例如dAb)而言，靶结合位点是最常见的抗原结合位点。因此，优选只有在抗原结合位点的残基才被改变。在人抗体库中，这些残基极端多样性，已知让其接触高分辨率抗体/抗原复合物。例如，在L2中，已知位置50和53在天然存在的抗体中是不同的，并且观察到它们与抗原接触。相比之下，常规方法已经改变了相应互补决定区(CDR1)中的所有残基(定义参见Kabat等，1991，出处同上)，本发明所用的文库中多样化的两个相比的某七个残基。这显示了产生各种抗原结合特异性所需的功能多样性的显著改善。
在自然界，抗体多样性是两个过程的结果种系V、D和J基因区段的体细胞重组，产生幼稚的(naive)初级库(所谓的种系和连接多样性)；以及所得重排V基因的体细胞高变。对人类抗体序列进行分析表明，初级库中的多样性集中在抗原结合位点的中心，而体细胞高变则将多样性扩散到抗原结合位点周围区，而这些区在初级库中是高度保守的(参见Tomlinson等(1996)J.Mol.Biol.，256813)。这一互补性可能逐渐成为检索序列空间的有效策略，而且，尽管显然是抗体所特有的，但是它也可容易地用于其它多肽库。改变的残基是构成靶的结合位点中残基的亚类。如有必要，在选择期间的不同时期，可以改变靶结合位点中残基的不同(包括重叠)亚类。
就抗体库而言，可以产生起始“幼稚”库(“naive”repertoire)，其中改变抗原结合位点的某些、而不是全部的残基。在这种情况下，本文所用的术语“幼稚”是指没有预定靶标的抗体分子。这些分子类似于没有经历免疫多样化的个体(例如在胎儿和新生儿个体的情况下)的免疫球蛋白基因所编码的那些分子，所述个体的免疫系统尚未受到各种抗原性刺激的攻击。然后，针对各种抗原或表位来选择该库。如有必要，还可在起始库改变的结构域之外引入更多多样性。可以选择具有修饰功能、特异性或亲和力的这种成熟的库。
用于构建配体的结合域幼稚库(其中抗原结合位点的某些或全部残基被改变)是本领域已知的。(参见WO 2004/058821、WO2004/003019和WO 03/002609)。“初级”文库模拟天然初级库，其多样性局限于抗原结合位点中心的残基，它们在种系V基因区段中具有多样性(种系多样性)，或者在重组过程中被赋予多样性(连接多样性)。这些多样化的残基包括但不限于H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、L94和L96。在“体细胞”文库中，多样性局限于重组过程中改变的残基(连接多样性)或者是高度体细胞突变的)。这些多样化的残基包括但不限于H31、H33、H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34和L96。已知让适合于这些文库多样性的以上列出的所有残基接触一个或多个抗体-抗原复合物。因为在这两种文库中，抗原结合位点中并非所有残基都改变，在选择中，通过改变剩余残基而结合另外的多样性，如果需要这样的话。本领域技术人员显而易见的是，任何这些残基(或者包括抗原结合位点的其它残基)的任何亚类都可以用于抗原结合位点的起始和/或后来的多样化。
在用于本发明的文库构建中，所选位置的多样化通常是在核酸水平上进行，即通过改变指定多肽序列的编码序列，使得许多可能的氨基酸(所有20种或其亚类)可以结合在该位置。采用IUPAC命名法，最通用的密码子是NNK，它编码所有氨基酸以及TAG终止密码子。NNK密码子优选用于引入所需多样性。也可以使用达到相同末端的其它密码子，包括NNN密码子，该密码子导致产生额外的终止密码子TGA和TAA。
人抗体抗原结合位点中侧链多样性的特征明显对某些氨基酸残基有偏倚。如果统计每个VH、Vκ和Vλ区中的10个最多变的位置的氨基酸组成的话，超过76％的侧链多样性来自仅7个不同残基，它们是丝氨酸(24％)、酪氨酸(14％)、天冬酰胺(11％)、甘氨酸(9％)、丙氨酸(7％)、天冬氨酸(6％)和苏氨酸(6％)。这种倾向于可提供主链柔性的亲水性残基和小残基的偏倚，可能反映了表面进化，该进化倾向于结合各种抗原或表位，并且有助于解释初级库中抗体的所需混杂。
因为优选模拟这样的氨基酸分布，所以在有待改变位置上的氨基酸分布优选模拟在抗体的抗原结合位点所见到的那些。这种允许针对各种靶抗原来选择某些多肽(不仅是抗体多肽)的氨基酸取代中的偏倚，易于用于任何多肽库。有各种方法，用于在有待改变的位置上使氨基酸分布发生偏倚(包括使用三核苷酸诱变，参见WO97/08320)，其中优选的方法，由于容易合成，是采用常规简并密码子。通过比较由简并密码子所有组合所编码的氨基酸分布型(在各位置上具有等比例的单、双、三和四重简并性)与天然氨基酸的使用，可以计算出最具代表性的密码子。密码子(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)C和(AGT)(AGC)(CT)，也就是说，分别用IUPAC命名法命名的DVT、DVC和DVY——就是最接近所需氨基酸分布型的密码子它们编码22％丝氨酸和11％酪氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸。因此，优选的文库是在各多样化位置上用DVT、DVC或DVY密码子构建的。
受体结合测定 在合适受体结合测定中，可以鉴定能抑制TNFα与TNFR1结合的TNFR1拮抗剂。简而言之，将Maxisorp板与30mg/ml抗人Fc小鼠单克隆抗体(Zymed，San Francisco，USA)一起孵育过夜。各孔用含0.05％吐温-20的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，再用1％BSA/PBS封闭，然后与100ng/ml TNFR1-Fc融合蛋白(R&D Systems，Minneapolis，USA)一起孵育。TNFR1拮抗剂与加入到洗涤过的各孔中终浓度为10ng/ml的TNF混合。TNF结合的检测如下用0.2mg/ml生物素化抗TNF抗体(HyCult biotechnology，Uben，Netherlands)，再用1/500稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素(Amersham Biosciences，UK)，然后与TMB底物(KPL，Gaithersburg，USA)一起孵育。可加入HCl终止反应，在450nm处读取吸光度。与仅用TNF对照相比，能抑制TNFα与TNFR1结合的TNFR1拮抗剂导致TNF结合减少，因此导致吸光度下降。
L929细胞毒性测定 在小鼠L929成纤维细胞上，可以测定TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb单体)抑制TNF诱导的细胞毒性的能力(Evans，T.(2000)MolecularBiotechnology 15，243-248)。简而言之，将接种在微量滴定板上的L929细胞与TNFR1拮抗剂、100pg/ml TNF和1mg/ml放线菌素D(Sigma，Poole，UK)一起孵育过夜。细胞存活率通过在490nm读出吸光度而测定，接着与[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基(carbboxy)甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓(Promega，Madison，USA)一起孵育。TNFR1拮抗剂抑制细胞毒性，因此，与仅用TNF对照相比，导致吸光度增加。
HeLa IL-8测定 可以采用人HeLa细胞来测定TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb单体)抑制TNF对IL-8分泌的诱导能力(采用Akeson，L.等(1996)Journalof Biological Chemistry 271，30517-30523所述方法的改进方法，所述文献介绍了在HUVEC中IL-1对IL-8的诱导作用；在此，我们观察了人TNFα的诱导作用，而且我们采用HeLa细胞替代HUVEC细胞系)。简而言之，接种在微量滴定板上的HeLa细胞与TNFR1拮抗剂和300pg/ml TNF一起孵育过夜。孵育后，吸出上清液，通过夹心ELISA(R&D systems)或其它合适方法测定细胞和IL-8浓度。TNFR1拮抗剂抑制IL-8的分泌，与仅用TNF对照相比，上清液中IL-8更少。
MRC-5IL-8释放测定 用以下MRC-5细胞测定，可鉴定人TNFR1拮抗剂。该测定是基于在MRC-5细胞中TNF诱导的IL-8分泌，该测定方法是Alceson，L.等，Journal of Biological Chemistry 27130517-30523(1996)所述方法的改进方法，所述文献介绍了在HUVEC中IL-1对IL-8的诱导作用。简而言之，将MRC-5细胞接种在微量滴定板上，将这些板与TNFR1拮抗剂和人TNFα(300pg/ml)一起孵育过夜。孵育后，吸出培养物上清液，通过夹心ELISA(R&D systems)或其它合适方法，测定上清液中的IL-8浓度。与仅与TNFα一起孵育的对照孔相比，TNFR1拮抗剂导致上清液中IL-8分泌降低。
实施例 实施例1.将TNFR1拮抗剂局部给予肺组织，对C57BL/6小鼠亚慢性模型有效。
在本项研究中，在每次接触空气或吸烟(TS)前1小时，通过鼻内给药，将TNFR1拮抗剂(抗TNFR1 dAb单体(TAR2m21-23))和TNF拮抗剂(ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(ImmunexCorporation)))局部给予肺部。通过连续11次、每天TS暴露引起对TS所致肺部炎症指数变化的效应，在最后一次暴露后24小时进行检测。用抗TNF化合物(ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(ImmunexCorporation)))作为对照。在另一组中，在TS暴露前1小时和暴露后6小时，口服给予磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂(BAY 19-8004；利林司特(lirimilast))，作为参考。
方法 检测物1ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(ImmunexCorporation)) 检测物2DOM1m(抗TNFR1 dAb单体(TAR2m21-23)) 检测物3BAY 19-8004(PDE4抑制剂) 检测物1和检测物2的溶媒是柠檬酸钠pH 6.0，100mM NaCl。检测物3的溶媒是0.5％羧甲基纤维素(Sigma，Product No.C-4888，LotNo.87H0036)的水溶液。剂量体积为5ml/kg。
全笼养(full barrier bred)的雌性小鼠(C57BL/6)经证实在收到时没有特定微生物(16-20g)(Charles River)，将其分组(每组最多5只)并分室，放入底部固定的铺有杨树木屑的笼子(IVC)内，每室有独立通风。笼内环境(气流、温度和湿度)用IVC系统(Techniplast)控制。
方案 分组编号7 分组大小n＝10 剂量体积1-4组为50μl/小鼠；1-7组为5ml/kg 治疗时间在第1-11天，1-4组是在暴露给TS或空气之前1小时，而5-7组是在暴露前1小时和暴露后6小时 研究方案概述于下表1。
表1.
i.n.，鼻内；p.o.，口服 TS暴露 让小鼠(每间暴露小室最多5只)暴露在香烟(1R1型，由肯塔基大学(University of Kentucky)提供)产生的TS中。首次暴露是在第1天暴露给4支香烟，到第6/7天暴露增加到最大6支香烟/天。此后到第11天的暴露为6支香烟/天。根据每日观察到的小鼠耐受力来调整增加率。对照组小鼠每天以同样的时间长短暴露给空气(空气暴露对照)。
健康监测 在研究开始前、暴露方案的第6天和终止日，给动物称重。在每次给予检测物和TS暴露期间和之后监测所有动物。
终止方法 按照以下方法，用过量麻醉药(戊巴比妥钠，100mg/kg i.p.)处死动物在第11次和最后一次TS暴露之后24小时处死所有动物。所有治疗组小鼠处理如下从锁骨下动脉采血，放在微量离心管中，让其在4℃凝血过夜。去除血凝块，剩余液体在微量离心管中以2900rpm离心6分钟。轻轻倾析出所得上清液血清，贮存在-40℃，以备PK分析用。用0.4ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行支气管肺泡灌洗(BAL)。通过总细胞计数和分类细胞计数统计BAL中回收的细胞。摘出肺，放在液氮中急冻并贮存于-80℃，以备PK分析用。
数据分析 对数据进行常态检验。如果检验呈阳性，则初步分析先用单侧方差分析检验(单侧ANOVA)，再用Bonferroni多重比较事后检验，来比较对照组和治疗组。如果数据不是正态分布，则采用Kruskal-Wallis检验，再用Dunn多重比较检验。当p＜0.05时，就认为数据具有显著性。
结果 与空气/溶媒组相比，对照组TS/溶媒具有细胞浸润(参见图1)。
与TS暴露和对照治疗组相比，TS暴露和检测物1(DOM1，抗TNFR1 dAb)治疗组的肺部细胞浸润明显减少(图1)总细胞有72％受到抑制(p＜0.001)、巨噬细胞有74％受到抑制(p＜0.001)、嗜中性粒细胞有82％受到抑制(p＜0.001)、淋巴细胞有86％受到抑制(p＜0.05)、上皮细胞有55％受到抑制(p＜0.01)。观察到嗜酸性粒细胞减少82％，但是这种变化不明显，因为在该实验中普遍观察到嗜酸性粒细胞数量的变异性。
与对照组相比，检测物3(PDE4抑制剂，BAY 19-8004)治疗组的肺部细胞浸润明显减少(图1)总细胞有52％受到抑制(p＜0.01)、巨噬细胞有55％受到抑制(p＜0.01)、嗜中性粒细胞有55％受到抑制(p＜0.001)、淋巴细胞有61％受到抑制(p＜0.001)、嗜酸性粒细胞有56％受到抑制(p＜0.01)。观察到上皮细胞减少46％，但是这种变化不明显。
在暴露给TS并用检测物1(ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(Immunex Corporation))治疗的小组内，未观察到任何细胞群体的明显减少。
实施例2.系统给予TNFR1拮抗剂，在C57BL/6小鼠COPD亚慢性模型中有效。
在本项研究中，从首次TS暴露之前24小时开始，每48小时经腹膜内给药而系统给予TNFR1拮抗剂(PEG化抗TNFR1 dAb单体(TAR2m21-23PEG化，以增加流体动力学尺寸和体内血清半衰期))和TNF拮抗剂(ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(ImmunexCorporation)))。通过连续11次、每天TS暴露引起对TS所致肺部炎症指数变化的效应，在最后一次暴露后24小时进行检测。用抗TNF化合物(ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(ImmunexCorporation)))作为对照。
方法 检测物1ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(ImmunexCorporation)) 检测物2PEG DOM1m(用40kDa聚乙二醇PEG化的抗TNFR1dAb单体(TAR2m21-23)，以增加流体动力学尺寸并延长体内血清半衰期)。
两种检测物的溶媒都是无菌盐水，两种检测物的剂量体积都是10ml/kg。
全笼养的雌性小鼠(C57BL/6)经证实在收到时没有特定微生物(16-20g)(Charles River)，将其分组(每组最多5只)并分室，放入底部固定的铺有杨树木屑的笼子(IVC)内，每室有独立通风。笼内环境(气流、温度和湿度)用IVC系统(Techniplast)控制。
方案 分组编号4 分组大小对于1-4组，n＝10， 剂量体积对于1-4组，10ml/kg 治疗时间从首次TS暴露前24小时开始，每48小时一次。随后在TS暴露前1小时给予。
研究方案概述于下表2。TS暴露、健康监测、终止方法和数据分析都按照实施例1所述进行。
表2.
i.p.，腹膜内 结果 与TS暴露和对照治疗组相比，TS暴露和检测物2(PEG DOM1m)治疗组的肺部细胞浸润明显减少总细胞有60％受到抑制(图2)、巨噬细胞有63％受到抑制、多型核细胞有66％受到抑制、淋巴细胞有78％受到抑制，嗜酸性粒细胞有65％受到抑制。观察到上皮细胞减少40％，但是这种变化不明显。
在暴露给TS并用检测物1(ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(Immunex Corporation))治疗的小组内，未观察到任何细胞群体的明显减少。用ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(ImmunexCorporation))治疗甚至导致肺部总细胞数量和PMN细胞数量增加。
实施例3.将能结合TNFR1的结合剂局部给予肺部后的药代动力学。
在本项研究中，通过鼻内给予，将能结合TNFR1的结合剂(抗TNFR1 dAb单体(TAR2m21-23))局部给予肺部，对该结合剂的药代动力学进行评价。
方法 在本项研究中，用DOM1m(抗TNFR1 dAb单体(TAR2m21-23))的20mM柠檬酸钠溶液pH6.0，100mM NaCl。稀释液是柠檬酸钠pH6.0，100mM NaCl。
方案 在同一天，在加热溶液的1-2小时内，所有动物经鼻内给予DOM1m。
全笼养的雌性小鼠(C57BL/6)经证实在收到时没有特定微生物(16-20g)(Charles River)，将其分组(每组最多5只)并分室，放入底部固定的铺有杨树木屑的笼子(IVC)内，每室有独立通风。笼内环境(气流、温度和湿度)用IVC系统(Techniplast)控制。
分组编号5 分组大小3 剂量体积50μl(25μl/鼻孔) 处死时间给药后1小时、2小时、5小时、8小时和24小时。
研究方案概述于下表3。
表3. i.n.，鼻内 健康监测 在研究开始前给动物称重。在每次给予化合物期间和之后监测所有动物。24小时组的动物按定期间隔进行监测过夜。
终止方法 用过量麻醉药(戊巴比妥钠，100mg/kg i.p.)处死动物。从锁骨下动脉采血，放在微量离心管中，让其在4℃凝血过夜。去除血凝块，剩余液体在微量离心管中以2900rpm离心6分钟。轻轻倾析出所得上清液，放在新管内，冷冻并贮存在-40℃，以备分析用。用0.4ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)慢慢灌入并抽回3次，收集支气管肺泡灌洗液(BAL)。将BAL在微量离心管中以2700rpm离心6分钟，取出上清液，贮存在-40℃，以备分析用。细胞沉淀重悬于合适体积的PBS中，用血细胞计数器统计总细胞计数。准备Cytospin玻片，进行分类细胞测定。切取肺，急冻并贮存于-80℃，以备分析用。用研钵和研棒将肺在液氮下捣碎，然后加入T-PER

组织蛋白提取试剂(Pierce)，再用40冲程的杜恩斯匀浆器(dounce homogenizer)匀浆。
用ELISA测定DOM1m 将96孔MAXISORP测定板(Nunc)用0.5μg/ml 100μl/孔mTNFR/Fc(R&D systems)的PBS在4℃包被过夜。用0.05％吐温/PBS洗涤各孔3次并用PBS洗涤3次。加入200μl/孔的2％BSA的PBS封闭测定板。洗涤各孔，然后加入100μl DOM1m标准或样品。将测定板孵育1小时。洗涤各孔，结合的DOM1用鸡抗VH(1/500)、再用抗鸡IGY HRP缀合物(1/5000稀释；Abcam)测定。将100μl SureBlue1-Component TMB MicroWell过氧化物酶(KPL，Gaithersburg，USA)溶液加入到各孔，将各板放置在室温下直到出现合适信号(～5分钟)。加入HCl终止反应，在450nm处读取吸光度。
结果 BAL中DOM1m的水平在1小时时最大，约为14μg/ml(约3.5μg/0.25ml BAL液)。这表明，至少17％(3.5μg/20μg总给药量)的给予物质存在于肺部支气管肺泡小室内。更多物质存在于周围组织中，但该物质无法回收。BAL中的水平在延长的时间周期中也很高并在24小时内逐渐下降(24小时后＞10倍下降)。
肺组织中DOM1m的水平在给药后8小时内相对恒定，在给药后24小时不可检出。在给药后8小时，肺组织内的水平约为0.35μg。在8小时时，肺组织中％总给药量约为2％(总给药量为20μg)。在检测时间点，与BAL水平加起来，肺部所检测到的结合剂最大水平总计为总给药剂量的至少～20％。
血清中DOM1m的水平在1小时时最大(约150ng/ml)，此后迅速下降。在给药后5小时，血清中的水平约为70ng/ml，相当于100ng/小鼠(1.5ml血体积)。给药后5小时的血清中％总给药量约为0.5％(总给药量为20μg)。5小时后血清中检测不到DOM1m。
实施例4.与猕猴TNFR1的交叉反应性。
在基于细胞的TNFR1测定中，用猕猴(Macaca fascicularis)皮肤成纤维细胞系测试抗人TNFR1 dAb与猕猴TNFR1的交叉反应性。与猕猴TNFR1的交叉反应性是有利的，因为药代动力学和毒理学研究可以不用替代物(surogate agent)进行。
方法 将猕猴胚胎皮肤成纤维细胞(5×103细胞/孔)与抗人TNFR1 dAb在37℃/5％CO2中一起孵育1小时。然后加入200pg/ml(终浓度)的人TNF，将该板在37℃/5％CO2孵育过夜。
人IL-8 DuoSet ELISA用于测定细胞培养上清液中人IL-8的浓度。按照制造商的指南进行测定。将96孔Nunc Maxisorp检测板用100μl 4μg/ml检测抗体/PBS包被。该板在4℃孵育过夜。在每次孵育步骤之间，各板用自动洗板器和0.05％吐温/PBS洗涤3次并用PBS洗涤3次。加入200μl/孔1％BSA/PBS，在室温下将该板孵育1小时。将90μl 0.1％BSA、0.05％吐温20/PBS加入到各孔中，10μl细胞上清液，标准曲线包括IL-8，始于5ng/ml，在0.1％BSA、0.05％吐温20/PBS中。将100μl 20ng/ml检测抗体(贮备液用0.1％BSA、0.05％吐温20/PBS按1∶180进行稀释)加入到各孔中，将该板在室温下孵育2小时。将100μl链霉抗生物素-HRP加入到各孔中(贮备液用0.1％BSA、0.05％吐温20/PBS按1∶200进行稀释)。将各板在室温下孵育20分钟。将100μl SureBlue 1-Component TMB MicroWell过氧化物酶溶液加入到各孔中，在室温下放置直到呈现蓝色。加入100μl 1M盐酸终止反应。在30分钟内在450nm处读取板的吸光度。
结果/结论 在TAR2h-131系列中的抗人TNFR1 dAb能够有效阻断TNF诱导的IL-8从猕猴成纤维细胞中释放出来。与在人MRC-5测定的效力(～600pM)相比，在猕猴测定中dAb TAR2h-131-511和TAR2h-131-117的效力值略高(分别为303nM和330nM)。得出的结论是，TAR2h-131系列dAb与猕猴TNFR1有交叉反应性。
实施例5.肺部给予抗TNFR1 dAb，对TNFα诱导的肺部炎症的效果。
通过鼻内途径，将抗TNFR1 dAb给予小鼠肺部，1小时后通过鼻内给予TNFα。通过在给予TNFα后的给定时间点，测定BAL中嗜中性粒细胞数量，定量测定BAL中炎性细胞因子KC、MIP-2和MCP-1的浓度，并定量测定肺组织中的E-选择蛋白，从而研究在给予TNFα之前预先给予肺部抗TNFR1 dAb的效果。
方法 炎性刺激物是重组鼠TNFα的PBS(其中含0.1％BSA)。
抗TNFR1 dAb是TAR2m-21-23(批号BH31/01/06-1)的20nM柠檬酸缓冲液(pH 6)。
TNFα(1μg/小鼠)通过鼻内(i.n.)途径给予。给予体积为50μl/小鼠(20μg/ml)。抗TNFR1 dAbTAR2m-21-23(1mg/kg)也通过鼻内途径给予。所给予的dAb体积是50μl/小鼠(0.4mg/ml，当小鼠为20g时)。
全笼养的雌性小鼠(C57/bl6)经证实在收到时没有特定微生物(16-20g)(Charles River)，将其分组(每组最多5只)并分室，放入底部固定的铺有杨树木屑的笼子(IVC)内，每室有独立通风。笼内环境(气流、温度和湿度)用IVC系统(Techniplast)控制。
治疗组 分组编号13 分组大小n＝5-6 在给予TNFα之前1小时，各组小鼠经鼻内给予溶媒或dAb。按照下表4所示，在给予TNFα之后的预定时间处死各组动物。

治疗前约3分钟，吸入异氟烷引起轻度麻醉。通过鼻内途径慢慢灌注溶媒或dAb，体积为50μl/小鼠。让小鼠恢复，然后放回笼内。1小时后通过同样的鼻内途径给予TNFα(1μg/小鼠)或其溶媒。在给予TNFα后2、4、6、8、24和48小时，处死dAb或溶媒治疗组小鼠。
用过量麻醉药(戊巴比妥钠，100mg/kg i.p.)处死小鼠。插入导管，用3次分开的0.4ml等分的PBS进行支气管肺泡灌洗(BAL)。灌洗液放在冰上保存，然后进行离心。完整取出心和肺，去除心脏，将肺放入液氮中急冻。将灌洗液离心，上清液等分为250μl的4份并贮存于-40℃。细胞沉淀重悬于40μl PBS，取10μl细胞悬液加入90μl‘Kimura′或‘Turks’染液中，用血细胞计数器进行总湿细胞计数。用细胞悬液制备Cytospin玻片，并用‘W.吉姆萨(Wrights Giemsa)’染液着色，进行分类细胞分析。用标准形态测定技术进行细胞分类。
样品制备和ELISA鼠TNFα、KC、MIP-2、MCP-1和E-选择蛋白的ELISA试剂盒得自R&D Systems。用纯净BAL上清液样品进行BAL中细胞因子KC、MIP-2和MCP-1的浓度测定。将BAL上清液按1∶100进行稀释，用于测定BAL中TNFα的浓度。
将冷冻的肺融化，在500μl裂解缓冲液(含10mM HEPES pH 7.5、0.5％triton X-100、150mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM AEBSF和蛋白酶抑制剂混合物(1μg/ml亮抑酶肽、1μg/ml抑肽酶、10μg/ml胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制剂和1μg/ml抑胃酶肽)中匀浆。稀释肺匀浆上清液，用于测定肺组织的E-选择蛋白(1∶50)和TNFα(1∶100)浓度。
用Quantipro BCA试剂盒(Sigma)测定BAL和肺匀浆上清液总蛋白浓度。
结果 经鼻内给予鼠TNFα之后，检测给药后2小时BAL和肺组织TNFα的显著水平(图11A和11B)。在BAL和组织中的TNFα浓度都以时间依赖性方式下降，在48小时回到基线(溶媒处理)水平。BAL中的水平比肺组织中的水平高约10倍。这些数据证明，鼻内给予TNFα导致细胞因子明显递送到肺部。然而，所检测到的某些TNFα可能是内源的，尽管反应分布型没有提示这一点。
在整个所检测的时间点内，1小时预先给予1mg/kg抗TNFR1dAb，对BAL和肺组织TNFα浓度没有明显影响。
尽管鼻内给予鼠TNFα之后，BAL和肺组织中TNFα的浓度快速增加，但是在给予TNFα后1-8小时之间，BAL嗜中性粒细胞数量并未明显上升到高于基线。然而，在给予TNFα后24小时和48小时，观察到BAL嗜中性粒细胞(图12)。在24小时和48小时时BAL嗜中性粒细胞的增加部分地受到抗TNFR1 dAb的抑制(分别达26％和44％抑制)。
在给予TNFα后2小时，嗜中性粒细胞化学引诱物KC和MIP-2的浓度明显上升，并以时间依赖性方式下降，这两种趋化因子在24小时都回到基础浓度(图13A和图13B)。这样的BAL KC和MIP-2的增加明显被抗TNFR1 dAb预治疗减少。
TNFα也明显增加BAL MCP-1和肺组织E-选择蛋白的浓度，但是峰增加迟于BAL KC和MIP-2(6小时，而非2小时)。BAL MCP-1和肺组织E-选择蛋白的浓度在48小时回到基础水平(图13C和图13D)。这样的BAL KC和MIP-2的增加明显被抗TNFR1 dAb预治疗减少。
讨论 将鼠TNFα鼻内给予小鼠，导致肺TNFα的显著水平，这导致BAL嗜中性粒细胞、BAL KC、MIP-2和MCP-1和肺组织E-选择蛋白明显增加。BAL嗜中性粒细胞直到约24小时才增加并在48小时保持增加。先前文献中采用大鼠所得的数据证明了延长的嗜中性粒细胞反应。在2小时时间点观察到BAL KC和MIP-2中的峰增加，在BAL MCP-1和肺组织E-选择蛋白的峰增加在约6小时。在给予TNFα后6小时检测到KC、MIP-2、MCP-1和E-选择蛋白各自的增加水平。
在给予鼠TNFα之前1小时用抗TNFR1 dAb(1mg/kg)进行预治疗，抑制BAL嗜中性粒细胞和KC、MIP-2和MCP-1和肺组织E-选择蛋白的增加。这些数据表明TNFR1受体介导该模型中大部分由鼻内TNFα诱导的肺部炎症。
实施例6.肺部给予不同剂量的抗TNFR1 dAb，对TNFα诱导的肺部炎症的效果。
在鼻内给予TNFα之前1小时，将不同剂量的抗TNFR1 dAb通过鼻内途径给予小鼠肺部。所用的抗TNFR1 dAb剂量是2.5mg/kg、1mg/kg、0.3mg/kg、0.1mg/kg、0.03mg/kg和0.01mg/kg。通过定量测定BAL中炎性细胞因子KC、MIP-2和MCP-1的浓度并定量测定肺组织中的E-选择蛋白，研究预先给予抗TNFR1 dAb的效果。
方法 炎性刺激物和检测物与实施例5所述相同。通过鼻内途径给予TNFα(1μg/小鼠)。所给的体积为50μl/小鼠(20μg/ml)。
通过鼻内途径给予抗TNFR1 dAb TAR2m-21-23，剂量为2.5mg/kg、1mg/kg、0.3mg/kg、0.1mg/kg、0.03mg/kg或0.01mg/kg。所给的dAb体积为50μl/小鼠。
小鼠与实施例5所述的品系相同并同样关养。
治疗组 分组大小n＝4-7 在给予TNFα之前1小时，鼻内给予各组小鼠溶媒或dAb(2.5、1、0.3、0.1、0.03或0.01mg/kg)。在给予TNFα之后6小时处死各组所有小鼠。
按照实施例6所述的同样方法对小鼠实施给药。在鼻内给予TNFα之后6小时处死小鼠，按照实施例6所述收集BAL细胞、BAL上清液和冷冻肺组织。按照实施例6所述的方法检查并定量测定BAL蛋白、KC、MIP-2和MCP-1、肺部匀浆上清液蛋白和E-选择蛋白。
结果 如实施例5所述，在给药后6小时，鼻内给予TNFα诱导了BAL内KC、MIP-2和MCP-1的显著浓度以及肺组织内E-选择蛋白的显著浓度。用抗TNFR1 dAb的预治疗(TNFα之前1小时)抑制这些炎性介质以剂量依赖性方式升高(表5)，尽管各介质间的效力确有不同。

1当dAb剂量为2.5、1、0.3、0.1、0.03和0.01mg/kg时，该表显示TNFα诱导的BAL KC、MIP-2和MCP-1和肺组织E-选择蛋白浓度增加的抑制百分率(平均值±SD)。
抗TNFR1 dAb的所有剂量都在2.5mg/kg和0.03mg/kg之间时，对BAL KC的抑制程度类似，而剂量在0.01mg/kg时无活性。同样，抗TNFR1 dAb的所有剂量在2.5mg/kg和0.1mg/kg之间时，对BALMIP-2的抑制程度基本相同，而剂量在0.03mg/kg时抑制程度稍低，剂量在0.01mg/kg时无活性。
抗TNFR1 dAb不是很有效的BAL MCP-1抑制剂，因为在2.5mg/kg和0.3mg/kg之间才观察到明显抑制，而在更低剂量时没有观察到抑制。肺组织E-选择蛋白浓度以同样方式受到抑制；在2.5mg/kg和0.3mg/kg之间观察到明显抑制，最低抑制在0.1mg/kg，在更低剂量时则没有效果。
结论 将鼠TNFα鼻内给予小鼠，导致BAL嗜中性粒细胞、BAL KC、MIP-2和MCP-1和肺组织E-选择蛋白明显增加。这样的增加以剂量依赖性方式受到抗TNFR1 dAb的明显抑制。比起BAL MCP-1和肺组织E-选择蛋白，抗TNFR1 dAb对BAL KC和MIP-2具有更强效的抑制活性。这可能是因为在给予TNFα之后，BAL KC和MIP-2的峰增加的诱导比较快，而BAL MCP-1和组织E-选择蛋白的峰增加则较迟。
该项研究表明，在给予TNFα后6小时，鼻内抗TNFR1 dAb的剂量0.3mg/kg，显著抑制了TNFα诱导的BAL嗜中性粒细胞、BAL KC、MIP-2和MCP-1和肺组织E-选择蛋白的增加，但是0.3mg/kg并不是超大剂量。
实施例8.鼻内途径给予抗TNFR1 dAb的体内作用时间。
在鼻内给予TNFα之前的不同时间，将抗TNFR1 dAb(TAR2m-21-23)经鼻内给予小鼠肺部。通过ELISA定量测定BAL中炎性细胞因子KC、MIP-2和MCP-1的浓度，并定量测定肺组织中的E-选择蛋白，从而研究在给予TNFα之前预先给予肺部抗TNFR1 dAb的效果。结果见下表6。
方法 炎性刺激物重组鼠TNFα 检测物1TAR2m-21-23(批号BH31/01/06-1)(抗TNFR1 dAb) rmTNFα的溶媒含0.1％BSA的PBS TAR2m-21-23的溶媒20nM柠檬酸缓冲液pH 6 按照先前研究所用的鼻内途径，TNFα的剂量为1μg/小鼠。给予鼻内的体积为50μl/小鼠(20μg/ml)。
通过鼻内途径，TAR2m-21-23的剂量为0.3mg/kg。给予鼻内的体积为50μl/小鼠(0.4mg/ml，当小鼠为20g时)。
所用小鼠和dAb制备小鼠与先前研究方案所述的品系相同并且同样关养。
方案 治疗组 分组大小n＝4-7 治疗时间 在给予TNFα之前1、2、4或6小时，鼻内给予各组小鼠溶媒或dAb。在给予TNFα之后6小时处死各组所有小鼠。
给药和终止方法如上所述，用上述研究的同样方法给予小鼠。在鼻内给予TNFα之后6小时处死小鼠，如上所述，收集BAL细胞、BAL上清液和冷冻肺组织。
样品制备和ELISA按照以上实验所述，检测BAL蛋白、KC、MIP-2和MCP-1和肺匀浆上清液蛋白和E-选择蛋白。

2该表显示，在鼻内给予TNFα或溶媒后6小时，平均BAL KC(pg/ml)、MIP-2(pg/ml)和MCP-1(pg/ml)和肺组织E-选择蛋白(ng/ml)浓度。在给予TNFα后1、2、4或6小时，给予抗TNFR1 dAb。
结果见表6，表明在给予TNFα后1、2、4或6小时给予dAb，在所有dAb预给予的时间点，明显抑制了TNF诱导的BAL KC和MIP-2。在更长的预给药时间，观察到更好的抑制。这表明，＞1小时对于鼻内给药后dAb与受体的结合是最好的。按照相似方式，在所有dAb预给予的时间点，在给予TNFα后1、2、4或6小时给予dAb，也会明显抑制TNF诱导的BAL MCP-1和肺组织E-选择蛋白。这些结果表明，抗TNFR1 dAb的作用时间大于6小时。
实施例9.通过鼻内途径给予的、能结合TNFR1并抑制TNFα与受体结合的抗TNFR1 dAb对TNFα诱导的肺部炎症的评价。
先前的实施例表明，能结合TNFR1但不抑制TNFα与TNFR1结合的抗TNFR1 dAb(“非竞争性dAb”TAR2m-21-23)，明显抑制了TNFα诱导的肺部炎症。该项研究表明，能结合TNFR1并抑制TNFα与TNFR1结合的dAb(“竞争性dAb”TAR2m-15-12)也能有效抑制TNFα诱导的肺部炎症。
方法 炎性刺激物重组鼠TNFα 检测物1TAR2m-21-23(批号BH31/01/06-1)(竞争性抗TNFR1dAb) 检测物2TAR2m-15-12(非竞争性抗TNFR1 dAb) rmTNFα的溶媒含0.1％BSA的PBS dAb的溶媒20nM柠檬酸缓冲液pH 6 按照先前研究所用的鼻内途径，TNFα的剂量为1μg/小鼠。给予鼻内的体积为50μl/小鼠(20μg/ml)。
通过鼻内途径，TAR2m-21-23或TAR2m-15-12的剂量为0.3、0.1和0.03mg/kg。给予鼻内的体积为50μl/小鼠(0.4mg/ml，当小鼠为20g时)。
所用小鼠和dAb制备小鼠与先前研究方案所述的品系相同并且同样关养。按照先前所述配制dAb。
方案 治疗组 分组大小n＝4-7 治疗时间 在给予TNFα之前1小时，鼻内给予各组小鼠溶媒或dAb。在给予TNFα之后6小时处死各组所有小鼠。
给药和终止方法如上所述，用上述研究的同样方法给予小鼠。在鼻内给予TNFα之后6小时处死小鼠，如上所述，收集BAL细胞、BAL上清液和冷冻肺组织。
样品制备和ELISA按照以上实验所述，检测BAL蛋白、KC、MIP-2和MCP-1和肺匀浆上清液蛋白和E-选择蛋白。

3该表显示，当dAb剂量为0.3、0.1和0.03mg/kg时，TNFα诱导的BAL KC、MIP-2和MCP-1和肺组织E-选择蛋白浓度增加的抑制百分率(平均值±SD)。
结果见表7，表明与先前研究类似的用非竞争性抗TNFR1 dAb(TAR2m-21-23)预治疗(TNFα之前1小时)，剂量依赖性地抑制了炎性介质BAL KC、MIP-2和MCP-1和肺组织E-选择蛋白的升高。以类似方法，竞争性抗TNFR1 dAb(TAR2m-15-12)也剂量依赖性地抑制了炎性介质BAL KC、MIP-2BAL和MCP-1和肺组织E-选择蛋白的升高。
与TAR2m-21-23相比，TAR2m-15-12抗TNFR1 dAb在0.03mg/kg时对BAL KC有稍低功效，在0.1-0.03mg/kg时对BAL MIP-2有稍低功效。与TAR2m-21-23相比，TAR2m-15-12抗TNFR1 dAb在0.1mg/kg时对BAL MCP-1无活性，而TAR2m-21-23对BAL MCP-1具有34％抑制。与TAR2m-21-23相比，TAR2m-15-12抗TNFR1 dAb在0.1mg/kg时对肺组织E-选择蛋白有稍低功效。
TAR2m-21-23的体外效力为～1nM，而TAR2m-15-12为～5nM。此外，比起TAR2m-15-12，TAR2m-21-23亲和性更高，解离速率更慢。对炎性介质的功效差异可能是因为亲和力和效力的降低。这表明，非竞争性dAb(TAR2m-21-23)和抑制TNFα与TNFR1结合的竞争性dAbTAR2m-15-12之间没有明显差异。
总结 表8概述了TS诱导的研究结果和TNF诱导的研究结果。与TS暴露和对照治疗组相比，TS暴露和PEG化抗TNFR1 dAb治疗组(10mg/kg)，表现出肺部细胞浸润的明显减少总细胞有62％受到抑制。在(10mg/kg i.p.)TS/ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(ImmunexCorporation))治疗组内，观察到任何细胞群体都没有明显下降。仅在TS/ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(Immunex Corporation))治疗组当剂量增加到30mg/kg(i.p.)时才观察到明显的细胞浸润减少。这表明，与PEG化抗TNFR1 dAb相比，要达到细胞群体的显著下降，需要高出＞3倍的ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(ImmunexCorporation))的系统mg/kg剂量。
在TNFα诱导模型中，抗TNFR1 dAb治疗组(0.3mg/kg i.n.)表现出TNFα诱导的MIP-2水平有78％受到抑制。在ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(Immunex Corporation))用10mg/kg(i.n.)的治疗组中，达到MIP-2的类似抑制水平(78％)。用1mg/kg(i.n.)的ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(Immunex Corporation))治疗组没有表现出任何细胞流入的明显减少。综合这些数据表明，与抗TNFR1 dAb相比，要达到对MIP-2的有效抑制，需要高出＞30倍的鼻内给予ENBREL

(依那西普；英姆纳克斯公司(Immunex Corporation))的剂量(mg/kg)。


i.n.，鼻内；i.p.，腹膜内 尽管已经用本发明的优选实施方案具体说明和描述了本发明，但是本领域技术人员知道，在不偏离所附权利要求书所涵盖的本发明范围情况下，可以对本发明在形式上和细节上进行各种改变。
权利要求
1.一种能结合肺组织内靶标的结合剂在制备用于局部给予肺组织的长效或长治疗窗制剂中的用途，其中肺组织结合剂水平的至少50％维持至少约4小时。
2.一种能结合肺组织内靶标的结合剂在制备用于局部给予肺组织的低剂量有效量的所述结合剂的药物中的用途，其中肺组织结合剂水平的至少50％维持至少约4小时。
3.权利要求1或2的用途，其中所述肺组织是肺。
4.权利要求3的用途，其中在所述制剂或药物中至少约1％结合剂含量的肺部水平维持至少4小时。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述结合剂基本不进入体循环。
6.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述结合剂的体内血清半衰期为约1秒钟至约12小时。
7.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述制剂或药物用于给予剂量不超过约10mg/kg/天。
8.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述结合剂是能结合肺组织内靶标的拮抗剂。
9.权利要求1-8中任一项的用途，其中所述结合剂是能结合肺组织内靶标的抗体片段。
10.权利要求1-8中任一项的用途，其中所述结合剂是能结合肺组织内靶标的dAb单体。
11.一种能结合肺组织内靶标的域抗体(dAb)在制备用于局部给予肺组织的一日量制剂中的用途，其中肺部结合剂水平的至少50％维持至少约4小时。
12.一种能结合肺组织内靶标的域抗体(dAb)在制备用于局部给予肺组织的制剂中的用途，其中dAb在体循环中未蓄积到显著水平。
13.一种能结合肺组织内靶标的域抗体(dAb)在制备用于治疗或预防呼吸道疾病的制剂中的用途，其中所述制剂用于局部给予肺组织，而且dAb在体循环中未蓄积到显著水平。
14.权利要求1-13中任一项的用途，其中能结合肺组织内靶标的dAb的用量最多约为10mg。
15.权利要求1-13中任一项的用途，其中能结合肺组织内靶标的dAb的用量为1mg至10mg。
16.权利要求11-15中任一项的用途，其中所述肺组织内靶标介导肺部炎症或肺病。
17.一种吸入器或鼻内递药装置，用于为患者提供定量域抗体(dAb)制剂以治疗或预防呼吸道疾病或病症，其中所述吸入器或鼻内递药装置包括dAb制剂并提供含有至多10mg dAb的定量日用量。
18.域抗体(dAb)制剂在制造吸入器或鼻内递药装置中的用途，其目的是提供长效吸入dAb制剂，用于局部递送到肺部。
19.权利要求18的用途，其中肺部结合剂水平的至少50％维持至少约4小时。
20.权利要求18或19的用途，其中所述吸入器或鼻内递药装置用于提供至多10mg/kg/天的剂量。
21.权利要求18的用途，其中所述吸入器或鼻内递药装置用于提供至多10mg/天的剂量。
22.权利要求18-21中任一项的用途，其中所述dAb制剂包含能结合肺组织内靶标的dAb，所述靶标介导肺部炎症或肺病。
23.权利要求1-16和22中任一项的用途，其中所述肺组织内靶标选自TNFR1、IL-1、IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、IL-12、IL-12R、IL-13、IL-13Rα1、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、类糜蛋白酶、FGF、弗林蛋白酶、内皮素-1、嗜酸性粒细胞趋化因子类(例如嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、整联蛋白、L-选择蛋白、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、骨桥蛋白、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、涎免凝集素8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、TNFR1、TRANCE、类胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、αvβ6和αvβ8。
24.权利要求23的用途，其中所述肺组织内靶标是TNFR1。
25.一种将能结合肺组织内靶标的结合剂给予患者以在其肺组织内产生长治疗窗的方法，所述方法包括将有效量的所述结合剂局部给予所述患者的肺组织。
26.一种将能结合肺组织内靶标的结合剂给予患者以在其肺组织内产生长治疗窗的方法，所述方法包括选择体内血清半衰期为约1秒钟至约12小时并能结合肺组织内靶标的结合剂，并将有效量的所述结合剂局部给予所述患者的肺组织。
27.权利要求25的方法，其中所述结合剂的体内血清半衰期为约1秒钟至约12小时。
28.权利要求25-27中任一项的方法，其中所述结合剂基本不进入体循环。
29.权利要求25-28中任一项的方法，其中所述结合剂是抗体的抗原结合片段。
30.权利要求29的方法，其中所述结合剂是Fv片段。
31.权利要求29的方法，其中所述结合剂是dAb单体。
32.权利要求25-31中任一项的方法，其中给予低剂量有效量。
33.一种用于治疗呼吸道疾病的方法，所述方法包括给予有需要的患者有效量的TNFR1拮抗剂，其中所述有效量不超过约10mg/kg/天，而且其中相对于治疗前水平，肺内炎性细胞水平下降，其p≤0.05。
34.权利要求33的方法，其中肺内炎性细胞水平是通过支气管肺泡灌洗液、痰或支气管活检样品中的总细胞计数来评价的。
35.权利要求33的方法，其中肺内炎性细胞水平是通过支气管肺泡灌洗液、痰或支气管活检样品中的巨噬细胞和/或嗜中性粒细胞计数来评价的。
36.权利要求33-35中任一项的方法，其中将所述TNFR1拮抗剂局部给予有需要的患者的肺组织。
37.权利要求36的方法，其中TNFR1拮抗剂是通过吸入或鼻内给药而局部给予肺组织的。
38.权利要求36或37的方法，其中给予低剂量治疗量。
39.权利要求33-35中任一项的方法，其中将所述TNFR1拮抗剂系统给予有需要的患者。
40.权利要求39的方法，其中所述TNFR1拮抗剂经腹膜内或皮下系统给予。
41.权利要求36-38中任一项的方法，其中所述TNFR1拮抗剂在给予后，在肺组织内持续至少8小时。
42.权利要求36、37和41中任一项的方法，其中所述肺组织是肺。
43.权利要求36-38、41和42中任一项的方法，其中所述TNFR1拮抗剂基本不进入体循环。
44.权利要求33-43中任一项的方法，其中给予的TNFR1拮抗剂约为5mg/kg以下，每天一次。
45.权利要求33-43中任一项的方法，其中给予的TNFR1拮抗剂约为1mg/kg以下，每天一次。
46.权利要求33-43中任一项的方法，其中相对于治疗前水平，肺内炎性细胞水平下降至少约30％。
47.权利要求33-45中任一项的方法，其中相对于治疗前水平，肺内炎性细胞水平下降至少约50％。
48.权利要求33-45中任一项的方法，其中相对于治疗前水平，肺内炎性细胞水平下降至少约70％。
49.权利要求33-45中任一项的方法，其中相对于治疗前水平，肺内炎性细胞水平下降，其p＜0.001。
50.权利要求33-49中任一项的方法，其中所述呼吸道疾病选自肺部炎症、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、过敏性肺炎、伴有嗜酸粒细胞增多的肺部浸润、环境性肺病、肺炎、支气管扩张、囊性纤维化、间质性肺病、原发性肺动脉高压、肺血栓栓塞症、胸膜病、纵隔病、横隔膜病、通气不足、通气过度、睡眠呼吸暂停、急性呼吸窘迫综合征、间皮瘤、肉瘤、移植物排斥、移植物抗宿主病、肺癌、变应性鼻炎、变态反应、石棉肺、曲霉肿、曲霉病、支气管扩张、慢性支气管炎、肺气肿、嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化、侵袭型肺炎球菌病、流感、非结核性分枝杆菌、胸腔积液、尘肺、肺囊虫病、肺炎、肺放线菌病、肺泡蛋白沉积症、肺炭疽、肺水肿、肺栓子、肺部炎症、肺组织细胞增多症X、肺动脉高压、肺诺卡菌病、肺结核、肺静脉闭塞性疾病、类风湿性肺病、结节病和韦格纳肉芽肿病。
51.权利要求50的方法，其中所述呼吸道疾病是慢性阻塞性肺病或哮喘。
52.权利要求33-51中任一项的方法，其中TNFR1拮抗剂包括对TNFR1具有结合特异性、但基本不激动TNFR1的多肽域。
53.权利要求52的方法，其中所述多肽域是抗体或抗体片段。
54.权利要求33-51中任一项的方法，其中TNFR1拮抗剂包含域抗体(dAb)，所述dAb能结合TNFR1并能抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)与TNFR1的结合或抑制在结合TNFα后通过TNFR1介导的信号转导，其中所述dAb选自免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。
55.权利要求54的方法，其中所述dAb选自对人TNFR1具有结合特异性的人VH和对人TNFR1具有结合特异性的人VL。
56.权利要求55的方法，其中所述dAb的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列至少具有90％同源性TAR2h-12(SEQ IDNO1)、TAR2h-13(SEQ ID NO2)、TAR2h-14(SEQ ID NO3)、TAR2h-16(SEQ ID NO4)、TAR2h-17(SEQ ID NO5)、TAR2h-18(SEQ ID NO6)、TAR2h-19(SEQ ID NO7)、TAR2h-20(SEQ IDNO8)、TAR2h-21(SEQ ID NO9)、TAR2h-22(SEQ ID NO10)、TAR2h-23(SEQ ID NO11)、TAR2h-24(SEQ ID NO12)、TAR2h-25(SEQ ID NO13)、TAR2h-26(SEQ ID NO14)、TAR2h-27(SEQ IDNO15)、TAR2h-29(SEQ ID NO16)、TAR2h-30(SEQ ID NO17)、TAR2h-32(SEQ ID NO18)、TAR2h-33(SEQ ID NO19)、TAR2h-10-1(SEQ ID NO20)、TAR2h-10-2(SEQ ID NO21)、TAR2h-10-3(SEQ ID NO22)、TAR2h-10-4(SEQ ID NO23)、TAR2h-10-5(SEQ ID NO24)、TAR2h-10-6(SEQ ID NO25)、TAR2h-10-7(SEQ ID NO26)、TAR2h-10-8(SEQ ID NO27)、TAR2h-10-9(SEQ ID NO28)、TAR2h-10-10(SEQ ID NO29)、TAR2h-10-11(SEQ ID NO30)、TAR2h-10-12(SEQ ID NO31)、TAR2h-10-13(SEQ ID NO32)、TAR2h-10-14(SEQ ID NO33)、TAR2h-10-15(SEQ ID NO34)、TAR2h-10-16(SEQ ID NO35)、TAR2h-10-17(SEQ ID NO36)、TAR2h-10-18(SEQ ID NO37)、TAR2h-10-19(SEQ ID NO38)、TAR2h-10-20(SEQ ID NO39)、TAR2h-10-21(SEQ ID NO40)、TAR2h-10-22(SEQ ID NO41)、TAR2h-10-27(SEQ ID NO42)、TAR2h-10-29(SEQ ID NO43)、TAR2h-10-31(SEQ ID NO44)、TAR2h-10-35(SEQ ID NO45)、TAR2h-10-36(SEQ ID NO46)、TAR2h-10-37(SEQ ID NO47)、TAR2h-10-38(SEQ ID NO48)、TAR2h-10-45(SEQ ID NO49)、TAR2h-10-47(SEQ ID NO50)、TAR2h-10-48(SEQ ID NO51)、TAR2h-10-57(SEQ ID NO52)、TAR2h-10-56(SEQ ID NO53)、TAR2h-10-58(SEQ ID NO54)、TAR2h-10-66(SEQ ID NO55)、TAR2h-10-64(SEQ ID NO56)、TAR2h-10-65(SEQ ID NO57)、TAR2h-10-68(SEQ ID NO58)、TAR2h-10-69(SEQ ID NO59)、TAR2h-10-67(SEQ ID NO60)、TAR2h-10-61(SEQ ID NO61)、TAR2h-10-62(SEQ ID NO62)、TAR2h-10-63(SEQ ID NO63)、TAR2h-10-60(SEQ ID NO64)、TAR2h-10-55(SEQ ID NO65)、TAR2h-10-59(SEQ ID NO66)、TAR2h-10-70(SEQ ID NO67)、TAR2h-34(SEQ ID NO68)、TAR2h-35(SEQ ID NO69)、TAR2h-36(SEQ ID NO70)、TAR2h-37(SEQ ID NO71)、TAR2h-38(SEQ IDNO72)、TAR2h-39(SEQ ID NO73)、TAR2h-40(SEQ ID NO74)、TAR2h-41(SEQ ID NO75)、TAR2h-42(SEQ ID NO76)、TAR2h-43(SEQ ID NO77)、TAR2h-44(SEQ ID NO78)、TAR2h-45(SEQ IDNO79)、TAR2h-47(SEQ ID NO80)、TAR2h-48(SEQ ID NO81)、TAR2h-50(SEQ ID NO82)、TAR2h-51(SEQ ID NO83)、TAR2h-66(SEQ ID NO84)、TAR2h-67(SEQ ID NO85)、TAR2h-68(SEQ IDNO86)、TAR2h-70(SEQ ID NO87)、TAR2h-71(SEQ ID NO88)、TAR2h-72(SEQ ID NO89)、TAR2h-73(SEQ ID NO90)、TAR2h-74(SEQ ID NO91)、TAR2h-75(SEQ ID NO92)、TAR2h-76(SEQ IDNO93)、TAR2h-77(SEQ ID NO94)、TAR2h-78(SEQ ID NO95)、TAR2h-79(SEQ ID NO96)、TAR2h-15(SEQ ID NO97)、TAR2h-131-8(SEQ ID NO98)、TAR2h-131-24(SEQ ID NO99)、TAR2h-15-8(SEQ ID NO100)、TAR2h-15-8-1 SEQ ID NO101)、TAR2h-15-8-2(SEQ ID NO102)、TAR2h-185-23(SEQ ID NO103)、TAR2h-154-10-5(SEQ ID NO104)、TAR2h-14-2(SEQ ID NO105)、TAR2h-151-8(SEQ ID NO106)、TAR2h-152-7(SEQ ID NO107)、TAR2h-35-4(SEQ ID NO108)、TAR2h-154-7(SEQ ID NO109)、TAR2h-80(SEQ ID NO110)、TAR2h-81(SEQ ID NO111)、TAR2h-82(SEQ ID NO112)、TAR2h-83(SEQ ID NO113)、TAR2h-84(SEQ ID NO114)、TAR2h-85(SEQ ID NO115)、TAR2h-86(SEQ ID NO116)、TAR2h-87(SEQ ID NO117)、TAR2h-88(SEQ ID NO118)、TAR2h-89(SEQ ID NO119)、TAR2h-90(SEQ ID NO120)、TAR2h-91(SEQ ID NO121)、TAR2h-92(SEQ ID NO122)、TAR2h-93(SEQ ID NO123)、TAR2h-94(SEQ ID NO124)、TAR2h-95(SEQ ID NO125)、TAR2h-96(SEQ ID NO126)、TAR2h-97(SEQ ID NO127)、TAR2h-99(SEQ ID NO128)、TAR2h-100(SEQ ID NO129)、TAR2h-101(SEQ ID NO130)、TAR2h-102(SEQ ID NO131)、TAR2h-103(SEQ ID NO132)、TAR2h-104(SEQ ID NO133)、TAR2h-105(SEQ ID NO134)、TAR2h-106(SEQ ID NO135)、TAR2h-107(SEQ ID NO136)、TAR2h-108(SEQ ID NO137)、TAR2h-109(SEQ ID NO138)、TAR2h-110(SEQ ID NO139)、TAR2h-111(SEQ ID NO140)、TAR2h-112(SEQ ID NO141)、TAR2h-113(SEQ ID NO142)、TAR2h-114(SEQ ID NO143)、TAR2h-115(SEQ ID NO144)、TAR2h-116(SEQ ID NO145)、TAR2h-117(SEQ ID NO146)、TAR2h-118(SEQ ID NO147)、TAR2h-119(SEQ ID NO148)、TAR2h-120(SEQ ID NO149)、TAR2h-121(SEQ ID NO150)、TAR2h-122(SEQ ID NO151)、TAR2h-123(SEQ ID NO152)、TAR2h-124(SEQ ID NO153)、TAR2h-125(SEQ ID NO154)、TAR2h-126(SEQ ID NO155)、TAR2h-127(SEQ ID NO156)、TAR2h-128(SEQ ID NO157)、TAR2h-129(SEQ ID NO158)、TAR2h-130(SEQ ID NO159)、TAR2h-131(SEQ ID NO160)、TAR2h-132(SEQ ID NO161)、TAR2h-133(SEQ ID NO162)、TAR2h-151(SEQ ID NO163)、TAR2h-152(SEQ ID NO164)、TAR2h-153(SEQ ID NO165)、TAR2h-154(SEQ ID NO166)、TAR2h-159(SEQ ID NO167)、TAR2h-165(SEQ ID NO168)、TAR2h-166(SEQ ID NO169)、TAR2h-168(SEQ ID NO170)、TAR2h-171(SEQ ID NO171)、TAR2h-172(SEQ ID NO172)、TAR2h-173(SEQ ID NO173)、TAR2h-174(SEQ ID NO174)、TAR2h-176(SEQ ID NO175)、TAR2h-178(SEQ ID NO176)、TAR2h-201(SEQ ID NO177)、TAR2h-202(SEQ ID NO178)、TAR2h-203(SEQ ID NO179)、TAR2h-204(SEQ ID NO180)、TAR2h-185-25(SEQ ID NO181)、TAR2h-154-10(SEQ ID NO182)和TAR2h-205(SEQ ID NO183)。
57.权利要求52-56中任一项的方法，其中所述TNFR1拮抗剂还包含延长半衰期的部分。
58.权利要求57的方法，其中所述延长半衰期的部分是聚亚烷基二醇部分、血清白蛋白或其片段、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、或包含能延长体内半衰期的多肽的结合位点的抗体或抗体片段。
59.权利要求58的方法，其中所述延长半衰期的部分是包含血清白蛋白或新生动物Fc受体结合位点的抗体或抗体片段。
60.权利要求59的方法，其中所述抗体或抗体片段是dAb。
61.权利要求59的方法，其中所述延长半衰期的部分是聚乙二醇部分。
62.一种治疗呼吸道疾病的方法，所述方法包括
选择肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)拮抗剂，所述拮抗剂当按剂量不超过约10mg/kg且每天一次进行给药时，在呼吸道疾病的合适动物模型中具有功效，其中相对于未治疗对照而言，当通过支气管肺泡灌洗液中的总细胞计数评定，肺部细胞浸润受到抑制，其p≤0.05时，则对所述动物模型具有功效；和
将有效量的所述TNFR1拮抗剂给予有需要的患者。
63.权利要求62的方法，其中所述合适动物模型是雌性C57BL/6小鼠吸烟所致慢性阻塞性肺病(COPD)亚慢性模型。
64.权利要求62的方法，其中所述合适动物模型是非人类灵长类的哮喘或COPD模型。
65.权利要求62-64中任一项的方法，其中相对于未治疗对照而言，所述动物模型的肺部细胞浸润受到抑制达至少约30％。
66.权利要求62-64中任一项的方法，其中相对于未治疗对照而言，所述动物模型的肺部细胞浸润受到抑制达至少约50％。
67.权利要求62-64中任一项的方法，其中相对于未治疗对照而言，所述动物模型的肺部细胞浸润受到抑制达至少约70％。
68.权利要求62-67中任一项的方法，其中相对于未治疗对照而言，所述TNFR1拮抗剂抑制所述动物模型肺部细胞浸润，其p＜0.001。
69.权利要求62-68中任一项的方法，其中相对于未治疗对照而言，在所述合适动物模型中当通过支气管肺泡灌洗液中的总细胞计数评定时，所述TNFR1拮抗剂抑制肺部细胞浸润，其抑制程度要比口服磷酸二酯酶4抑制剂的高。
70.权利要求69的方法，其中所述口服磷酸二酯酶4抑制剂是BAY 19-8004。
71.权利要求70的方法，其中给予所述BAY 19-8004每天两次，剂量是10mg/kg。
72.权利要求62-71中任一项的方法，其中所述呼吸道疾病选自肺部炎症、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、过敏性肺炎、伴有嗜酸粒细胞增多的肺部浸润、环境性肺病、肺炎、支气管扩张、囊性纤维化、间质性肺病、原发性肺动脉高压、肺血栓栓塞症、胸膜病、纵隔病、横隔膜病、通气不足、通气过度、睡眠呼吸暂停、急性呼吸窘迫综合征、间皮瘤、肉瘤、移植物排斥、移植物抗宿主病、肺癌、变应性鼻炎、变态反应、石棉肺、曲霉肿、曲霉病、支气管扩张、慢性支气管炎、肺气肿、嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化、侵袭型肺炎球菌病、流感、非结核性分枝杆菌、胸腔积液、尘肺、肺囊虫病、肺炎、肺放线菌病、肺泡蛋白沉积症、肺炭疽、肺水肿、肺栓子、肺部炎症、肺组织细胞增多症X、肺动脉高压、肺诺卡菌病、肺结核、肺静脉闭塞性疾病、类风湿性肺病、结节病和韦格纳肉芽肿病。
73.权利要求62-71中任一项的方法，其中所述患者是人，所述呼吸道疾病是慢性阻塞性肺病或哮喘，其中给药量不超过10mg/天。
74.权利要求62-73中任一项的方法，其中TNFR1拮抗剂包含对TNFR1具有结合特异性、但基本不激动TNFR1的多肽域。
75.权利要求74的方法，其中所述多肽域是抗体或抗体片段。
76.权利要求62-73中任一项的方法，其中TNFR1拮抗剂包含域抗体(dAb)，所述dAb能结合TNFR1并抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)与TNFR1的结合或抑制在结合TNFα后通过TNFR1介导的信号转导，其中所述dAb选自免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。
77.权利要求76的方法，其中所述dAb选自对人TNFR1具有结合特异性的人重链可变区(VH)和对人TNFR1具有结合特异性的人轻链可变区(VL)。
78.权利要求77的方法，其中所述dAb的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列至少具有90％同源性TAR2h-12(SEQ IDNO1)、TAR2h-13(SEQ ID NO2)、TAR2h-14(SEQ ID NO3)、TAR2h-16(SEQ ID NO4)、TAR2h-17(SEQ ID NO5)、TAR2h-18(SEQ ID NO6)、TAR2h-19(SEQ ID NO7)、TAR2h-20(SEQ IDNO8)、TAR2h-21(SEQ ID NO9)、TAR2h-22(SEQ ID NO10)、TAR2h-23(SEQ ID NO11)、TAR2h-24(SEQ ID NO12)、TAR2h-25(SEQ ID NO13)、TAR2h-26(SEQ ID NO14)、TAR2h-27(SEQ IDNO15)、TAR2h-29(SEQ ID NO16)、TAR2h-30(SEQ ID NO17)、TAR2h-32(SEQ ID NO18)、TAR2h-33(SEQ ID NO19)、TAR2h-10-1(SEQ ID NO20)、TAR2h-10-2(SEQ ID NO21)、TAR2h-10-3(SEQ ID NO22)、TAR2h-10-4(SEQ ID NO23)、TAR2h-10-5(SEQ ID NO24)、TAR2h-10-6(SEQ ID NO25)、TAR2h-10-7(SEQ ID NO26)、TAR2h-10-8(SEQ ID NO27)、TAR2h-10-9(SEQ ID NO28)、TAR2h-10-10(SEQ ID NO29)、TAR2h-10-11(SEQ ID NO30)、TAR2h-10-12(SEQ ID NO31)、TAR2h-10-13(SEQ ID NO32)、TAR2h-10-14(SEQ ID NO33)、TAR2h-10-15(SEQ ID NO34)、TAR2h-10-16(SEQ ID NO35)、TAR2h-10-17(SEQ ID NO36)、TAR2h-10-18(SEQ ID NO37)、TAR2h-10-19(SEQ ID NO38)、TAR2h-10-20(SEQ ID NO39)、TAR2h-10-21(SEQ ID NO40)、TAR2h-10-22(SEQ ID NO41)、TAR2h-10-27(SEQ ID NO42)、TAR2h-10-29(SEQ ID NO43)、TAR2h-10-31(SEQ ID NO44)、TAR2h-10-35(SEQ ID NO45)、TAR2h-10-36(SEQ ID NO46)、TAR2h-10-37(SEQ ID NO47)、TAR2h-10-38(SEQ ID NO48)、TAR2h-10-45(SEQ ID NO49)、TAR2h-10-47(SEQ ID NO50)、TAR2h-10-48(SEQ ID NO51)、TAR2h-10-57(SEQ ID NO52)、TAR2h-10-56(SEQ ID NO53)、TAR2h-10-58(SEQ ID NO54)、TAR2h-10-66(SEQ ID NO55)、TAR2h-10-64(SEQ ID NO56)、TAR2h-10-65(SEQ ID NO57)、TAR2h-10-68(SEQ ID NO58)、TAR2h-10-69(SEQ ID NO59)、TAR2h-10-67(SEQ ID NO60)、TAR2h-10-61(SEQ ID NO61)、TAR2h-10-62(SEQ ID NO62)、TAR2h-10-63(SEQ ID NO63)、TAR2h-10-60(SEQ ID NO64)、TAR2h-10-55(SEQ ID NO65)、TAR2h-10-59(SEQ ID NO66)、TAR2h-10-70(SEQ ID NO67)、TAR2h-34(SEQ ID NO68)、TAR2h-35(SEQ ID NO69)、TAR2h-36(SEQ ID NO70)、TAR2h-37(SEQ ID NO71)、TAR2h-38(SEQ IDNO72)、TAR2h-39(SEQ ID NO73)、TAR2h-40(SEQ ID NO74)、TAR2h-41(SEQ ID NO75)、TAR2h-42(SEQ ID NO76)、TAR2h-43(SEQ ID NO77)、TAR2h-44(SEQ ID NO78)、TAR2h-45(SEQ IDNO79)、TAR2h-47(SEQ ID NO80)、TAR2h-48(SEQ ID NO81)、TAR2h-50(SEQ ID NO82)、TAR2h-51(SEQ ID NO83)、TAR2h-66(SEQ ID NO84)、TAR2h-67(SEQ ID NO85)、TAR2h-68(SEQ IDNO86)、TAR2h-70(SEQ ID NO87)、TAR2h-71(SEQ ID NO88)、TAR2h-72(SEQ ID NO89)、TAR2h-73(SEQ ID NO90)、TAR2h-74(SEQ ID NO91)、TAR2h-75(SEQ ID NO92)、TAR2h-76(SEQ IDNO93)、TAR2h-77(SEQ ID NO94)、TAR2h-78(SEQ ID NO95)、TAR2h-79(SEQ ID NO96)、TAR2h-15(SEQ ID NO97)、TAR2h-131-8(SEQ ID NO98)、TAR2h-131-24(SEQ ID NO99)、TAR2h-15-8(SEQ ID NO100)、TAR2h-15-8-1 SEQ ID NO101)、TAR2h-15-8-2(SEQ ID NO102)、TAR2h-185-23(SEQ ID NO103)、TAR2h-154-10-5(SEQ ID NO104)、TAR2h-14-2(SEQ ID NO105)、TAR2h-151-8(SEQ ID NO106)、TAR2h-152-7(SEQ ID NO107)、TAR2h-35-4(SEQ ID NO108)、TAR2h-154-7(SEQ ID NO109)、TAR2h-80(SEQ ID NO110)、TAR2h-81(SEQ ID NO111)、TAR2h-82(SEQ ID NO112)、TAR2h-83(SEQ ID NO113)、TAR2h-84(SEQ ID NO114)、TAR2h-85(SEQ ID NO115)、TAR2h-86(SEQ ID NO116)、TAR2h-87(SEQ ID NO117)、TAR2h-88(SEQ ID NO118)、TAR2h-89(SEQ ID NO119)、TAR2h-90(SEQ ID NO120)、TAR2h-91(SEQ ID NO121)、TAR2h-92(SEQ ID NO122)、TAR2h-93(SEQ ID NO123)、TAR2h-94(SEQ ID NO124)、TAR2h-95(SEQ ID NO125)、TAR2h-96(SEQ ID NO126)、TAR2h-97(SEQ ID NO127)、TAR2h-99(SEQ ID NO128)、TAR2h-100(SEQ ID NO129)、TAR2h-101(SEQ ID NO130)、TAR2h-102(SEQ ID NO131)、TAR2h-103(SEQ ID NO132)、TAR2h-104(SEQ ID NO133)、TAR2h-105(SEQ ID NO134)、TAR2h-106(SEQ ID NO135)、TAR2h-107(SEQ ID NO136)、TAR2h-108(SEQ ID NO137)、TAR2h-109(SEQ ID NO138)、TAR2h-110(SEQ ID NO139)、TAR2h-111(SEQ ID NO140)、TAR2h-112(SEQ ID NO141)、TAR2h-113(SEQ ID NO142)、TAR2h-114(SEQ ID NO143)、TAR2h-115(SEQ ID NO144)、TAR2h-116(SEQ ID NO145)、TAR2h-117(SEQ ID NO146)、TAR2h-118(SEQ ID NO147)、TAR2h-119(SEQ ID NO148)、TAR2h-120(SEQ ID NO149)、TAR2h-121(SEQ ID NO150)、TAR2h-122(SEQ ID NO151)、TAR2h-123(SEQ ID NO152)、TAR2h-124(SEQ ID NO153)、TAR2h-125(SEQ ID NO154)、TAR2h-126(SEQ ID NO155)、TAR2h-127(SEQ ID NO156)、TAR2h-128(SEQ ID NO157)、TAR2h-129(SEQ ID NO158)、TAR2h-130(SEQ ID NO159)、TAR2h-131(SEQ ID NO160)、TAR2h-132(SEQ ID NO161)、TAR2h-133(SEQ ID NO162)、TAR2h-151(SEQ ID NO163)、TAR2h-152(SEQ ID NO164)、TAR2h-153(SEQ ID NO165)、TAR2h-154(SEQ ID NO166)、TAR2h-159(SEQ ID NO167)、TAR2h-165(SEQ ID NO168)、TAR2h-166(SEQ ID NO169)、TAR2h-168(SEQ ID NO170)、TAR2h-171(SEQ ID NO171)、TAR2h-172(SEQ ID NO172)、TAR2h-173(SEQ ID NO173)、TAR2h-174(SEQ ID NO174)、TAR2h-176(SEQ ID NO175)、TAR2h-178(SEQ ID NO176)、TAR2h-201(SEQ ID NO177)、TAR2h-202(SEQ ID NO178)、TAR2h-203(SEQ ID NO179)、TAR2h-204(SEQ ID NO180)、TAR2h-185-25(SEQ ID NO181)、TAR2h-154-10(SEQ ID NO182)和TAR2h-205(SEQ ID NO183)。
79.权利要求74-78中任一项的方法，其中所述TNFR1拮抗剂还包含延长半衰期的部分。
80.权利要求79的方法，其中所述延长半衰期的部分是聚亚烷基二醇部分、血清白蛋白或其片段、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、或包含能延长体内半衰期的多肽的结合位点的抗体或抗体片段。
81.权利要求80的方法，其中所述延长半衰期的部分是包含血清白蛋白或新生动物Fc受体结合位点的抗体或抗体片段。
82.权利要求81的方法，其中所述抗体或抗体片段是dAb。
83.权利要求80的方法，其中所述延长半衰期的部分是聚乙二醇部分。
84.一种治疗呼吸道疾病的方法，所述方法包括
选择肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)拮抗剂，所述拮抗剂当按常规不超过每天一次且剂量约10mg/kg以下进行给药时，在呼吸道疾病的合适动物模型中具有功效，其中相对于未治疗对照而言，当通过支气管肺泡灌洗液中的总细胞计数评定，肺部细胞浸润受到抑制，其p≤0.05时，则对所述动物模型具有功效；和
将有效量的所述TNFR1拮抗剂局部给予有需要的患者的肺组织。
85.权利要求84的方法，其中所述TNFR1拮抗剂在给药后，在肺组织内持续至少8小时。
86.权利要求84或85的方法，其中所述TNFR1拮抗剂是通过吸入或鼻内给予的。
87.权利要求84-86中任一项的方法，其中所述肺组织是肺。
88.权利要求84-87中任一项的方法，其中所述TNFR1拮抗剂基本不进入体循环。
89.权利要求84-88中任一项的方法，其中所述合适动物模型是雌性C57BL/6小鼠吸烟所致慢性阻塞性肺病(COPD)亚慢性模型。
90.权利要求84-88中任一项的方法，其中所述合适动物模型是非人类灵长类的哮喘或COPD模型。
91.权利要求84-90中任一项的方法，其中相对于未治疗对照而言，所述动物模型的肺部细胞浸润受到抑制达至少约30％。
92.权利要求84-90中任一项的方法，其中相对于未治疗对照而言，所述动物模型的肺部细胞浸润受到抑制达至少约50％。
93.权利要求84-90中任一项的方法，其中相对于未治疗对照而言，所述动物模型的肺部细胞浸润受到抑制达至少约70％。
94.权利要求84-93中任一项的方法，其中相对于未治疗对照而言，所述TNFR1拮抗剂抑制所述动物模型肺部细胞浸润，其p＜0.001。
95.权利要求84-94中任一项的方法，其中相对于未治疗对照而言，在所述合适动物模型中通过支气管肺泡灌洗液中的总细胞计数评定，所述TNFR1拮抗剂抑制肺部细胞浸润，其抑制程度要比口服磷酸二酯酶4抑制剂的高。
96.权利要求95的方法，其中所述口服磷酸二酯酶4抑制剂是BAY 19-8004。
97.权利要求96的方法，其中给予所述BAY 19-8004每天两次，剂量是10mg/kg。
98.权利要求84-97中任一项的方法，其中所述呼吸道疾病选自肺部炎症、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、过敏性肺炎、伴有嗜酸粒细胞增多的肺部浸润、环境性肺病、肺炎、支气管扩张、囊性纤维化、间质性肺病、原发性肺动脉高压、肺血栓栓塞症、胸膜病、纵隔病、横隔膜病、通气不足、通气过度、睡眠呼吸暂停、急性呼吸窘迫综合征、间皮瘤、肉瘤、移植物排斥、移植物抗宿主病、肺癌、变应性鼻炎、变态反应、石棉肺、曲霉肿、曲霉病、支气管扩张、慢性支气管炎、肺气肿、嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化、侵袭型肺炎球菌病、流感、非结核性分枝杆菌、胸腔积液、尘肺、肺囊虫病、肺炎、肺放线菌病、肺泡蛋白沉积症、肺炭疽、肺水肿、肺栓子、肺部炎症、肺组织细胞增多症X、肺动脉高压、肺诺卡菌病、肺结核、肺静脉闭塞性疾病、类风湿性肺病、结节病和韦格纳肉芽肿病。
99.权利要求84-97中任一项的方法，其中所述患者是人，所述呼吸道疾病是慢性阻塞性肺病或哮喘，其中给药量不超过10mg/天。
100.权利要求84-99中任一项的方法，其中TNFR1拮抗剂包含对TNFR1具有结合特异性、但基本不激动TNFR1的多肽域。
101.权利要求100的方法，其中所述多肽域是抗体或抗体片段。
102.权利要求84-99中任一项的方法，其中TNFR1拮抗剂包含域抗体(dAb)，所述dAb能结合TNFR1并抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)与TNFR1的结合或抑制在结合TNFα后通过TNFR1介导的信号转导，其中所述dAb选自免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。
103.权利要求102的方法，其中所述dAb选自对人TNFR1具有结合特异性的人重链可变区(VH)和对人TNFR1具有结合特异性的人轻链可变区(VL)。
104.权利要求103的方法，其中所述dAb的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列至少具有90％同源性TAR2h-12(SEQ IDNO1)、TAR2h-13(SEQ ID NO2)、TAR2h-14(SEQ ID NO3)、TAR2h-16(SEQ ID NO4)、TAR2h-17(SEQ ID NO5)、TAR2h-18(SEQ ID NO6)、TAR2h-19(SEQ ID NO7)、TAR2h-20(SEQ IDNO8)、TAR2h-21(SEQ ID NO9)、TAR2h-22(SEQ ID NO10)、TAR2h-23(SEQ ID NO11)、TAR2h-24(SEQ ID NO12)、TAR2h-25(SEQ ID NO13)、TAR2h-26(SEQ ID NO14)、TAR2h-27(SEQ IDNO15)、TAR2h-29(SEQ ID NO16)、TAR2h-30(SEQ ID NO17)、TAR2h-32(SEQ ID NO18)、TAR2h-33(SEQ ID NO19)、TAR2h-10-1(SEQ ID NO20)、TAR2h-10-2(SEQ ID NO21)、TAR2h-10-3(SEQ ID NO22)、TAR2h-10-4(SEQ ID NO23)、TAR2h-10-5(SEQ ID NO24)、TAR2h-10-6(SEQ ID NO25)、TAR2h-10-7(SEQ ID NO26)、TAR2h-10-8(SEQ ID NO27)、TAR2h-10-9(SEQ ID NO28)、TAR2h-10-10(SEQ ID NO29)、TAR2h-10-11(SEQ ID NO30)、TAR2h-10-12(SEQ ID NO31)、TAR2h-10-13(SEQ ID NO32)、TAR2h-10-14(SEQ ID NO33)、TAR2h-10-15(SEQ ID NO34)、TAR2h-10-16(SEQ ID NO35)、TAR2h-10-17(SEQ ID NO36)、TAR2h-10-18(SEQ ID NO37)、TAR2h-10-19(SEQ ID NO38)、TAR2h-10-20(SEQ ID NO39)、TAR2h-10-21(SEQ ID NO40)、TAR2h-10-22(SEQ ID NO41)、TAR2h-10-27(SEQ ID NO42)、TAR2h-10-29(SEQ ID NO43)、TAR2h-10-31(SEQ ID NO44)、TAR2h-10-35(SEQ ID NO45)、TAR2h-10-36(SEQ ID NO46)、TAR2h-10-37(SEQ ID NO47)、TAR2h-10-38(SEQ ID NO48)、TAR2h-10-45(SEQ ID NO49)、TAR2h-10-47(SEQ ID NO50)、TAR2h-10-48(SEQ ID NO51)、TAR2h-10-57(SEQ ID NO52)、TAR2h-10-56(SEQ ID NO53)、TAR2h-10-58(SEQ ID NO54)、TAR2h-10-66(SEQ ID NO55)、TAR2h-10-64(SEQ ID NO56)、TAR2h-10-65(SEQ ID NO57)、TAR2h-10-68(SEQ ID NO58)、TAR2h-10-69(SEQ ID NO59)、TAR2h-10-67(SEQ ID NO60)、TAR2h-10-61(SEQ ID NO61)、TAR2h-10-62(SEQ ID NO62)、TAR2h-10-63(SEQ ID NO63)、TAR2h-10-60(SEQ ID NO64)、TAR2h-10-55(SEQ ID NO65)、TAR2h-10-59(SEQ ID NO66)、TAR2h-10-70(SEQ ID NO67)、TAR2h-34(SEQ ID NO68)、TAR2h-35(SEQ ID NO69)、TAR2h-36(SEQ ID NO70)、TAR2h-37(SEQ ID NO71)、TAR2h-38(SEQ IDNO72)、TAR2h-39(SEQ ID NO73)、TAR2h-40(SEQ ID NO74)、TAR2h-41(SEQ ID NO75)、TAR2h-42(SEQ ID NO76)、TAR2h-43(SEQ ID NO77)、TAR2h-44(SEQ ID NO78)、TAR2h-45(SEQ IDNO79)、TAR2h-47(SEQ ID NO80)、TAR2h-48(SEQ ID NO81)、TAR2h-50(SEQ ID NO82)、TAR2h-51(SEQ ID NO83)、TAR2h-66(SEQ ID NO84)、TAR2h-67(SEQ ID NO85)、TAR2h-68(SEQ IDNO86)、TAR2h-70(SEQ ID NO87)、TAR2h-71(SEQ ID NO88)、TAR2h-72(SEQ ID NO89)、TAR2h-73(SEQ ID NO90)、TAR2h-74(SEQ ID NO91)、TAR2h-75(SEQ ID NO92)、TAR2h-76(SEQ IDNO93)、TAR2h-77(SEQ ID NO94)、TAR2h-78(SEQ ID NO95)、TAR2h-79(SEQ ID NO96)、TAR2h-15(SEQ ID NO97)、TAR2h-131-8(SEQ ID NO98)、TAR2h-131-24(SEQ ID NO99)、TAR2h-15-8(SEQ ID NO100)、TAR2h-15-8-1SEQ ID NO101)、TAR2h-15-8-2(SEQ ID NO102)、TAR2h-185-23(SEQ ID NO103)、TAR2h-154-10-5(SEQ ID NO104)、TAR2h-14-2(SEQ ID NO105)、TAR2h-151-8(SEQ ID NO106)、TAR2h-152-7(SEQ ID NO107)、TAR2h-35-4(SEQ ID NO108)、TAR2h-154-7(SEQ ID NO109)、TAR2h-80(SEQ ID NO110)、TAR2h-81(SEQ ID NO111)、TAR2h-82(SEQ ID NO112)、TAR2h-83(SEQ ID NO113)、TAR2h-84(SEQ ID NO114)、TAR2h-85(SEQ ID NO115)、TAR2h-86(SEQ ID NO116)、TAR2h-87(SEQ ID NO117)、TAR2h-88(SEQ ID NO118)、TAR2h-89(SEQ ID NO119)、TAR2h-90(SEQ ID NO120)、TAR2h-91(SEQ ID NO121)、TAR2h-92(SEQ ID NO122)、TAR2h-93(SEQ ID NO123)、TAR2h-94(SEQ ID NO124)、TAR2h-95(SEQ ID NO125)、TAR2h-96(SEQ ID NO126)、TAR2h-97(SEQ ID NO127)、TAR2h-99(SEQ ID NO128)、TAR2h-100(SEQ ID NO129)、TAR2h-101(SEQ ID NO130)、TAR2h-102(SEQ ID NO131)、TAR2h-103(SEQ ID NO132)、TAR2h-104(SEQ ID NO133)、TAR2h-105(SEQ ID NO134)、TAR2h-106(SEQ ID NO135)、TAR2h-107(SEQ ID NO136)、TAR2h-108(SEQ ID NO137)、TAR2h-109(SEQ ID NO138)、TAR2h-110(SEQ ID NO139)、TAR2h-111(SEQ ID NO140)、TAR2h-112(SEQ ID NO141)、TAR2h-113(SEQ ID NO142)、TAR2h-114(SEQ ID NO143)、TAR2h-115(SEQ ID NO144)、TAR2h-116(SEQ ID NO145)、TAR2h-117(SEQ ID NO146)、TAR2h-118(SEQ ID NO147)、TAR2h-119(SEQ ID NO148)、TAR2h-120(SEQ ID NO149)、TAR2h-121(SEQ ID NO150)、TAR2h-122(SEQ ID NO151)、TAR2h-123(SEQ ID NO152)、TAR2h-124(SEQ ID NO153)、TAR2h-125(SEQ ID NO154)、TAR2h-126(SEQ ID NO155)、TAR2h-127(SEQ ID NO156)、TAR2h-128(SEQ ID NO157)、TAR2h-129(SEQ ID NO158)、TAR2h-130(SEQ ID NO159)、TAR2h-131(SEQ ID NO160)、TAR2h-132(SEQ ID NO161)、TAR2h-133(SEQ ID NO162)、TAR2h-151(SEQ ID NO163)、TAR2h-152(SEQ ID NO164)、TAR2h-153(SEQ ID NO165)、TAR2h-154(SEQ ID NO166)、TAR2h-159(SEQ ID NO167)、TAR2h-165(SEQ ID NO168)、TAR2h-166(SEQ ID NO169)、TAR2h-168(SEQ ID NO170)、TAR2h-171(SEQ ID NO171)、TAR2h-172(SEQ ID NO172)、TAR2h-173(SEQ ID NO173)、TAR2h-174(SEQ ID NO174)、TAR2h-176(SEQ ID NO175)、TAR2h-178(SEQ ID NO176)、TAR2h-201(SEQ ID NO177)、TAR2h-202(SEQ ID NO178)、TAR2h-203(SEQ ID NO179)、TAR2h-204(SEQ ID NO180)、TAR2h-185-25(SEQ ID NO181)、TAR2h-154-10(SEQ ID NO182)和TAR2h-205(SEQ ID NO183)。
105.权利要求100-104中任一项的方法，其中所述TNFR1拮抗剂还包含延长半衰期的部分。
106.权利要求105的方法，其中所述延长半衰期的部分是聚亚烷基二醇部分、血清白蛋白或其片段、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、或包含能延长体内半衰期的多肽的结合位点的抗体或抗体片段。
107.权利要求106的方法，其中所述延长半衰期的部分是包含血清白蛋白或新生动物Fc受体结合位点的抗体或抗体片段。
108.权利要求107的方法，其中所述抗体或抗体片段是dAb。
109.权利要求107的方法，其中所述延长半衰期的部分是聚乙二醇部分。
110.一种包含dAb单体的配体，所述dAb单体对人TNFR1和另一物种的TNFR1具有结合特异性。
111.权利要求110的配体，其中所述dAb单体是所述人TNFR1和所述另一物种的TNFR1的拮抗剂。
112.权利要求110或111的配体，其中所述dAb单体与所述人TNFR1和所述另一物种TNFR1结合的亲和力的差异不超过约10倍。
113.权利要求110-112中任一项的配体，其中所述dAb与所述人TNFR1和所述另一物种TNFR1结合的结合速率为约104M/s至约105M/s。
114.权利要求110-113中任一项的配体，其中所述dAb与所述人TNFR1和所述另一物种TNFR1结合的解离速率为10-3s-1至约10-5s-1。
115.权利要求110-114中任一项的配体，其中所述另一物种的TNFR1是啮齿动物TNFR1、兔TNFR1、狗TNFR1、猪TNFR1、羊TNFR1或非人类灵长类TNFR1。
116.一种包含能结合TNFR1的dAb的配体，其中所述配体是所述TNFR1的拮抗剂，而且所述dAb的氨基酸序列与SEQ ID NO216至SEQ ID NO433中任一序列具有至少90％同源性。
117.一种对TNFR1具有结合特异性的配体，所述配体包含具有针对TNFR1的结合特异性的结合位点的蛋白质部分，其中所述蛋白质部分包含的氨基酸序列与选自TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194的dAb的CDR3的氨基酸序列相同。
118.权利要求117的配体，其中所述蛋白质部分还包含与选自TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194的dAb的CDR1和/或CDR2的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
119.一种包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中所述能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与TAR2h-131-511、TAR2h-131-193或TAR2h-131-194的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR1序列与选自TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194的dAb的CDR1序列具有至少50％同一性。
120.一种包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中所述能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与TAR2h-131-511、TAR2h-131-193或TAR2h-131-194的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR2序列与选自TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194的CDR2序列具有至少50％同一性。
121.一种包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中所述能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与TAR2h-131-511、TAR2h-131-193或TAR2h-131-194的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR3序列与选自TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194的dAb的CDR3序列具有至少50％同一性。
122.一种包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中所述能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与TAR2h-131-511、TAR2h-131-193或TAR2h-131-194的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR1序列和CDR2序列与选自TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194的dAb的CDR1序列和CDR2序列分别具有至少50％同一性。
123.一种包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中所述能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与TAR2h-131-511、TAR2h-131-193或TAR2h-131-194的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR2序列和CDR3序列与选自TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194的dAb的CDR2序列和CDR3序列分别具有至少50％同一性。
124.一种包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中所述能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与TAR2h-131-511、TAR2h-131-193或TAR2h-131-194的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR1序列和CDR3序列与选自TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194的dAb的CDR1序列和CDR3序列分别具有至少50％同一性。
125.一种包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中所述能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的氨基酸序列与TAR2h-131-511、TAR2h-131-193或TAR2h-131-194的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同，并且其CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列与选自TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194的dAb的CDR1序列、CDR2序列或CDR3序列分别具有至少50％同一性。
126.一种包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中所述能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区包含的CDR2序列与选自TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194的dAb的CDR1序列具有至少50％同一性。
127.一种包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中所述能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区包含的CDR2序列与选自TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194的dAb的CDR2序列具有至少50％同一性。
128.一种包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中所述能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区包含的CDR3序列与选自TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194的dAb的CDR3序列具有至少50％同一性。
129.一种包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中所述能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区包含的CDR1序列和CDR2序列与选自TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194的dAb的CDR1序列和CDR2序列分别具有至少50％同一性。
130.一种包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中所述能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区包含的CDR2序列和CDR3序列与选自TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194的dAb的CDR2序列和CDR3序列分别具有至少50％同一性。
131.一种包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中所述能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区包含的CDR1序列和CDR3序列与选自TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194的dAb的CDR1序列和CDR3序列分别具有至少50％同一性。
132.一种包含能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区的配体，其中所述能结合TNFR1的免疫球蛋白单可变区包含的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列与选自TAR2h-131-511、TAR2h-131-193和TAR2h-131-194的dAb的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列分别具有至少50％同一性。
133.一种包含能结合人TNFR1的dAb并且是人TNFR1拮抗剂的配体，其中所述配体抑制TNFα诱导的炎症或TNFα诱导的炎性介质的剂量[mg/kg]在抑制程度基本相同的情况下，不超过依那西普抑制所述TNFα诱导的炎症或TNFα诱导的炎性介质所需剂量的1/2。
134.权利要求133的配体、其中所述配体抑制TNFα诱导的炎症或TNFα诱导的炎性介质的剂量[mg/kg]在抑制程度基本相同的情况下，不超过依那西普抑制所述TNFα诱导的炎症或TNFα诱导的炎性介质所需剂量的1/10。
135.权利要求110-134中任一项的配体，其中所述配体还包含延长半衰期的部分。
136.用于治疗或诊断的权利要求110-134中任一项的配体。
137.权利要求110-134中任一项的配体在制备用于局部给予肺组织的药物中的用途。
138.权利要求110-134中任一项的配体在制备用于治疗或预防呼吸道疾病的药物中的用途。
139.一种治疗或预防呼吸道疾病的方法，所述方法包括给予有需要的患者有效量的权利要求110-134中任一项的配体。
140.一种编码权利要求110-134中任一项的配体的分离或重组核酸。
141.一种包含权利要求140的重组核酸的载体。
142.一种宿主细胞，所述细胞包含权利要求140的重组核酸或权利要求141的载体。
143.一种制备配体的方法，所述方法包括将权利要求142的宿主细胞在适于表达所述核酸或载体的条件下进行培养，由此产生配体。
144.权利要求142的方法，所述方法还包括分离出所述配体。
全文摘要
本发明公开了能结合肺组织内靶标的结合剂(例如抗体片段、拮抗剂、配体、dAb单体)在制备用于局部给予肺组织的长效或长治疗窗制剂中的用途，以及将能结合肺组织内靶标的结合剂给予患者以在其肺组织中产生长治疗窗的方法。所述制剂可用于局部给予肺组织，而且所述方法还包括局部给予肺组织。本发明还公开了TNFR1拮抗剂在制备用于治疗、预防或抑制肺部炎症或呼吸道疾病的制剂或药物中的用途，以及治疗所述疾病的方法。本发明还公开了结合剂在制造用于治疗或预防肺部炎症或呼吸道疾病的递药装置(例如吸入器，鼻内递药装置)中的用途，以及用于治疗或预防肺部炎症或呼吸道疾病的含有本文所述结合剂的递药装置。
文档编号C07K16/28GK101346397SQ200680048715
公开日2009年1月14日 申请日期2006年10月23日 优先权日2005年10月24日
发明者R·M·T·德怀尔特, S·霍梅斯, I·M·汤林森, G·P·温特, M·F·菲茨格拉德, J·C·福克斯, A·塞普, J·李, B·P·伍尔文 申请人:杜门蒂斯有限公司, 阿根塔发明有限公司