一种肺组织特异表达启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种动物肺组织特异性启动子及其应用。本发明所提供的启动子是下述a)或b)或c)的DNA片段：a)3′端至少含有序列表中序列1的第1601-4000位核苷酸序列，并且从序列1的第1601位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为2400至4000bp的任意一个DNA片段；所述DNA分子具有启动子功能；b)与a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA片段；c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。实验证明本发明所提供的启动子具有良好的肺组织特异性。
【专利说明】一种肺组织特异表达启动子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种肺组织特异性启动子及其应用。
【背景技术】
[0002]长期以来我国的猪群存栏与产量一直处于世界领先地位。随着养殖业规模的扩大化、集约化，动物饲养密度不断增加，动物疫病感染状况日益复杂，动物疫病的发生和流行严重制约着我国养殖业的进一步发展和壮大。当前猪场传染病发生日益严重，且发病面广、传染快、流行蔓延迅速、死亡率极高。据资料统计，自20世纪70年代以来新增加猪传染病有21种，其中90年代以来新增加7种。猪的多种传染病的发生和流行，严重打击了农民养猪的积极性，阻碍了养猪业的发展。通过呼吸系统传播的疾病占绝大多数，包括猪气喘病、猪副嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪肺疫、猪传染性胸膜肺炎、猪传染性萎缩性鼻炎、猪沙门氏菌病、猪流感、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病、猪附红细胞体病、弓形虫病等。如果能够通过抗病育种的方法，培育抗呼吸系统传染病的转基因猪，减少呼吸系统传染病的发生，将对我国的养猪业带来巨大的经济效益。
[0003]转基因技术的关键在于使外源目的基因在转基因动物体内稳定闻效的表达，而转基因表达所用的启动子起着非常重要的作用。启动子是一段能使基因进行转录的DNA序列，转录的RNA通过进一步的翻译和修饰形成功能蛋白质。根据启动子作用的方式及功能不同，可以大致分为4类:组成型启动子、诱导型启动子、组织或发育阶段特异型启动子和合成型启动子。外源基因在组织或发育阶段特异型启动子的调控下，能够在某些特定的组织器官中表达。如果采用呼吸道特异表达的启动子，利用转基因技术将抗病基因在猪呼吸道特异表达，培育出能够抗呼吸系统传播疾病的转基因猪，将在猪的遗传改良中具有重大意义。目前已有一些组织特异性启动子被应用于植物的遗传改良中，获得了显著的成效。然而猪组织特异性启动子的研究却相对滞后，目前报道的猪组织特异性启动子寥寥无几。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种动物肺组织特异性启动子(肺细胞特异性启动子)及其应用。
[0005]本发明所提供的动物肺组织特异性启动子名称为SSD，来源于猪(Sus scrofadomastica L.),是下述a)或b)或c)的DNA片段:
[0006]a)3'端至少含有序列表中序列I的第1601-4000位核苷酸序列，并且从序列I的第1601位开始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延长，得到长度为2400至4000bp的任意一个DNA片段；所述DNA分子具有启动子功能；
[0007]b)与a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且具有启动子功能的DNA片段；
[0008]c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。[0009]上述启动子中，所述严格条件是在2X SSC，0.1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次。每次5min0.5XSSC,0.1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次。每次15min。
[0010]上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%、95%以上的同一性。
[0011]本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的启动子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的启动子核苷酸序列70%或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性,均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0012]这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的启动子核苷酸序列具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0013]上述启动子中,所述启动子SSD的最后一位核苷酸是序列I的第4000位。
[0014]上述启动子中，序列表中序列I由4000个核苷酸组成。
[0015]上述启动子中，所述启动子SSD还可以为下述Al)-A4)中任一种:
[0016]Al)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第1401-4000位核苷酸序列，并且从序列I的第14 01位开始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延长，得到长度为2600至4000bp的任意一个DNA片段；
[0017]A2)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第1201-4000位核苷酸序列，并且从序列I的第1201位开始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延长，得到长度为2800至4000bp的任意一个DNA片段；
[0018]A3)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第1001-4000位核苷酸序列，并且从序列I的第1001位开始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延长，得到长度为3000至4000bp的任意一个DNA片段；
[0019]A4)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第501-4000位核苷酸序列，并且从序列I的第501位开始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延长，得到长度为3500至4000bp的任意一个DNA片段。
[0020]上述启动子中，所述启动子SSD具体可为3'端至少含有序列I的第1401-4000位、按照序列I的核苷酸序列向5'端延长得到长度为2600至2800bp的任意一个DNA片段。
[0021]上述启动子中，所述启动子SSD具体还可为下述1)-6)中的任意一种:
[0022]I)核苷酸序列为序列表中序列I的第1401-4000位核苷酸所示的DNA分子，名称为 SSD-D2600 ；
[0023]2)核苷酸序列为序列表中序列I的第1201-4000位核苷酸所示的DNA分子，名称为 SSD-D2800 ；
[0024]3)核苷酸序列为序列表中序列I的第1001-4000位核苷酸所示的DNA分子，名称为 SSD-D3000 ；
[0025]4)核苷酸序列为序列表中序列I的第1601-4000位核苷酸所示的DNA分子，名称为 SSD-D2400 ；[0026]5)核苷酸序列为序列表中序列I的第501-4000位核苷酸所示的DNA分子，名称为SSD-D3500 ；
[0027]6)核苷酸序列为序列表中序列I的第1-4000位核苷酸所示的DNA分子，名称为SSD-D4000。
[0028]下述BI)至B19)中的任一种含有上述动物肺组织特异性启动子SSD的遗传材料也属于本发明的保护范围:
[0029]BI)含有上述动物肺组织特异性启动子SSD的表达盒；
[0030]B2)含有上述动物肺组织特异性启动子SSD的重组载体；
[0031]B3)含有BI)所述表达盒的重组载体；
[0032]B4)含有上述动物肺组织特异性启动子SSD的重组微生物；
[0033]B5)含有BI)所述表达盒的重组微生物；
[0034]B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；
[0035]B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0036]B8)含有上述动物肺组织特异性启动子SSD的转基因动物细胞系；
[0037]B9)含有BI)所述表达盒的转基因动物细胞系；
[0038]B10)含有B2)所述重组载体的转基因动物细胞系；
[0039]Bll)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
[0040]B12)含有上述动物肺组织特异性启动子SSD的转基因动物组织；
[0041]B13)含有BI)所述表达盒的转基因动物组织；
[0042]B14)含有B2)所述重组载体的转基因动物组织；
[0043]B15)含有B3)所述重组载体的转基因动物组织；
[0044]B16)含有上述动物肺组织特异性启动子SSD的转基因动物器官；
[0045]B17)含有BI)所述表达盒的转基因动物器官；
[0046]B18)含有B2)所述重组载体的转基因动物器官；
[0047]B19)含有B3)所述重组载体的转基因动物器官。
[0048]B8) -B11)所述的转基因动物细胞系、B12) -B15)所述的转基因动物组织、B16) -B 19)所述的转基因动物器官不包括动物的繁殖材料。
[0049]上述遗传材料中，所述表达盒可由所述启动子SSD、所述启动子SSD启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述启动子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为荧光素酶基因(Iuc)。
[0050]所述重组载体中，由所述启动子SSD启动目的基因的表达。在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为在pGL3-Basic载体的多克隆位点插入所述启动子得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为限制性内切酶识别位点Kpn I和Hind III。所述目的基因具体为荧光素酶基因(Iuc)。
[0051]上述表达盒或重组载体可以通过原核显微注射法、胚胎干细胞介导法、逆转录病毒载体法、精子介导的基因转移、核移植转基因法、体细胞核移植法、线粒体介导法等常规生物学方法转化动物器官或组织或细胞，得到转基因动物细胞或组织或器官。
[0052]所述启动子SSD在动物中启动目的基因表达中的应用也属于本发明的保护范围，该应用不包括疾病的诊断和治疗方法。
[0053]该应用中，所述表达可为呼吸道细胞特异表达。所述呼吸道细胞进一步可为肺来源的细胞(肺细胞)或鼻咽来源的细胞。在本发明的一个【具体实施方式】中，所述呼吸道细胞具体可为A549细胞(人肺腺癌细胞)、LTEP-a-2细胞(人肺腺癌细胞)或CNE2细胞(人鼻咽癌细胞)。
[0054]所述启动子SSD在培育转基因动物(如抗呼吸系统传染病的转基因动物)中的应用也属于本发明的保护范围。
[0055]该应用中，所述动物可为陆生动物，如哺乳动物。
[0056]实验证明，本发明的启动子SSD (包括 SSD-D2400、SSD-D2600、SSD-D2800、SSD-D3000,SSD-D3500,SSD-D4000)均可启动报告基因Iuc (荧光素酶)在A549 (人肺腺癌细胞)中表达，且还证明SSD-D2400启动报告基因的表达Iuc (荧光素酶)具有肺组织特异性，说明本发明的启动子SSD具有良好的肺组织特异性。本发明的启动子SSD可用于培育转基因动物(如抗呼吸系统传染病的转基因动物)。
【专利附图】
【附图说明】
[0057]图1为猪SSD-D4000启动子的PCR扩增产物的琼脂糖电泳图。其中，泳道M为DNA分子量标准(NP5000);泳道I为PCR产物。
[0058]图2为重组表达载体pGL3-SSD-D4000的酶切鉴定电泳图。其中，泳道M为DNA分子量标准(NP5000);泳道 I 为 Kpn I/Hind III 双酶切 pGL3-SSD_D2400 产物。
[0059]图3为重组表达载体pGL3-SSD-D2400的酶切鉴定电泳图。其中，泳道M为DNA分子量标准(NP5000);泳道 I 为 Kpn I/Hind III 双酶切 pGL3-SSD_D2400 产物。
[0060]图4为验证猪SSD-D4000启动子区不同截短体的启动子活性(不同载体的荧光素酶相对活性的测定结果)。直方图表示荧光素酶相对活性，误差线用标准差标不，重复数为 4。Basic 代表 A549_pGL3_Basic ；ControI 代表 A549-pGL3_Control ；SSD-D500 代表 A549-pGL3-SSD-D500 ；SSD-D1000 代表 A549-pGL3-SSD_D1000 ；SSD-D1500代表 A549-pGL3-SSD-D1500 ；SSD-D2000 代表 A549-pGL3-SSD_D2000 ；SSD-D2200 代表 A549-pGL3-SSD-D2200 ；SSD-D2400 代表 A549-pGL3-SSD_D2400 ；SSD-D2600 代表 A549-pGL3-SSD-D2600 ；SSD-D2800 代表 A549-pGL3-SSD_D2800 ；SSD-D3000 代表 A549-pGL3-SSD-D3000 ；SSD-D3500 代表 A549-pGL3-SSD_D3500 ；SSD-D4000 代表A549-pGL3-SSD-D4000。
[0061] 图5为验证猪SSD-D2400启动子在不同来源的细胞上的启动子活性(不同细胞的荧光素酶相对活性的测定结果)。直方图表示荧光素酶相对活性，误差线用标准差标示，重复数为4OSSD-D2400代表向受体细胞中导入pGL3-SSD-D2400得到的重组细胞，pGL3-Basic代表向受体细胞中导入pGL3-Basic得到的重组细胞。A549代表向A549受体细胞中导入目标载体得到的重组细胞；LTEP-a-2代表向LTEP-a-2受体细胞中导入目标载体得到的重组细胞；Hela代表向Hela受体细胞中导入目标载体得到的重组细胞；Caco-2代表向Caco_2受体细胞中导入目标载体得到的重组细胞；293T代表向293Τ受体细胞中导入目标载体得到的重组细胞；HepG2代表向HepG2受体细胞中导入目标载体得到的重组细胞；CNE2代表向CNE2受体细胞中导入目标载体得到的重组细胞。【具体实施方式】
[0062]本发明中所述的启动子核苷酸序列可以是其中一个或多个核苷酸发生取代、缺失、插入或倒位的核苷酸序列，即所分离的核苷酸序列的人工突变体或“天然”突变体，它保留其启动子功能；还可以是所述的核苷酸序列与其它启动子序列或启动子区保守调控序列(“motif”或“box”)的融合序列。本发明中所述的“启动子活性”是指当以某种基因的可表达方式将其连接到启动子的下游，并导入到宿主中，该宿主显示具有在宿主内或宿主外生产该基因产物的能力和功能时，该启动子具有启动活性。通常，是将编码容易定性或定量检测的蛋白质的基因(例如，报告基因)连接到该启动子的下游，将该基因导入宿主内，并检测所表达的蛋白质，可确定特定启动子的活性或是否存在该启动子或者该启动子的效力。本发明中所述的转化是指现有技术中已知的、能够将外源基因导入动物细胞或动物组织的任何一种动物转化方法，如原核显微注射法、胚胎干细胞介导法、逆转录病毒载体法、精子介导的基因转移、核移植转基因法、体细胞核移植法、线粒体介导法等。
[0063]术语“具有75%或75%以上同一性的序列”是指与上述启动子的核苷酸序列相比有75%或75%以上的核苷酸序列相同或相似的核酸序列或核苷酸序列，这些序列以基本相同的方式发挥作用并且能够驱动其下游基因的肺组织特异性表达，它们与上述启动子中序列的差异可能是由于局部结构上的修饰或突变，包括人工突变和非人工突变。
[0064]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0065]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0066]引物由北京博迈德生物科技有限公司合成；2XPfu PCR MasterMix(10212-01)、NP5000 核酸 Marker (2 0211-01)、pTP-BSl 克隆载体(30222-01)、定点突变试剂盒(80111-01)均购自北京诺派生物科技有限公司；血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司(DP304-02);质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；pGL3-Control 载体(E1741)、pGL3_Basic 载体(E1751)、PRL-TK 质粒(E2241)、荧光素酶活性检测试剂盒(E1910)均购自美国Promega公司；lipofectamine2000购自美国invitrogen公司(11668-019) ;DMEM培养基购自美国GIBICO公司(12100-046)；1640培养基购自美国GIBICO公司(31800-022) ;A549细胞(人肺腺癌细胞)、LTEP_a_2细胞(人肺腺癌细胞)、Hela细胞(人宫颈癌细胞)、Caco-2细胞(人结肠癌细胞)、293T细胞(人胚肾细胞)、HepG2细胞(人肝癌细胞)和CNE2细胞(人鼻咽癌细胞)均购自上海细胞库；杜X长X大猪购自北京市大兴区种猪场。
[0067]实施例1、猪SSD-D4000启动子的克隆及序列测定
[0068]1、引物设计
[0069]设计的引物序列如下，引物引入Kpn I和Hind III限制性酶切位点，人工合成:
[0070]FI (引物 I): 5' -CGGGGTACCGAGCAGGGGATGTAGAGAGAGCAA-3'(下划线处为 KpnI的识别序列)
[0071 ] Rl (引物 2): 5 ' -GCCCAAGCTTCAGAAACACTCACAGTTGCGT-3 '(下划线处为 HindIII的识别序列)
[0072]2、猪全基因组的提取
[0073]取新鲜健康的杜X长X大猪的肝脏组织约200mg，迅速剪碎后转移到玻璃研磨器中，采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取组织全基因组DNA，具体操作参照试剂盒说明书。
[0074]3、PCR扩增猪SSD-D4000启动子区
[0075]以步骤2提取的猪基因组DNA为模板，在引物Fl和引物Rl的引导下，利用2XPfuPCR MasterMix并参照试剂盒说明书进行扩增，反应条件为:首先94°C 5min ;其次94°C 30sec,60°C 30sec, 72°C 4min,共 35 个循环；最后 72°C 5min。将 PCR 产物进行琼脂糖电泳检测。
[0076]4、测序及序列分析
[0077]将PCR扩增的大小约4000bp左右的目的DNA亚克隆入平端载体pTP_BSl中，经筛选后挑取单克隆测序，将经测序后表明含有序列表中序列I所示DNA片段(SSD-D4000)的重组质粒命名为PTP-SSD-D4000。序列I由4000个核苷酸组成，为启动子SSD-D4000的核
苷酸序列。
[0078]实施例2、猪SSD-D4000启动子功能鉴定
[0079]1、重组表达载体的构建
[0080]将实施例1中获得的重组质粒pTP-SSD-D4000用限制性内切酶Kpn I和Hind III双酶切后，与经同样双酶切的pGL3_Basic载体的骨架片段相连，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，获得阳性重组菌，将经PCR和酶切检测(图1，图2)含有大小约为4000bp目的条带的重组载体送样测序,将测序表明含有SSD-D4000启动子(序列I)的重组载体命名为PGL3-SSD-D4000，将含有该重组载体的重组菌命名为DH5 a -pGL3-SSD_D4000。
[0081]SSD-D40005 !端进行截短，获得的10个DNA片段分别为SSD-D500 (序列I的第3501-4000位所示的DNA片段)、SSD-D1000 (序列I的第3001-4000位所示的DNA片段)、SSD-D1500(序列 I 的第 2501-4000 位所示的 DNA 片段)、SSD-D2000(序列 I 的第 2001-4000位所示的DNA片段)、SSD-D2200(序列I的第1801-4000位所示的DNA片段)、SSD_D2400(序列I的第1601-4000位所示的DNA片段)、SSD_D2600 (序列I的第1401-4000位所示的DNA片段)、SSD-D2800 (序列I的第1201-4000位所示的DNA片段)、SSD-D3000 (序列I的第1001-4000位所示的DNA片段)、SSD-D3500 (序列I的第501-4000位所示的DNA片段)。
[0082]利用定点突变试剂盒，对已构建的PGL3-SSD-D4000质粒中的SSD-D4000进行截短突变，具体操作参照说明书。依次从PGL3-SSD-D4000质粒中的SSD-D40005'端进行截短，获得如下10个重组表达载体:含有SSD-D3500的重组表达载体pGL3-SSD_D3500 (将pGL3-Basic载体的Kpn I和Hind III位点间的片段替换为序列I的第501-4000位所示的DNA(名称为SSD-D3500)，其它核苷酸不变，得到的重组载体)、含有SSD-D3000的重组表达载体PGL3-SSD-D3000 (将pGL3_Basic载体的Kpn I和Hind III位点间的片段替换为序列I的第1001-4000位所示的DNA(名称为SSD-D3000)，其它核苷酸不变，得到的重组载体)、含有SSD-D2800的重组表达载体pGL3-SSD-D2800 (将pGL3_Basic载体的Kpn I和Hind III位点间的片段替换为序列I的第1201-4000位所示的DNA(名称为SSD-D2800)，其它核苷酸不变，得到的重组载体)、含有SSD-D2600的重组表达载体pGL3-SSD-D2600 (将pGL3-Basic载体的Kpn I和Hind III位点间的片段替换为序列I的第1401-4000位所示的DNA(名称为SSD-D2600)，其它核苷酸不变，得到的重组载体)、含有SSD-D2400的重组表达载体PGL3-SSD-D 2400 (将pGL3_Basic载体的Kpn I和Hind III位点间的片段替换为序列I的第1601-4000位所示的DNA(名称为SSD-D2400)，其它核苷酸不变，得到的重组载体)、含有SSD-D2200的重组表达载体pGL3-SSD-D2200 (将pGL3_Basic载体的Kpn I和Hind III位点间的片段替换为序列I的第1801-4000位所示的DNA(名称为SSD-D2200)，其它核苷酸不变，得到的重组载体)、含有SSD-D2000的重组表达载体pGL3-SSD-D2000 (将pGL3-Basic载体的Kpn I和Hind III位点间的片段替换为序列I的第2001-4000位所示的DNA(名称为SSD-D2000)，其它核苷酸不变，得到的重组载体)、含有SSD-D1500的重组表达载体PGL3-SSD-D1500 (将pGL3_Basic载体的Kpn I和Hind III位点间的片段替换为序列I的第2501-4000位所示的DNA(名称为SSD-D1500)，其它核苷酸不变，得到的重组载体)、含有SSD-D1000的重组表达载体pGL3-SSD-D1000 (将pGL3_Basic载体的Kpn I和Hind III位点间的片段替换为序列I的第3001-4000位所示的DNA(名称为SSD-D1000)，其它核苷酸不变，得到的重组载体)、含有SSD-D500的重组表达载体pGL3-SSD-D500(将pGL3-Basic载体的Kpn I和Hind III位点间的片段替换为序列I的第3501-4000位所示的DNA (名称为SSD-D500)，其它核苷酸不变，得到的重组载体)，共10个含截短DNA的重组载体。对10个重组载体均进行Kpn I和Hind III双酶切鉴定及测序鉴定，证实其准确性。其中PGL3-SSD-D2400经Kpn I和Hind III双酶切的鉴定结果如图3所示。将含有这10个重组载体的重组菌，依次命名为DH5 a -pGL3-SSD-D3500、DH5 a -pGL3-SSD_D3000、DH5a -pGL3-SSD-D2800、DH5α-pGL3-SSD_D2600、DH5 α -pGL3-SSD_D2400、DH5α -pGL3-SSD-D2200、DH5α -pGL3-SSD_D2000、DH5α-pGL3-SSD_DI 500、DH5α -pGL3-SSD-D1000、DH5α -pGL3-SSD_D500。
[0083]2、质粒提取与鉴定
[0084]将上述 11 个重组菌 DH5a-pGL3-SSD_D4000、DH5a-pGL3-SSD_D3500、DH5a-pGL3-SSD-D3000、DH5a -pGL3-SSD_D2800、DH5 a -pGL3-SSD_D2600、DH5a-pGL3-SSD-D2400、 DH5a-pGL3-SSD_D2200、 DH5a-pGL3-SSD_D2000、DH5 a -pGL3-SSD-D1500、DH5 a -pGL3-SSD_D1000、DH5 a -pGL3-SSD_D500 分别接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，在37°C条件下，200转/分(旋转半径为13mm)摇床上振荡培养至0D_值为1，采用质粒小提试剂盒抽提重组菌的质粒，即步骤I构建的11个重组表达载体，具体操作参照试剂盒说明书。
[0085]3、细胞培养
[0086]将A549 细胞、LTEP-a-2 细胞、Hela 细胞、Caco-2 细胞、293T 细胞、HepG2 细胞和CNE2细胞这7种受体细胞分别在10% (v/v)新生牛血清的含双抗DMEM(Dulbeccc/ sModified Eagle' s Medium)培养基中，其培养条件为37°C，浓度为5%的C02。当细胞完全铺板时，进行传代培养。操作如下:用洗涤液快速洗涤细胞一次，加入2mL胰酶，37°C消化约为2分钟，在显微镜下观察到细胞已成球状后立即弃去胰酶，向培养基中加入细胞生长培养基，并用吸管吹打细胞使尽量以单个细胞的形式存在。将获得的细胞悬液一部分留在细胞培养瓶中传代培养，另一部分等体积分装到24孔板中，置于培养箱中培养用于转染。
[0087]4、转染
[0088]当24孔板中细胞达到60% -70%的汇合率时准备转染。首先吸去培养液，加入无血清无双抗的optiMEM换液培养。其次将步骤I构建的11个重组表达载体、作为阴性对照的pGL3-Basic载体(没有启动子启动荧光素酶基因的表达)、作为阳性对照的pGL3-Control载体(SV40启动子启动荧光素酶基因的表达)分别用optiMEM稀释成IOOng/μ I，将作为内参照的载体PRL-TK (Τ7启动子启动荧光素酶基因的表达)稀释成50ng/l.! 1，按I μ g质粒需0.75 μ I的lipofectamine2000计算所需的转染试剂的量。按说明书要求用optiMEM稀释lipofectamine2000，轻轻混匀，室温下静置5分钟后将转染试剂和质粒混合均匀，再室温静置20分钟。取转染液100 μ I滴加到24孔板的其中一个孔中，这样每个重组表达载体可保证4次重复。转染过程需在换液后2h内完成。转染完成后放入培养箱中温育，6小时后弃24孔板里液体，PBS清洗一次后加入10% (v/v)新生牛血的无双抗D M E M培养基继续培养，24-48小时后收集细胞，得到含有不同载体的重组细胞。将向A549细胞中导入pGL3-SSD-D4000得到的含有pGL3-SSD_D4000的重组细胞命名为A549-pGL3-SSD-D4000 ;将向 A549 细胞中导入pGL3-SSD_D3500 得到的含有pGL3-SSD_D3500的重组细胞命名为A549-pGL3-SSD-D3500 ;将向A549细胞中导入pGL3-SSD_D3000得到的含有pGL3-SSD-D3000的重组细胞命名为A549-pGL3-SSD_D3000 ；将向A549细胞中导入PGL3-SSD-D2800 得到的含有 pGL3-SSD_D2800 的重组细胞命名为 A549-pGL3-SSD_D2800 ；将向A549细胞中导入pGL3-SSD-D2600得到的含有pGL3-SSD_D2600的重组细胞命名为A549-pGL3-SSD-D2600 ;将向 A549 细胞中导入pGL3-SSD_D2400 得到的含有 pGL3-SSD_D2400的重组细胞命名为A549-pGL3-SSD-D2400 ;将向A549细胞中导入pGL3-SSD_D2200得到的含有pGL3-SSD-D2200的重组细胞命名为A549-pGL3-SSD_D2200 ;将向A549细胞中导入PGL3-SSD-D2000 得到的含有 pGL3-SSD_D2000 的重组细胞命名为 A549-pGL3-SSD_D2000 ；将向A549细胞中导入pGL3-SSD-D 1500得到的含有pGL3_SSD_D 1500的重组细胞命名为A549-pGL3-SSD-D1500 ;将向 A549 细胞中导入pGL3-SSD_D1000 得到的含有 pGL3-SSD_D1000的重组细胞命名为A549-pGL3-SSD-D1000 ；将向A549细胞中导入pGL3-SSD_D500得到的含有PGL3-SSD-D500的重组细胞命名为A549-pGL3-SSD_D500 ;将向A549细胞中导入pGL3-Basic得到的含有pGL3_Basic的重组细胞命名为A549-pGL3_Basic ;将向A549细胞中导入pGL3-Control 得到的含有pGL3_Control的重组细胞命名为A549-pGL3_Control ；向LTEP-a-2细胞中导入pGL3-SSD-D2400得到的含有pGL3-SSD_D2400的重组细胞命名为LTEP-a-2-pGL3-SSD-D2400 ；向 LTEP-a-2 细胞中导入 pGL3_Basic 得到的含有 pGL3_Basic的重组细胞命名为LTEP-a-2-pGL3-Basic ;向Hela细胞中导入pGL3-SSD_D2400得到的含有PGL3-SSD-D2400的重组细胞命名为Hela-pGL3-SSD_D2400 ；向Hela细胞中导入pGL3_Basic得到的含有pGL3_Basic的重组细胞命名为Hela-pGL3_Basic ；向Caco-2细胞中导入pGL3-SSD-D2400得到的含有pGL3-SSD_D2400的重组细胞命名为Caco-2-pGL3-SSD-D2400 ；向 Caco-2 细胞中导入 pGL3_Basic 得到的含有 pGL3_Basic的重组细胞命名为Caco-2-pGL3-Basic ；向293T细胞中导入pGL3-SSD_D2400得到的含有PGL3-SSD-D2400的重组细胞命名为293T-pGL3-SSD_D2400 ；向293T细胞中导入pGL3-Basic得到的含有pGL3_Basic的重组细胞命名为293T-pGL3_Basic ；向HepG2细胞中导入pGL3-SSD-D2400得到的含有pGL3-SSD_D2400的重组细胞命名为HepG2-pGL3-SSD-D2400 ；向 H印G2 细胞中导入 pGL3_Basic 得到的含有 pGL3_Basic 的重组细胞命名为IfepG2-pGL3-Basic ；向CNE2细胞中导入pGL3-SSD_D2400得到的含有pGL3-SSD-D2400的重组细胞命名为CNE2-pGL3-SSD_D2400 ；向CNE2细胞中导入pGL3-Basic得到的含有pGL3_Basic的重组细胞命名为CNE2-pGL3_Basic。[0089]5、荧光素酶相对活性测定与分析
[0090]使用荧光素酶活性检测试剂盒对步骤4转染后的细胞进行活性测定。测定前，准备以下试剂:(1)1X磷酸裂解缓冲液(PLB)，用购自美国Promega公司试剂盒提供的5XPLB与灭菌水按体积比1:4比例混合，每次使用前配置；(2)LARII (LuciferaseAssayReangentII突光分析剂)，将美国Promega公司试剂盒提供的冻干突光分析底物重悬于IOml的LARII中，混匀，分装后做上标记置于_70°C保存备用；(3) Stop Glo Reagent，每次使用前配置，将50 X Stop & Glo Substrate (终止剂)与Stop Glo Buffer (终止缓冲剂)按体积比1:50混合。试剂配置完毕后进行荧光素酶活性测定，操作步骤如下:
[0091]I)将上述24孔板中转染有目的DNA的贴壁细胞用I XPBS洗涤一次，弃去残液，加入100 μ I新鲜配制的1XPLB，室温下，置于冰上15分钟，然后_80°C冻融一次；
[0092]2)用移液器吹吸两次后将裂解液收集到1.5ml离心管做好标记，待用；
[0093]3)取若干个1.5ml离心管，均加入50 μ I的LLARII溶液(_70°C取出，室温下融化)，备用；
[0094]打开Luminometer20/20照度计(购自美国Promega公司)电源开关,进入“HOME”主菜单，按下“Protocol”设定工作模式中各种参数，包括:Display显示，3S !integratetime (整合时间)IOS ；repeat (重复);灵敏度选用默认值；设定好后返回“HOME” ；
[0095]4)在“HOME”状态下，在含50 μ I LARII溶液的1.5mL离心管中加入上述步骤2)制备好的样品?ομL，用吸头混合后，放入样品检测池中，按“Measure”，仪器自动处理，计算出萤火虫荧光酶素(11个重组表达载体、阴性对照pGL3-Basic载体以及阳性对照pGL3-Control载体中的突光素酶基因表达)活力，显示加入Stop & GloSubstrate页面,此时取出1.5mL离心管，再加入50 μ I新鲜配置的Stop Glo Reagent，混匀后，放回样品检测池中，按“0K”仪器便会现计算出海肾荧光素酶活力(内参照载体PRL-TK中的荧光素酶基因所表达)，并计算出两种荧光素酶活力比值，即荧光素酶相对活力，记录结果，然后，绘制直方图。
[0096]荧光素酶活性的检测结果如图4所示。A549-pGL3-SSD-D4000、A549-pGL3-SSD-D3500、A549-pGL3-SSD_D3000、A549-pGL3-SSD_D2800、A549-pGL3-SSD-D2600和A549-pGL3-SSD_D2400这6个重组细胞的荧光素酶活性与阴性对照(A549-pGL3-Basic)相比均达到显著差异(P < 0.05)，表明SSD-D4000、SSD-D3500、SSD-D3000、SSD-D2800、SSD-D2600 和 SSD-D2400 均具有启动子活性；与阳性对照(A549-pGL3-Control)相比，A549-pGL3-SSD_D4000、A549-pGL3-SSD_D3500、A549-pGL3-SSD-D3000、A549-pGL3-SSD_D2800、A549-pGL3-SSD_D2600 和A549-pGL3-SSD-D2400这6个重组细胞的荧光素酶活性高很多或者至少齐平，表明SD-D4000、SSD-D3500、SSD-D3000、SSD-D2800、SSD-D2600 和 SSD-D2400 的启动子活性很高。其中，A549-pGL3-SSD-D2200、A549-pGL3-SSD-D2000、A549-pGL3-SSD-D1500、A549-pGL3-SSD-D1000和A549-pGL3-SSD_D500的均没有荧光素酶活性。上述实验结果表明SSD-D启动子的核心区在SSD-D2400(序列I的第1601-4000位)区域。
[0097]向A549 细胞、LTEP-a-2 细胞、Hela 细胞、Caco-2 细胞、293T 细胞、HepG2 细胞和CNE2细胞这7种受体细胞导入pGL3-SSD-D2400得到的重组细胞的荧光素酶活性检测结果表明，与相应的阴性对照相比，只有向A549细胞、LTEP-a-2细胞和CNE2细胞导入PGL3-SSD-D2400得到的三种重组细胞均具有荧光素酶活性，向A549细胞导入PGL3-SSD-D2400得到的重组细胞(名称为A549-pGL3-SSD_D2400)的荧光素酶活性是向A549细胞导入pGL3-Basic得到的重组细胞(名称为A549-pGL3_Basic)的荧光素酶活性的190倍，向LTEP-a-2细胞导入pGL3-SSD_D2400得到的重组细胞(名称为LTEP-a-2-pGL3-SSD-D2400)的荧光素酶活性是向LTEP-a-2细胞导入pGL3_Basic得到的重组细胞(名称为LTEP-a-2-pGL3-Basic)的荧光素酶活性的200倍，向CNE2细胞导入PGL3-SSD-D2400得到的重组细胞(名称为CNE2-pGL3-SSD_D2400)的荧光素酶活性是向CNE2细胞导入pGL3-Basic得到的重组细胞(名称为CNE2-pGL3-Basic)的荧光素酶活性的5倍。证明了 SSD-D2400只在肺(A549细胞和LTEP-a-2细胞)来源的细胞中具有启动子活性， 表明了该启动子是肺组织特异启动子，结果如图5所示。
【权利要求】
1.DNA分子，是下述a)或b)或C)的DNA片段: a)3'端至少含有序列表中序列I的第1601-4000位核苷酸序列，并且从序列I的第1601位开始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延长，得到长度为2400至4000bp的任意一个DNA片段；所述DNA分子具有启动子功能； b)与a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且具有启动子功能的DNA片段； c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子的最后一位核苷酸是序列I的第4000位。
3.根据权利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子是下述Al)-A4)中的任一种DNA片段: Al)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第1401-4000位核苷酸序列，并且从序列I的第1401位开始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延长，得到长度为2600至4000bp的任意一个DNA片段； A2)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第1201-4000位核苷酸序列，并且从序列I的第1201位开始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延长，得到长度为2800至4000bp的任意一个DNA片段； A3)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第1001-4000位核苷酸序列，并且从序列I的第1001位开始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延长，得到长度为3000至4000bp的任意一个DNA片段； A4)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第501-4000位核苷酸序列，并且从序列I的第501位开始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延长，得到长度为3500至4000bp的任意一个DNA片段。
4.根据权利要求1-3中任一所述的DNA分子，其特征在于:3'端至少含有序列I的第1401-4000位、按照序列I的核苷酸序列向5'端延长得到长度为2600至2800bp的任意一个DNA片段。
5.根据权利要求1-4中任一所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子为下述I)-6)中任意一种: 1)核苷酸序列为序列表中序列I的第1401-4000位核苷酸所示的DNA分子； 2)核苷酸序列为序列表中序列I的第1201-4000位核苷酸所示的DNA分子； 3)核苷酸序列为序列表中序列I的第1001-4000位核苷酸所示的DNA分子； 4)核苷酸序列为序列表中序列I的第1601-4000位核苷酸所示的DNA分子； 5)核苷酸序列为序列表中序列I的第501-4000位核苷酸所示的DNA分子； 6)核苷酸序列为序列表中序列I的第1-4000位核苷酸所示的DNA分子。
6.含有权利要求1-5中任一所述DNA分子的遗传材料为下述BI)至B19)中的任一种: BI)含有权利要求1-5中任一所述DNA分子的表达盒； B2)含有权利要求1-5中任一所述DNA分子的重组载体； B3)含有BI)所述表达盒的重组载体； B4)含有权利要求1-5中任一所述DNA分子的重组微生物；B5)含有BI)所述表达盒的重组微生物；B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有权利要求1-5中任一所述DNA分子的转基因动物细胞系；B9)含有BI)所述表达盒的转基因动物细胞系；BlO)含有B2)所述重组载体的转基因动物细胞系；Bll)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；B12)含有权利要求1-5中任一所述DNA分子的转基因动物组织；B13)含有BI)所述表达盒的转基因动物组织；B14)含有B2)所述重组载体的转基因动物组织；B15)含有B3)所述重组载体的转基因动物组织； B16)含有权利要求1-5中任一所述DNA分子的转基因动物器官；B17)含有BI)所述表达盒的转基因动物器官；B18)含有B2)所述重组载体的转基因动物器官；B19)含有B3)所述重组载体的转基因动物器官。
7.权利要求1-5中任一所述DNA分子作为启动子的应用。
8.权利要求1-5中任一所述DNA分子在动物中启动目的基因表达中的应用。
9.根据权利要求8所述的DNA分子，其特征在于:所述表达为呼吸道细胞特异表达。
10.权利要求1-5中任一所述DNA分子在培育转基因动物中的应用。
【文档编号】C12N15/63GK103952411SQ201410183466
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】刘文军, 杨利敏, 李晶, 李芸, 梁希 申请人:中国科学院微生物研究所